Name: ワクチン接種後のモルモット モデル メジャー T 細胞反応に最適化されたインターフェロン-γ しなさいアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 学ぶモルモットのインターフェロン-γ ELISpotアッセイによるT細胞応答測定法。末梢血からPBMCを分離し、ワクチン接種後の免疫応答の定量的・動的解析が可能。結核やエボラなどの感染症研究に有用です。

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Inovio 医薬品 R & D 部門のテクニカル サポートのメンバーと Acculab の卓越した飼育サービスを提供するためのスタッフに感謝したいと思います。特にアリーシャレイン Vu とジョー アグネスの原稿の校正をありがとうしたいと思います。この作品は、公共、商業、または非営利セクターの資金調達機関から任意の特定の助成金によって賄われていたないです。

ここで説明したすべてのメソッドは、動物のケアおよび使用委員会 (ACUC) の Acculab によって承認されています。
注: プロトコルは、潜在的な有害物質の使用を必要とします。メーカーの MSDS を参照してください、手順適切な個人用具 (PPE) を着用してください。
1. 皮のツベルクリン注射、CELLECTRA 3 P EP プロシージャ モルモット予防接種サイトの準備
<ol><li>
モルモットに治療部位の準備。
	<ol>
<li>誘導室でモルモットを置き、5% で anaesthetize イソフルラン蒸気。</li>
		<li>商工会議所から動物を削除し、プロシージャ全体で麻酔を維持するために 2% イソフルラン蒸気を提供する位置に鼻の円錐形を配置します。</li>
		<li>腹部の側面に約 4 cm2の領域を剃る。</li>
		<li>消毒エタノール綿棒と剃毛エリア。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PDNA 定式化とエレクトロポレーションのプロシージャの注入。
	<ol>
<li>ツベルクリンによる真皮に 100 μ l の製剤を注入するのにインスリン注射を使用します。針の挿入を動物の体内に 10 度の角度で傾斜します。</li>
		<li>針を除去しすぐに注入膨疹の間で CELLECTRA®-3 P の電極を挿入し、電気フィールドを適用します。</li>
		<li>麻酔から動物を削除し、その回復を監視します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 非終端を出血します。
<ol><li>
麻酔モルモットの頸静脈から採血。
	<ol>
<li>誘導室でモルモットを置き、1.1.1 で説明されているように、動物を anaesthetize</li>
		<li>27 1/2 インチ針付き 3 ml シリンジを使用して、麻酔動物の内頚静脈を強調し、3 ミリリットルの血液を収集します。</li>
		<li>K2EDTA 採血管に血液をすぐに転送、ミックス血液抗凝固剤と氷の上の場所に複数回チューブを反転します。 注: 血液凝固の防止、血液サンプルのダウン ストリーム処理に成功したことが欠かせません。</li>
		<li>動物の回復を監視します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 血液サンプル処理
<ol><li>
密度勾配の遠心分離によって血中から PBMCs の分離
	<ol>
<li>1:1 でハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) 血液を希釈します。 注: 安全キャビネットの無菌技術を適用することでここから働くすべての汚染を避けるためを実行する必要があります。</li>
		<li>層は、血液徐々 に 4.5 ml Ficoll Paque プラス 15 ml コニカル チューブを希釈しました。インターフェイスの障害を避けてください。注: 適切な分離を確保するため Ficoll Paque は室温である必要があります。</li>
		<li>ブレーキ付け 30 分 800 メーカでチューブを遠心分離機、オフ。 注: 代わりに、SepMate™ チューブ (幹細胞技術) は PBMC 分離に使用できます。HBSS 希釈血液が 15 ml SepMate チューブ 3.5 ml に追加されます Ficoll Paque プラス 10 分 (ブレーキ) 1200 rcf の遠心しと。この時間節約勾配遠心法は、等しい生存率、細胞収量およびスポット形成の結果します。</li>
		<li>バフィー コート層を収穫し、R10 培地で希釈 (10% (v/v) 熱-無効に FBS と 1% (v/v) ペン/連鎖球菌 RPMI1640 培地で) 15 ml の容量に。</li>
		<li>5 分の 450 rcf の遠心分離によって細胞をペレットします。</li>
		<li>R10 の中で 2 回細胞を洗浄します。</li>
		<li>再 1 ml R10 を中断し、で 70 μ m セル ストレーナーを介して細胞懸濁液を新しいチューブに渡します。</li>
		<li>セルをカウントし、トリパン ブルー染色により生きているセルの数を決定します。</li>
		<li>1 x 10 の濃度に R10 培地で細胞を希釈 ^ ml あたり 6 生きているセル。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4 作成しなさいプレートと細胞刺激
<ol><li>
コートとブロックの井戸、PBMCs を播種する前に 96 ウェルしなさい PVDF 膜プレート。
	<ol>
<li>プレートは、60 秒の前処理する必要があります。エタノール前処理は、あまり不特定のスポット形成と改良された定義のスポットになります。 : 注意完全な膜が 15 μ l の 35% と接触するように余分な注意エタノール。</li>
		<li>60 秒後、好評につき、150 μ l 1 × PBS を追加し、プレートを反転で井戸を空します。 注: エタノール前処理は非常に時間に敏感です。以上 60 秒膜する必要があります手順の次の手順の間に乾燥しても膜を孵化しないで。</li>
		<li>ウェルあたり 3 回 250 μ l 1 × PBS でプレートを洗います。</li>
		<li>PBS の IFN-γ 抗体 V E4 5 μ g/ml のキャプチャ抗モルモットの 100 μ l/ウェルでコートします。</li>
		<li>少なくとも 12 の版を孵化させなさい 4 ° C での時間</li>
		<li>3 倍の 250 μ l/ウェル PBS を追加することでプレートを洗います。</li>
		<li>200 μ l/ウェル ブロック バッファー (10% (w/v) ショ糖と 2% (w/v) BSA PBS で) を追加し、室温で 2 時間インキュベートします。</li>
		<li>250 μ l/ウェル PBS でプレートを 3 回洗浄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
