Name: 酸性揉捻法を用いた全腎ネフロン数の推定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: 学ぶ酸性揉捻法による全腎ネフロン数の推定法。マウス腎臓を用いて迅速かつ再現性の高い腎単位計測を行い、遺伝的要因や疾患によるネフロン喪失のメカニズム解明に貢献する技術です。

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この作品は、一部の国立衛生研究所、国立心臓、肺、血液研究所 (R01HL107632) によって支持されました。

以下に記載されている供給物および試薬は、1匹のマウス、すなわち2つの腎臓における全腎ネフロン数の決定のためのものである。ラットのための酸揉捻法の使用のための修正は、アスタリスクで識別されます.すべての実験プロトコールは、実験動物のケアと使用のための健康ガイドの国立研究所に適合し、ミシシッピ大学医療センターの機関の動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. 腎分離手順
<ol><li>マウス (または他の種) を計量し、イソフルラン (5%-8%) で euthanize過剰投与またはペントバルビタール (150 mg/kg 腹腔内注射).</li>
	<li>マウスを安楽死させると、正中線に沿って微細な外科用はさみを使用して腹腔を開く。</li>
	<li>腸と生殖用脂肪を腹腔の右側に慎重に持ち上げます。グロス解剖によって、左腎臓を分離する。微細な手術用はさみを使用して、左腎動脈および静脈を切断し、慎重に左腎臓を除去し、腎臓を適切に標識された (マウス番号/識別子) 蛍光体緩衝生理食塩水 (PBS) を含むボートの重量を量る。</li>
	<li>右の腎臓のための手順を繰り返します。</li>
	<li>それぞれの重さのボートから各腎臓を削除し、PBS で予め湿らせた手術用ガーゼの上に置きます。</li>
	<li>手術ガーゼの上に腎臓を残し、すぐに腎カプセルの除去に続く任意の付着性の非腎組織 (perirenal 脂肪または副腎など) を除去します。それぞれの腎臓を個別に秤量し、実験ノートにおいて左右の腎臓の体重を別々に記録する。</li>
</ol>2. 均質化、インキュベーション、および負担の手順
<ol><li>各腎臓を計量したら、PBS の各重量ボートを排水し、適切に標識された計量ボートに戻って腎臓を置きます。清潔なかみそりの刃を使用して、腎臓を縦に半分に切ってください。各腎臓を下に向けて半分にし、2 mm またはそれよりも小さい部分にそれぞれの半分をカットします。</li>
	<li>同じ剃刀を使用して、細かく刻んだ腎臓の断片を標識された 15 mL の円錐形の管 (マウス番号 /識別子; 左と右の腎臓) に入れます。</li>
	<li>新しいかみそりの刃を使用して、反対の腎臓のための手順を繰り返してください。みじん切りにした腎臓を、別々に標識された 15 mL 円錐状のチューブに入れます。</li>
	<li>風通しの良いヒュームフードで、各 15 mL 円錐管に 6 M の塩酸 (HCl) 酸 5 mL を加えます。</li>
	<li>キャップを円錐管に交換し、腎臓/HCl 混合物を静かに攪拌し、15 mL の円錐形のチューブを、37° c で設定した予熱した水浴中に90分 (ラット腎臓の場合は * 120 min) に置きます。</li>
	<li>すべての組織が HCl に暴露されることを確実にするために、インキュベーション中に15分ごとに各 15 mL のチューブを簡単に攪拌ます。</li>
	<li>18グラムの針を5ml の注射器に挿入し (* 10 mL シリンジをラット用)、慎重にシリンジを取り外します。50の円錐形のチューブ (チューブ #1) をヒュームフードに入れて注射します。</li>
	<li>水浴から腎臓/HCl 溶液を取り出し、シリンジの開いた端に組織溶液を注ぎ、試験管ラックに 15 mL の円錐管を脇に置きます。慎重にプランジャーを交換し、溶液を針を通してチューブ #1 に押し出すようにプランジャーをゆっくりと押し込みます。</li>