抗原特異的ペプチド、正と負のコントロール プレート PBMCs。
	<ol>
<li>R10 でタンパク質-ペプチド プール目的最終的なペプチド濃度を薄くしなさい。</li>
		<li>トリプリケートでサンプル PBMCs の試金します。 注: 最初にしなさい板中、覚醒剤を追加、PBMC サスペンションを 2 番目に追加。</li>
		<li>示されている井戸にペプチド R10 媒体の 50 μ l を追加します。</li>
		<li>陰性対照の示された井戸に R10 で 50 μ l 空ペプチド製剤を追加します。</li>
		<li>肯定的な制御 R10 中示されている井戸に 5 μ g/ml コンカナバリン A (ConA) を追加します。</li>
		<li>すべての井戸に PBMC 細胞懸濁液 100 μ l を追加します。</li>
		<li>18 37 ° 摂氏加湿 5 %co2 雰囲気の中で板をインキュベート時間。 注: 場所しなさいインキュベーターでも表面/ラックのプレートし、プレートの培養時間の間に任意の妨害を避けるため。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. インターフェロン-γ 肯定的なスポットの検出
<ol><li>
検出抗体とプレートの開発と孵化します。 注: このセクションのすべての手順の無菌技術は必要ありません。
	<ol>
<li>インキュベーターからプレートを慎重に取り外し、安全に空の井戸。3 倍の 250 μ l/ウェル PBS を追加することでプレートを洗います。</li>
		<li>ブロック バッファーに 2 μ g/ml ビオチン検出抗モルモット IFN-γ 抗体の N G3 希釈 100 μ l/ウェルを追加します。 注: フィルターは (22 μ m) 背景を抑える抗体溶解液。</li>
		<li>2 の検出の抗体とインキュベート時間室温で。</li>
		<li>上澄みと洗濯板を破棄するには、追加の 250 μ l/ウェル PBS 3 回。</li>
		<li>アルカリホスファターゼ (ALP) の 100 μ l/ウェルを追加-共役ストレプトアビジン ブロック バッファーで希釈しました。 注: バック グラウンドを抑えるフィルター (22 μ m) ソリューション。</li>
		<li>ALP ストレプトアビジン共役、室温で 1 時間インキュベートします。</li>
		<li>ALP ストレプトアビジン ソリューションを破棄し 250 μ l/ウェル PBS を 2 回追加することによってプレートを洗浄し、プレートを反転ときれいなペーパー タオルに対してそれをしみが付くことによって余分な PBS を除去します。</li>
		<li>1 回 250 μ l/ウェル超純水・ ディ ・水を追加することでプレートを洗浄し、プレートを反転ときれいなペーパー タオルに対してそれをしみが付くことによって余分な水分を削除します。</li>
		<li>各ウェルに 100 μ l の BCIP/NBT (注意) 基板ソリューションを追加します。注意: BCIP/NBT は非常に可燃性で、皮膚との接触、飲み込んだ場合は吸入毒性です。使用前に MSDS を参照してください。</li>
		<li>光から保護された室温で 20 分間インキュベートします。</li>
		<li>脱イオン水で 4 回プレートをすすいでください。プレートを反転し、余分な水分を削除するをタップします。</li>
		<li>プラスチック排水をしなさい板の下部から外し、乾燥するプレートを許可します。</li>
		<li>手動または自動化しなさいリーダー、CTL Immunospot S6 プレート リーダーなどを使用してスポットを定量化します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Laddy, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterosubtypic+protection+against+pathogenic+human+and+avian+influenza+viruses+via+in+vivo+electroporation+of+synthetic+consensus+DNA+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Heterosubtypic protection against pathogenic human and avian influenza viruses via in vivo electroporation of synthetic consensus DNA antigens.</a> PloS One. 3 (6), 2517(2008).</li>
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<li>Schultheis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+guinea+pig+T+cell+responses+elicited+after+EP-assisted+delivery+of+DNA+vaccines+to+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Characterization of guinea pig T cell responses elicited after EP-assisted delivery of DNA vaccines to the skin.</a> Vaccine. 35 (1), 61-70 (2017).</li>
<li>Mantoux Tuberculin Skin Test DVD Facilitator Guide - CDC (Part One). , Available from: 
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<li>Schaefer, H., Kliem, G., Kropp, B., Burger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+to+guinea+pig+interferon-gamma%3A+tools+for+cytokine+detection+and+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies to guinea pig interferon-gamma: tools for cytokine detection and neutralization.</a> Journal of Immunological Methods. 328 (1-2), 106-117 (2007).</li>
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</ol>