	<li>5ml の PBS 溶液で 15 mL の円錐形のチューブを洗浄します。残りの腎臓組織を可溶化ように、15 mL の円錐管で PBS を旋回させる。</li>
	<li>再度、18 G 針を含んでいる 5 mL のスポイトからプランジャーを注意深く取除き、15の mL の円錐形の管からスポイトの開いた端に内容を注ぐ。慎重にプランジャーを交換し、チューブ #1 に、プランジャーをゆっくりと押し下げてシリンジをフラッシュします。このプロセスの2x を繰り返します (合計で3倍になります)。</li>
	<li>新しい 5 mL シリンジ (ラット用10ml シリンジ) に 21 G 針を挿入し、注射器プランジャーを慎重に取り外します。新しい 50 mL の円錐形の管 (管 #2) に付す 21 G の針が付いているスポイトを置きなさい。</li>
	<li>チューブ #1 から、21 G 針を含むシリンジの開いた端に内容物を注ぎます。慎重にプランジャーを挿入し、シリンジのプランジャーをゆっくりと押し下げてシリンジをフラッシュし、押出液をチューブ #2 に入れます。</li>
	<li>PBS 溶液 5 mL で洗浄チューブ #1。可溶化チューブ内の PBS を旋回させることで、残りの腎臓組織を維持することができ #1。</li>
	<li>再度、18 G 針を含んでいる 5 mL のスポイトからプランジャーを慎重に取除き、スポイトの開いた端に管 #1 からの内容を注ぐ。プランジャーを慎重に交換し、プランジャーを静かに押し下げてシリンジをフラッシュし、溶液をチューブ #2 に押し出します。このプロセスの2x を繰り返します (合計で3倍になります)。</li>
	<li>チューブ #2 の 50-mL ラインまで、PBS を追加して、チューブ #2 の総量を最大 50 mL にします。</li>
	<li>4° c で一晩 (最小 8-10 h) に設定された冷蔵庫のロッカープレート上のチューブラックに腎臓組織溶液を含むインキュベートチューブ #2。</li>
</ol>3. ネフロン数の糸球体と外挿のカウント
<ol><li>冷蔵庫からチューブ #2 を取り外し、均質な溶液を作成するために、チューブを穏やかに数回反転させることによってペレット化された組織を再懸濁します。処理後 5 d 以内で糸球体を数えることをお勧めします。</li>
	<li>慎重にアリコートの500μ l を12ウェルプレートの単井戸に注入します。この2x を繰り返して、各アリコートを別々の井戸に置き、腎臓あたりの腎臓溶液の3つのウェルがあるように、三連での分析のために。</li>
	<li>腎溶液を含む3つのウェルのそれぞれに500μ l の PBS を添加し、1:1 希釈する。</li>
	<li>倒立顕微鏡を使用して、ウェルあたり糸球体の数をカウントします。カウントは、各ウェルの底部に配置された16の別々のセクションのグリッドを使用することによって助けられる。各グリッドセクションごとの糸球体の数をカウントし、1つのウェルあたりの合計数の糸球体を取得するには、1個あたりの数を合計します。糸球体は、それらの球状構造によって容易に識別可能である。付加的な識別子は、血液で満たされた毛細血管による赤みを帯びた色相、ならびに個々の糸球体の身体に付着したままであるプレ細動脈または後血管を含む (図 1)。</li>
	<li>3つの井戸のそれぞれについてカウントされた糸球体の合計数を追加し、腎臓液500μ l あたり糸球体の平均数の3つによってそれらを分割します。ウェルあたりの平均糸球体数の分散が 10% を超える場合は、腎臓溶液の均質な性質に細心の注意を払って、ネフロンの手順を繰り返します。1腎あたりの平均糸球体数について、ウェルタイムズ100あたりの糸球体数を乗算します。合計ネフロン数は、腎臓ごとに、または腎臓の重量を使用して、mg または g の組織ごとに発現させることができる。</li>
</ol>

<ol><li>Hall, J. E., Guyton, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHall%2C+JE+%22Guyton+and+Hall+Textbook+of+Medical+Physiology%22">Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology</a>. , 13th, Elsevier. Philadelphia, PA. (2016).</li>
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<li>Didion, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+model+to+explore+the+Brenner+hypothesis%3A+Linking+nephron+endowment+and+number+with+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">A novel genetic model to explore the Brenner hypothesis: Linking nephron endowment and number with hypertension.</a> Medical Hypotheses. 106, 6-9 (2017).</li>
<li>Brenner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+adaptation+to+renal+injury+or+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nephron adaptation to renal injury or ablation.</a> American Journal of Physiology. 249 (3 Pt 2), F324-F337 (1985).</li>
<li>Didion, S. P., Wang, X., Garrett, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+correlation+between+blood+pressure+and+nephron+endowment+in+a+genetic+model+of+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Direct correlation between blood pressure and nephron endowment in a genetic model of hypertension.</a> Hypertension. 68, A052(2016).</li>
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<li>Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+number%2C+renal+function%2C+and+arterial+pressure+in+aged+GDNF+heterozygous+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice.</a> Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).</li>
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</ol>

作者は何も開示することはありません。

優れた実験技術により、酸性マセレーション法は、腎臓全体のネフロン数を推定するのに理想的です。腎臓は酸に溶解しているが、糸球体はほとんど無傷のままであり、容易に識別可能であるため、個々の糸球体の計数は比較的容易で簡単である。この酸性マセレーション技術は、いくつかの理由により特に有利である。第1に、酸性マセレーション法は、費用と身体的努力の面で比較的少ない必要がある迅速かつ簡便な方法である。酸性マセレーション法を実行するために必要なすべての試薬および消耗品は、ほとんどの基本的な実験室で容易に入手可能であり、糸球体計数のための倒立顕微鏡へのアクセスである唯一の主要な要件である。費用の面では、酸マセレーション法は、動物1匹あたりわずか数百ドルの費用がかかると推定されており、これは、磁気共鳴画像法のような全腎糸球体の計数の他の方法に関連するコストと比較して、多くはないこれは、スキャン時間と技術的な専門知識の動物当たり数千ドルに及ぶことができます。
第2に、酸揉捻法は、解剖器/fractionator 法24のような全腎ネフロン数の他の方法と比較...

ネフロンは腎臓1の基本的な構造および機能単位の両方である。構造的には、ネフロンは、ボーマンカプセルおよび腎細管内に位置する糸球体 (毛細血管および podocytes) と、近位細管、ヘンレのループ、および収集ダクトに終端する遠位細管からなる。機能的には、ネフロンの役割は、水と電解質の濾過と再吸収、および廃棄物の分泌である。一般に、nephrogenesis は、マウスおよびラット2のようないくつかの種において出生直後のヒトおよび生後約36週に完了する。ネフロンは、個体が生まれたネフロンの総数を指し、一方、ネフロン数は出生後3の任意の時点で測定されたネフロンの合計数です。ネフロン数および糸球体数という用語は、しばしば同義的に用いられる。ネフロンごとの糸球体は1つしか存在しないため、糸球体数の評価はネフロン数を推定するための重要なサロゲートです。
ネフロンのエンダウメントとネフロン数の評価は、研究がネフロン基金と心血管疾患の発生率の増加とのネフロン数との関連を示したので、臨床的な関心である4,5 、6、7、8、9、10、11、12、13、14、剖検における腎臓の所見に基づいて、ブレンナーは、高血圧の個体が normotensive 個人16よりも低い総ネフロン数を提示したことを観察した。このように、ブレナーは、ネフロン数と、後の人生において高血圧を発症するリスクとの間に逆の関係があると仮説を立てた。ブレンナーはまた、ネフロン数の減少が残ったネフロンによって補われるという仮説を立てた。腎臓における正常な濾過速度を維持するために、残留ネフロンは糸球体表面領域 (糸球体肥大) を増加させることによって補償し、それによって腎機能上のネフロン損失の任意の有害作用を緩和するように働く4 、16。
短期的には、糸球体肥大は、長期的には、ナトリウムおよび体液貯留の増加、細胞外液量の増加、および動脈血圧の上昇を招き、さらに増加する悪循環に至る。糸球体毛細血管圧、糸球体 hyperfiltration、およびネフロン瘢痕化 (硬化症) および傷害4、16。
推定値またはネフロン数のカウントは、実験的な利点のカップルを提供しています: 1) それは、その後、胚または母体-胎児環境における特定の遺伝子または因子にリンクすることができる nephrogenesis のプロセスに関する情報を提供し、2)心血管疾患とネフロン数の関連があり、したがって、将来の心血管リスク2、17、18を予測するために、ネフロン数の推定値が使用できる可能性があります。19,20,21,22. 母体胎児環境に加えて、いくつかの疾患は、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、高血圧、さらには正常な老化を含むネフロン数および腎機能に直接影響を与える2、9、 10、11、12、22、23。したがって、全腎ネフロン数の評価は、人の生命の経過にわたる nephrogenesis (すなわちネフロン) およびネフロン数に影響する遺伝的および環境的要因の両方を理解するために重要であり、その結果として生じる効果腎機能と心血管の健康に.
現在、ネフロン数の決定と定量化のために利用可能ないくつかの方法があり、それぞれに独自の利点と制限があります24、25、26、27、28 、29、30。全腎ネフロン数を決定するための洗練された方法には、解剖器/fractionator 法、および磁気共鳴画像25、26などの stereological 方法が含まれる。多くの場合、腎臓全体のネフロン数を決定するための金標準と考えられているが、解剖器/fractionator 法は高価で時間がかかる。磁気共鳴イメージングと処理の最近の進歩と改善は、一つ一つのネフロンを個別にカウントするためのツールを提供してきました。しかし、磁気共鳴イメージングは、時間がかかるだけでなく、非常に高価です。さらに、解剖器/fractionator 法と磁気共鳴画像の両方が高度な技術的専門知識を必要とするため、大部分の研究所でこのような方法の使用を制限しています。
ネフロン数を決定するほとんどの方法は、糸球体の同定に基づいてカウントまたは推定を行い、構造的に容易に識別可能である。本論文では、全腎臓においてネフロン数を推定するための酸揉捻法について説明し、27を示した。酸揉捻法は、高速で信頼性が高く、解剖器/fractionator 法や磁気共鳴イメージングなどの他の方法よりも大幅に安価です。さらに、この酸性揉捻法は、磁気共鳴イメージング26を用いて決定されたものの範囲内にあると報告しているネフロン数の再現性の高い推定値を提供する。