作者の Inovio 製薬のキャサリン ・ シュルタイス、ホリー ・ m ・ ピュー、ブライアン s. ヨン、ジャネットああ、ホリー ・ m ・ ピュー、Jacklyn グエン、ローラン Humeau、ケイト E. ブロデリックとトレバー高周波 Smithare の従業員給与と福利厚生の所有権を含むが表示されるよう、株式やストック ・ オプション、会社から。

モルモットは、ワクチンや皮内配信戦略の前臨床開発の貴重な動物モデルです。上記のプロトコルでは、このモデルで関連性の高い抗原特異的 T 細胞の反応を測定するための方法について説明します。アッセイは、末梢 T 細胞生産インターフェロン-γ 刺激による抗原特異的ペプチドとの明確な列挙体を提供します。非端末採血による免疫応答の動態を監視できます。
プロトコルを最適化し、この試金を使用して最適な結果を得るための重要な側面を識別します。たとえば、コレクションの管の血栓の形成は、次善の PBMC の回復と生存率になります。モルモット血液が凝固18を非常に急速に。絵を描く血を迅速に実行することが重要です。Au Birckらはモルモット モデル16の技術を出血の包括的なガイドを提供します。血のコレクションは、全身麻酔を必要とするので、手順19のこの側面の該当する標準操作手順を確認することをお勧めします。麻酔が不十分なモルモットは、あなたの爪や耳を尻込みしてひげが彼らの耳をつまんで後転送移動指の間、足や組織の簡単なピンチ後の発声を移動することによって反応します。圧延または数回チューブの反転によって徹底的に抗凝固薬とミックス チューブに血液の即時転送は、このプロトコルの重要なステップです。ここで説明されているプロトコルの EDTA 管が使用され、他の抗凝固薬はテストされていません。EDTA は高張、チューブ必要があります理想的にはいっぱいに半分以上、したがって適切なチューブ サイズ サンプル ボリュームを使用する必要がありますに注意してください。
正しく実行されると、密度勾配遠心法は一貫してクリーン PBMC 準備の結果します。遠心分離の前にグラデーションを重ねるとき、密度勾配媒体が室温である必要があります、通常の管を使用する場合、遠心分離機を停止して、ブレーキを使用しないでください。PBMC 処理の実用性の面で大幅な改善は、密度勾配遠心 PBMC 免震装置の組み合わせだった。遠心分離の時間を短縮をできます。密度勾配遠心法 PBMC 免震装置で、通常の管と同様の生存率の結果加工 PBMCs とスポット形成の生きているセルをカウントします。分離用チューブの種類にかかわらず、バフィー コート収穫はすぐに従う必要があります。拡張期間にわたって密度勾配媒体との接触は、PBMCs を細胞傷害性です。
実行可能な PBMCs の正確なカウント種子アッセイ プレートのウェルに細胞数が一貫して同じことが重要です。ライブ/デッド差別のいくつかのメソッドを適用する必要があります。当研究室では、トリパン ブルー排除アッセイ、自動化された細胞カウンターを使用します。
特に自動カウント システムを使用する場合鋭利と対照的なスポットとして定義されているスポットの品質は改善された正確さと一貫性のあるスポット カウントになります。製造元の推奨事項に沿った背景スポットの数を減らすし、スポットの定義を改善する重要なステップをしなさい板のエタノール前処理を見ました。プロトコルの終わりにしなさいアッセイ プレートのイメージをプレート リーダーを使用することを強くお勧めします。各ウェルの元の画像を簡単かつ効率的に入手し、保存します。デジタル画像はまた客観的な分析と個々 のオペレーターによって手動カウントと比較してください。 スポット カウント、画像解析ソフトを使用してください。
ここで説明した試金の開発のための絶対的な必要性の適切な抗モルモット インターフェロン-γ 抗体ペアの世代でした。V E4 と N G3 マウス モノクローナル抗体は、モルモットの組換えインターフェロン ガンマ20で免疫したマウスから B 細胞クローンとハイブリドーマ技術によって開発されました。V-E4、IgG1 アイソタイプであると N-G3、igg2a 産、遺伝子組換えとネイティブ抗原の両方にバインドする報告されます。サンドイッチ elisa 法形式で低バック グラウンド信号を維持しながら検出の抗体遺伝子組換えとネイティブ蛋白質の高感度としてキャプチャ抗体、ビオチン化 N G3 V E4 を割り当てます。本書の共著者である博士ヒューバート ・ シェーファーの研究所を率いる製造契約を通じて科学的なコミュニティに両方の抗体があります。要求はシェーファー博士の研究室で受信して、商業パートナー製。
インターフェロン γ は、通常のバッファーまたはメディア21で安定する報告されます。シェーファーら20だけ回収率の適度な減少を報告は、使用劣化 IFN-y、抗体 V E4 と N G3 を使用して ELISA 形式での生物学的機能を失っていたとき。ただし、ペプチド刺激 PBMCs の 18 h 以上のインキュベーション時間を増やす必要があります慎重にテストします。
PBMCs を使用する利点を議論されています。ただし、ここで説明されているアッセイのみ循環周囲に T 細胞の抗原特異的応答を反映します。組織浸潤 T 細胞または脾臓やリンパ節などのリンパ系器官から分離した細胞は、異なるプロパティ22,23,24を表わすかもしれない。PBMCs からインターフェロン-γ スポットと同じ pNP インフルエンザ ワクチン14免疫モルモットからの脾細胞の比較細胞応答に有意差は認められなかった。
このプロトコルでは、皮内ワクチン接種手順について説明しました。ID 予防接種の主たる根拠は、樹状細胞皮膚25本の高密度を狙っています。私たちと他の人は、これらの細胞は配信方法26、定式化27、または薬物設計28を適応させることによって特に対象と示されています。活性化のプロフェッショナルな抗原提示細胞が排出リンパ節に移行し、適応免疫系29,30,31,32をアクティブにします。樹状細胞は、生産的な細胞性免疫応答をプライミングのため不可欠な抗原プレゼンテーションの携帯タイプです。
プラスミド DNA エンコード インフルエンザ H1N1 の蛋白で免疫動物本研究 A/PuertoRico/8 のひずみ。皮膚エレクトロポレーション法との組み合わせで (pNP) この pDNA ワクチンの配信は、ヒト以外の霊長類 (NHPs)1,34フェレット、モルモット33抗原特異的体液性応答を引き出すために示されていた。また、このワクチンは、CD4 および CD8 T 細胞にこれらの細胞集団の特定のエピトープを表すペプチドで刺激することによって起因する可能性表皮35に、搬入後マウスで堅牢な T 細胞応答を引き出した。PNP のワクチンはマウス36細胞・体液性応答と同様に、ウサギやモルモット、体液性応答の生成によって示されるように粘膜出産後免疫原性もあった。最も最近、当社グループ内の筋肉配信 (未発表データ) ウサギの IFN-γT-細胞応答の生成を示すことでした。
現在、モルモットしなさい観察されるインターフェロン-γ スポットは cd4 や cd8 T 細胞サブセットに割り当てられません。デザイン、皮膚免疫療法の開発の特にインターフェロン γ 観測スポット周波数が 1 つの特定のサブセットの拡張またはするために両方のバランスの取れた応答によって引き起こされるかどうかを決定する非常に役に立つことクロス プレゼンテーションをトリガーするワクチン接種の有効性を評価します。この制限は、負によって克服される可能性があります (cd8 陽性反応) のため私はエピトープを制限 (cd4 陽性反応) の MHC クラス II MHC のクラスの識別、皿の上の細胞を播種する前に CD4 や CD8 細胞の並べ替え。
モルモット PBMCs を使用してここで説明しなさいインターフェロン-γ アッセイ モルモット実験室モデルの細胞反応のコースを評価するニーズに応えます。これはワクチンの開発を調整し、配信プロトコルを皮膚します。TB37、エボラ出血熱38HSV39など重要な T 細胞コンポーネントとの病気を研究するこの動物モデルの雇用のことと考えています。それは関連性の低い動物モデルの使用を削減します。