<table><tbody><tr><td>イソフルラン麻酔</td><td>アボット研究所</td><td>05260-05</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン気化器システム&流量計</td><td>ブレインツリーサイエンティフィック</td><td>VP I</td><td>医療グレードの酸素供給を含む</td></tr><tr><td>ライカ倒立顕微鏡 DMIL LED</td><td>ライカマイクロシステム</td><td>DMIL LED</td><td>任意のメイク また、適切な</td></tr><tr><td>デジタルウォーターバス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>2239</td><td>任意のメイク適切な</td></tr><tr><td>ToughCut Fine手術用ハサミ</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-11</td><td>25 mm刃先、長さ11.5 cm。ヒント:シャープシャープ;先端形状:ストレート</td></tr><tr><td>マイクロ解剖鉗子4 1/4インチ</td><td>Biomed Res Instruments, Inc</td><td>10-1760</td><td>湾曲した先端</td></tr><tr><td>プレキシガラスボード 5 インチ x 7 インチ</td><td>任意のソースに適した</td><td>n/a</td><td>任意の製造も適切な</td></tr><tr><td>六角形ポリスチレン計量皿</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>02-2002-100</td><td>任意の製造も適切な</td></tr><tr><td>カミソリブレード</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>12-640</td><td>シングルエッジ炭素鋼 0.009</td></tr><tr><td>ガーゼスポンジ 4 x 4インチ 8プライ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>MSD-1400250</td><td></td></tr><tr><td>10倍濃縮リン酸塩緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P5493-4L</td><td>1xに希釈&nbsp;</td></tr><tr><td>6 Nヒドロコール酸溶液</td><td>シグマAldrich</td><td>3750-32</td><td></td></tr><tr><td>15 mL円錐遠心分離管</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-959-70C</td><td>任意のメイクも適切な</td></tr><tr><td>50 mL円錐遠心分離チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-959-49A</td><td>任意のメイクも適切な</td></tr><tr><td>使い捨て5 mLシリンジ</td><td>コールパー</td><td>マーEW-07944-06</td><td>任意のメイクも適切な</td></tr><tr><td>18G1.5使い捨てニードル</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>14-826-5D</td><td>任意のメイクも適切な</td></tr><tr><td>21G1.5 使い捨てニードル</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>14-826-5B</td><td>任意のメイクも適切な</td></tr><tr><td>12ウェル複数ウェル細胞培養プレート 蓋付き</td><td>コール・パーマー</td> <td>#FW-01959-06</td> 任意の<td>メイクも適切</td></tr><tr><td>ポリプロピレン モジュラー試験管ラック</td><td>コール・パーマー</td> <td>#EW-06733-00</td><td>15mLと50mLのコニカルチューブを収容可能。どんなメーカーでも適しています</td></tr></tbody></table>