ここで説明したプロトコル インターフェロン-γ の検出が可能でモルモットから採取した末梢血単核球 (PBMC) 人口の抗原リコール後 (IFN γ) 分泌細胞。我々 はモルモットでインフルエンザの予防接種療法に対する抗原特異的 T 細胞応答の大きさと速度を特徴付けるアッセイを適用しています。このプロトコルは、この関連性の高い動物モデルでのワクチン接種プログラムの前臨床開発を推進する大幅と考えています。
ワクチンによって誘発される T 細胞は、感染性病原体やその他の病気と関連付けられる免疫療法経路に対する保護に重要な役割を果たします。T 細胞の重要性は、複数のワクチンの研究で強調表示されています。フェレットと H5 ヘマグルチニンと N1 ノイラミニダーゼを提供保護の罹患率と死亡率の重要性を示す抗体を中和することの不在でインフルエンザ ウイルス チャレンジからのエンコーディングとプラスミド DNA (pDNA) マウスの免疫T 細胞免疫1。このほかに強い体液性応答を中和 T 細胞再生ウイルスクリアランス2だけでなく、呼吸器合胞体ウイルス (RSV) と感染症からの保護に重要な役割でマウス3。人間、2009 年4パンデミック H1N1 は、中には既存の cd 8 + T 細胞が減少疾患重症度と関連付けられました。一緒に特定のサイトカインの血中の cd4 陽性 T 細胞数は、RSV に感染した小児5疾患重症度に関連付けられます。
モルモット皮膚感作性、栄養研究、聴覚系のと、この作品では、感染症に最も関連する研究など医学の様々 な分野で開発の実験的モデルとしての卓越性を得ています。結核、ジフテリア ワクチンの発見のために重要だった。最近では、モルモットはインフルエンザ6エボラ7モデルとして使用されます。さらに、人間の皮膚8生理学的類似点をもつ、モルモットは経皮薬物送達方法のアクセス可能な小さな動物モデルを提供しています。実験的モデルとしてその重要性と対照をなしてモルモット特定試金および免疫反応を特徴付けるためのプローブの可用性限定9のままです。など、IFN-γ 酵素 immunospot (しなさい試金) 日常的に T 細胞の応答を列挙する前臨床試験と臨床研究で使用されている基本的な細胞アッセイは利用されていません。
最初の固相酵素 immunospot のアッセイは、多様な B 細胞人口10,11特定抗体産生細胞の数を決定する使用されました。形式は IL-1, IL-2, を含むサイトカインを分泌細胞を検出する高度な IL 4、IL-5、IL-6、IL-10、GM-CSF、TNF-α、TNF β、グランザイム B、IFN-γ。なさいアッセイを所有している高感度。可能性のある各サイトカイン産生細胞を検出できます。なさい試金のための検出限界は、100,000 の PBMCs12あたり 10 点より低いと報告されています。利用可能な13モルモットの IFN-γ 抗体ペアは最近行われた、これはフィールドのこの欠乏に対処するための機会を開いた。
適応免疫応答に重要なエフェクター分子である IFN-γそれは、生産し、活性化 CD4 および CD8 T 細胞によって分泌されることがことができます。IFN-γ が広い生物の範囲が私と MHCII 式 (MHC) マクロファージの活性化と主要な組織適合性の複雑なの規制などのウイルス感染に対する免疫応答のコンテキストで機能します。また、B 細胞の分化を促進する、T ヘルパー 2 細胞の成長を阻害する、ナチュラル キラー細胞を活性化します。インターフェロン-γ は、感染細胞の MHC 分子の upregulates 発現ウイルス複製をブロックします。したがって、IFN-γ の生産は、ワクチンや病原体に対する T 細胞応答の質の非常に重要な徴候です。
ここで提示された IFN-γ しなさいの重要な側面は、脾細胞よりもむしろ PBMCs の13の使用です。PBMCs は脾細胞のコレクションは、脾臓の収穫前に動物 euthanization を必要とするのに対し非終端収集した血液サンプルを処理することによって得られます。PBMCs 時間帯とプライム ブースト レジメン14など T 細胞応答に及ぼす影響の評価を監視する IFN-γ T 細胞応答を使用します。
現在、モデル動物としてモルモットを使用している研究者、IFN-γ しなさい方法は積むことができる科学的なデータの範囲を広げます。その可用性は今細胞応答の検査のための試薬の可用性のため以前に選ばれた対象疾患の関連性の低い動物モデルでの研究を実施する必要性を減らすことができます。脾臓やリンパ節ではなく、PBMCs の使用できます非ターミナル実験と個々 の動物の継続的な監視します。
以下 pDNA ワクチンに対するモルモットにおける IFN γ 細胞反応の検出に必要な手順の詳細な説明を提供します。私たちの特定の配信手順の概要を説明し、採血、血液処理、PBMC の収穫、試金プロシージャおよびデータ解析を含む一般的なしなさい試金を記述します。なさい測定の模式図は、図 1に描かれています。
<img alt="PBMC分離ワークフロー図。採血、細胞プレーティング、抗原刺激、アッセイ結果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58595/58595fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図 1: モルモットしなさいプロトコルの概要。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58595/58595fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td>Cellectra-3P</td><td>Inovio Pharmaceuticals</td><td></td><td>ID-Electroporatioデバイス/非商用、R&D専用</td></tr><tr><td>K2EDTA採血チューブ</td><td>BD</td><td>367844</td><td></td></tr><tr><td>ハンク'S Balanced Salt Solution</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>14175-079</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthacre&nbsp;</td><td>17144003</td><td>密度勾配媒体</td></tr><tr><td>SepMateチューブ</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85415</td><td>PBMC分離装置</td></tr><tr><td>RPMI&nbsp;</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー11875-135</td><td></td></tr><tr><td>熱不活性化FBS&nbsp;</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>ペン/溶連菌&nbsp;</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&beta;-メルカプトエタノール</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>96ウェルELISpot PVDFメンブレン&nbsp;</td><td>ミリポア</td><td>MSIPS4W10</td><td>ELISpot アッセイプレート</td></tr><tr><td>エタノール&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>459844-1L</td><td></td></tr><tr><td>UPDI</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td>超純純</td></tr><tr><td></td><td>シグマ</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30378.03</td><td></td></tr><tr><td>コンカナバリン A (ConA)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C5275-5MG</td><td></td></tr><tr><td>アルカリホスファターゼ (ALP) 共役ストレプトアビジン&nbsp;</td><td>R&株式会社Dシステムズ&nbsp;</td><td>セル002</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT&nbsp;</td><td>R&株式会社Dシステムズ&nbsp;</td><td>SEL002</td><td></td></tr><tr><td>捕獲抗モルモット IFN-&γ; 抗体 V-E4</td><td>GenScript</td><td>Order #:U5472CE080-3</td><td>LOT # A217071153</td></tr><tr><td>ビオチン化検出 抗モルモット IFN-&γ; 抗体 N-G3&nbsp;</td><td>GenScript</td><td>Order #:U5472CE080-1</td><td>LOT # A21700598</td></tr><tr><td>CTL S6 Micro Analyzer</td><td>ImmunoSpot</td> <td>#S6MIC12</td><td>自動 ELISpot プレートリーダー</td></tr><tr><td>Vi-CELL XR</td><td>Beckman-Coulter</td><td>731050</td><td>自動セルカウンター</td></tr><tr><td>ImmunoSpot 5.1</td><td>ImmunoSpot</td><td></td><td>アッセイ分析ソフトウェア</td></tr><tr><td>ESCO Class II Type A2</td><td>ESCO</td><td></td><td>Biosafety cabinet</td></tr><tr><td>ファルコンセルストレーナー</td><td>Corning, Inc.</td><td>VWR cat# 21008-952</td><td></td></tr><tr><td>エクセル コンフォート ポイント インスリン シリンジ</td><td>MedLab Supply&nbsp;</td><td>26028</td><td></td></tr><tr><td>Rotanta 460R</td><td>Hettich</td><td></td><td>遠心分離機</td></tr><tr><td>Vi-CELL XRクワッドパック試薬キット</td><td>ベックマンコールター</td><td>383722</td><td></td></tr><tr><td>インキュセーフ</td><td>パナソニックヘルスケア</td><td></td><td>インキュベータ</td></tr><tr><td>ー22&micro;m フィルター</td><td>ThermoScientific&nbsp;</td><td>VWR法#597-4520</td><td>22 &micro;m フィルター</td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>Kimberly-Clark Professional&nbsp;</td><td>VWRカタログ#21903-005&nbsp;</td><td>ペーパータオル</td></tr></tbody></table>

ワクチン接種後のモルモット モデル メジャー t 細胞反応に最適化されたインターフェロン-γ しなさいアッセイ

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

モルモットは、結核、インフルエンザ、ジフテリア、およびウイルスの出血熱などの感染症のためのワクチンの開発に関連する小さな動物モデルとして極めて重要な役割を果たしました。皮膚にプラスミド DNA (pDNA) ワクチンの配信がモルモットの堅牢な体液性応答を誘発しました。ただし、このモデル免疫動物の使用幾分使用可能な試薬および T 細胞の反応を研究するためのプロトコルの不足のため過去に限られていた。T 細胞は、immunoprophylactic と免疫療法のメカニズムの両方で極めて重要な役割を果たします。T 細胞の反応を理解することは、感染症・腫瘍ワクチン収容配信デバイスの開発にとって重要です。ここギニア豚末梢血単核球 (PBMCs) ためインターフェロン γ (IFN-γ) の酵素 immunospot (しなさい) 試金を記述します。アッセイこの重要な齧歯動物モデルでワクチン特定の T 細胞の応答を評価することも可能。 にします。末梢血から分離した細胞を分析する能力は、個々 の動物で免疫原性を追跡する機会を提供します。

ここで示された結果は、期待される成果が次の重要なステップの重要性を強調し、説明の最適化の利点を確認するには、このプロトコルの使用への参照として機能します。
密度勾配遠心分離後プロトコルの 3.1 の手順で説明するよう、管の下部に赤い粘性液体にも赤色の血液細胞のほとんどが含まれます。図 2に示すように、A赤の血液細胞上の層である密度媒体。透明または黄色プラズマの上部の層と密度勾配媒体、白血球と血小板のほとんどが含まれている白または茶色のバフィー コート層です。不完全な分離は、赤血球密度勾配媒体上の存在としてマニフェスト。図 2Aでプラズマの赤の発色は、この血液サンプルが処理される前にコレクション チューブ 1.5 h に格納されているため溶血、おそらくです。図 2(左) 前にグラデーションをBに示しますと PBMC 免震装置 (右) 遠心後。図 2Bの血液サンプルは、血のコレクション、およびプラズマの発色が黄色、最小限の遅延で処理でした。
前ぬれエタノールと膜の効果 (プロトコルの手順 4.1 を参照) のスポット開発を図 3に示します。前処理の井戸のスポット表示改善された定義と媒体/DMSO ネガティブ コントロール井戸 (図 3A) のスポットの数の減少があります。処理されたモルモット PBMCs の一般的な生存率は、90% のまわりの範囲、通常 15 mL チューブの PBMC 免震装置 (図 3B) 似ています。3 mL の血液サンプルから細胞通常 3 x 10 の6と 5 x 106間の範囲します。
プラスミド DNA の H1N1 インフルエンザの蛋白 (NP) のエンコードで免疫動物 A/PuertoRico8。図 4に示す発表した T 細胞の IFN-γ 応答の列挙としてスポット形成単位 (SFU) ワクチン療法の期間全体を生成します。PBMCs 無視スポット カウント (tx なし) で非免疫動物の結果から収穫との試金しなさい。最初の予防接種 (首相) 後、14 日百万 PBMCs あたり 970 の IFN-γ 点の平均は、免疫刺激後数えられました。すべての 3 つのプールに対する T 細胞応答で拡大された 2 回目の予防接種 (ブースト) 後 7 日、46 日後 2 回目の予防接種 (メモリ) 6310 IFN-γ Sfu/10 の平均の合計の 5020 IFN-γ Sfu/106 PBMCs。 平均値に達する6 PBMCs は末梢血で数えられました。
図の凡例:
<img alt="遠心分離プロセスの結果。血漿、バフィーコートへの血液分離;遠心分離管図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58595/58595fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図 2: レイヤー密度勾配の遠心分離後の代表的なイメージです。(A) 血液サンプルの前 (左) に、と通常の管 (右) 遠心後。(B) 血液サンプルの前 (左) に、と PBMC 免震装置 (右) 遠心後。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58595/58595fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="細胞生存率アッセイの結果;ペプチド刺激効果;顕微鏡画像とグラフの比較。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58595/58595fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図 3: プロトコルの最適化。(A) よくしなさいアッセイ プレートでの IFN-γ 正のスポット プロトコルに従って開発の典型的な外観。例帳票井戸が表示されますとエタノール前処理後 (右) (左) の前処理の有無。細胞培養いいえ刺激コントロールとして DMSO (上) のいずれかを一晩抗原マッチ ペプチド (中央)、またはマイトジェン ConA (下)。PBMCs 同じ個々 の動物に由来します。自動プレート-スキャナーを使用して井戸をイメージしました。(B) 加工細胞の異なる密度勾配管の比較。3 個別モルモットからの血液サンプルの 3 mL を採取されました。各サンプルの 1.5 mL は、通常管 (密度勾配媒体) または PBMC 免震装置を使用して処理されました。生存率 (左、% ± SEM) および (右、x 106 ± SEM) 生細胞数をカウント システムとトリパン ブルー排除試験自動セルを使用して求めた。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58595/58595fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="棒グラフ;PBMC ELISPOTの結果。SFU と治療。色分けされたNPプール。免疫応答分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58595/58595fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図 4: ワクチン療法のコース上の堅牢な細胞性免疫反応の検出。1 と 15 日 pDNA インフルエンザ A 蛋白 (NP) をエンコードの 30 μ g は皮膚内のモルモット皮膚エレクトロポレーション直後の腹部の側面に配信されました。IFN-γ しなさい応答は、2 回目の予防接種後 14 日後最初の予防接種 (プライム) と 7 日 (ブースト)、46 日 (メモリ) を測定しました。5 扱われるモルモットと 2 未処理モルモット (tx なし) の平均の Sfu + SEM をプロットしました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58595/58595fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

モルモット PBMCs のインターフェロン-γ しなさい測定法の開発では、感染症を研究するためこの関連性の高いモデルで T 細胞の反応特性をことができます。我々 は、関連付けられている DNA ワクチンの皮内送達 T 細胞の反応を測定するアッセイを適用しています。

ワクチン接種後のモルモット モデル メジャー T 細胞反応に最適化されたインターフェロン-γ しなさいアッセイ

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

過去には、モルモットモデルにおける免疫療法の特徴付けは、液性免疫の測定に限られていた。ELISpotアッセイはその制限を克服し、研究者がその動物モデルでより有意義なデータを生成するのに役立ちます。この技術の主な利点は、細胞が末梢血から得られるということです。壊死は必要ありません。これは、自然感染中またはワクチンレジメン全体で個々のモルモットにおける大きさだけでなく、T細胞応答の運動学の測定も可能にする。手順をデモンストレーションすることはホリー・ピューになります。彼女はイノビオの前臨床RとD部門の研究員です。ELISpotアッセイプレートの各ウェルに35%エタノールの15マイクロリットルを加え始める。60秒後、各井戸に150マイクロリットルのPBSを加えます。そして、エタノール前処理を停止するためにプレートを反転します。また、ELISpotアッセイプレートを取り扱う際には、膜の汚染や損傷を避けるために細心の注意を払う必要があります。プレートを洗浄するには、各ウェルに250マイクロリットルのPBSを加える。さらに2回洗浄を繰り返した後、100マイクロリットルの捕獲抗モルモットインターフェロンガンマ抗体VE4を各ウェルに加える。その後、4°Cで少なくとも12時間プレートをインキュベートします。インキュベーション期間の後、プレートを3回洗浄します。各ウェルに200マイクロリットルのブロッキングバッファを加えます。プレートを室温で2時間インキュベートします。その後、プレートをさらに3回洗います。4.5 ml の室温密度勾配媒体を備えた円錐管を準備します。その後、ハンクスのバランスのとれた塩溶液の等しい量を血液と混ぜます。希釈した血液を密度勾配培地の上に徐々に重ね、界面を乱さないで注意する。この後、室温でブレーキなしで30分間800 x gでチューブを遠心します。遠心分離機からチューブを取り出し、層を乱さないで注意してください。正しく層を吸引した後、PBMCを収穫するために完全なバフィーコート層。HBSS希釈血液を密度勾配培地にゆっくりと重ね合わせた。チューブの乱れを避け、遠心分離機のブレーキをオフにします。新しい15mlチューブに細胞を移します。その後、R10培地中の細胞を合計15mlに希釈します。細胞をペレット化した後、上清を捨て、15mlのR10培地で細胞を再懸濁する。70マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して新しい管に細胞懸濁液を渡す。細胞を数え、トリパンブルー除外テストで生きている細胞の数を決定します。その後、R10培地で細胞を希釈します。まずブロッキングバッファを取り出し、プレートを洗います。各PBMCサンプルについて、陽性対照の三重化、陰性対照、および各実験特異的刺激剤を示す。R10培地でタンパク質ペプチドプールを、望ましい最終濃度の3倍に希釈します。この後、プレートの覚醒剤試験井戸に50マイクロリットルのペプチドR10培地混合物を加える。次に、R10培地中のMTペプチド製剤の50マイクロリットルをプレートの陰性対照ウェルに加える。プレートの正の制御ウェルにR10培地にConAを加え、PBMC懸濁液の100マイクロリットルをすべてのウェルに加えます。ELISpotプレートをインキュベーターの偶数面に置き、インキュベーション期間中にプレートを乱さないようにします。インキュベーターからプレートを慎重に取り出した後、プレートを反転させて上清を除去します。その後、プレートを3回洗います。希釈されたビオチン化検出キャプチャの100マイクロリットルを各ウェルに抗モルモットインターフェロンγ抗体N-G3を加えます。その後、室温でプレートを2時間インキュベートします。プレートを反転して抗体溶液を取り除き、洗浄を3回繰り返します。プレートからPBSを取り出した後、各ウェルにブロッキングバッファーで希釈したALPコンジュゲートストレプトアビジンの100マイクロリットルを加える。その後、室温でプレートを1時間インキュベートします。プレートを反転してALPストレプトアビジン溶液を廃棄し、プレートを2回洗浄します。プレートを反転し、余分なPBSを取り除くためにきれいなペーパータオルに対してそれをブロットします。この後、ウェルあたりウルトラピュアDI水の250マイクロリットルでプレートを洗浄します。プレートを反転し、きれいなペーパータオルで余分な水を取り除きます。次に、各ウェルに100マイクロリットルのBCIP/NBT基板溶液を追加します。プレートを室温で20分間、光から保護してインキュベートします。プレートをDI水で4回リンスします。その後、余分な水を除去するためにプレートを反転し、タップします。最後に、プレートの底部からプラスチック排水を取り除き、膜を完全に乾燥させます。先に示したように、密度勾配遠心分離が成功した後、チューブの下部にある赤粘性液体は、赤血球のほとんどを含む必要があります。バフィーコート層は、プラズマ層と密度勾配媒体の間にある。捕獲抗体を加える前にウェルを前処理し、アッセイは陰性対照ウェル内の非特異的スポットの数の減少と共に改善された定義を示した。スポットは、PBMC集団内でT細胞を産生するインターフェロンガンマを示す。この技術を試みるとき、慎重に、しかし迅速に血液を処理することを覚えておくことが重要です。これにより、細胞の生存率が向上し、スポット形成が改善され、非特異的スポットの形成が減少します。血液およびBCIP/NBT基質での作業は危険であり、適切なPPEを着用するなどの予防措置は、常にこの手順を実行している間に取られるべきであることを忘れないでください。このプロトコルは、研究者が結核、エボラ出血熱、HSVなどの重要なT細胞成分を持つ疾患を研究することを可能にすると信じています。重要なことに、モルモットモデルにおけるワクチンプロトコルの開発を改良し、関連性の低い動物モデルの使用を減らすことです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

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学ぶモルモットのインターフェロン-γ ELISpotアッセイによるT細胞応答測定法。末梢血からPBMCを分離し、ワクチン接種後の免疫応答の定量的・動的解析が可能。結核やエボラなどの感染症研究に有用です。

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