酸性揉捻法を用いた全腎ネフロン数の推定

Estimation of Nephron Number in Whole Kidney using the Acid Maceration Method

ネフロンは、ヒトの nephrogenesis が妊娠の36週までに完了し、新たなネフロンが誕生後に形成されないため、個体が生まれたネフロンの合計数を指します。ネフロン数は、出生後の任意の時点で測定されたネフロンの総数を指す。遺伝的要因と環境因子の両方がネフロンの両方のエンダウメントと数に影響を与えます。特定の遺伝子または因子が nephrogenesis およびネフロンの損失または終焉の過程にどのように影響するかを理解することは、より低いネフロンのエンダウメントまたは数を持つ個人が腎または心血管疾患を発症するリスクが高いと考えられるために重要である。人の一生にわたる環境曝露がネフロン数にどのように影響するかを理解することは、将来の疾患リスクを決定する上でも重要である。したがって、全腎ネフロン数を迅速かつ確実に評価する能力は、nephrogenesis またはネフロン損失に寄与または促進するメカニズムをよりよく理解するための基本的な実験要件である。ここでは、Damadian、Shawayri、およびブリッカーによって記述された手順に基づいて、腎臓全体のネフロン数を推定するための酸揉捻法について説明し、わずかな変更を加えた。酸性マセレーション法は、ネフロン数 (糸球体を計数することによって評価される) の 5% 以内であり、より高度な、しかし高価であるが、磁気共鳴イメージングなどの方法を用いて決定されたもののうちの、迅速で信頼できる推定値を提供する。さらに、酸性マセレーション法は、多数のサンプルまたは実験条件においてネフロン数を評価する優れた高スループット方法である。

以下は高血圧の確立されたマウスモデルからの全腎ネフロン数の代表的な推定値と加齢性慢性腎疾患の遺伝的ラットモデルである。事前または細動脈後、または管状構造に接続されているかどうかにかかわらず、球状構造のような糸球体の主要な識別特性は、酸性マセレーション法に新しいものについては強調しています (図 1)。
第1の実験例において、総ネフロン数は、ビヒクル (生理食塩水) またはアンジオテンシン II を注入したマウスにおいて14日間にわたって測定された。ビヒクル注入マウスにおいて、ネフロン数は、酸性マセレーション法を用いて決定された腎臓あたり12411±248ネフロンであった (図 2)。これらの推定値は、マウスで以前に報告された全腎ネフロン数の範囲と一致している (表 1)。アンジオテンシンは、注入の14...

全腎ネフロン数の推定値は、ネフロン数と腎および心血管疾患のリスクの亢進との間に逆相関があるので、臨床的および実験的に重要である。ここで、全腎ネフロン数の迅速かつ信頼性の高い推定を提供する酸性揉捻法の使用が、実証されている。

Nephron endowment refers to the total number of nephrons an individual is born with, as nephrogenesis in humans is completed by 36 weeks of gestation and ...

酸マセレーション法は、腎臓に関する重要な質問に答え、特定の遺伝子がネフロンの発達にどのように寄与するか、または糖尿病や高血圧などの特定の状態がネフロン数にどのような影響を与えるかに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。これは、胎児の発達と腎不全の喪失の間に生まれた個人が腎病理に関連付けられているネフロンの総数として重要である。酸マセレーション法の主な利点は、磁気共鳴画像法のような他のネフロン計数法よりも速く、より再現性が高く、安価で、時間が短いということです。この技術は、腎機能に対する腎座数の影響の相関を促進し、特定の遺伝子がネフロンの機能と発達にどのような影響を与えるかを理解するために重要である。全体的なニーフロン数に影響を与える遺伝子または因子の研究は、病気関連のネフロンの損失を制限するように設計された薬理学的または遺伝的アプローチの開発に役立ちます。良い実験技術と実践により、この方法に新しい個人は、腎臓腎番号全体の信頼性と再現性推定を可能にする酸マセレーション法の習得を容易に得る必要があります。まず、細かい手術用ハサミを使用して、正中線に沿ってマウスの腹腔を開きます。慎重に腸と生殖脂肪を動物の右側にシフトします。総解剖を使用して、左腎臓を分離し、左腎動脈と静脈を切断し、PBSの適切なラベル付けされた重量ボートに臓器を置く腎臓を慎重に除去する。同じ方法で右の腎臓を収集し、PBSで事前に湿らせた外科ガーゼの上に両方の腎臓を置きます。付着非腎組織と腎カプセルを素早く除去します。次に、各腎臓に個別に左右の器官の重量を記録する重量を量る。計量後、PBSなしで適切にラベル付けされた計量ボートに各腎臓を戻し、きれいなカミソリの刃を使用して各臓器を縦半分に切断します。各腎臓の半分を切り取り、各半分を2ミリメートルまたは小さく切ります。同じカミソリの刃を使用して、慎重に適切にラベル付けされた15ミリリットルの円錐管に刻んだ腎臓片を転送します。換気の良いフュームフードに、各チューブに6モル塩酸を5ミリリットル加えます。次に、腎臓酸混合物を軽く攪拌してから、チューブを摂氏37度の水浴に90分間入れます。酸マセレーションの終わりに、腎臓あたり1つの5ミリリットルシリンジに1つの18ゲージ針を取り付け、慎重に注射器のプランジャーを取り除きます。注射器をヒュームフードの中の個々の50ミリリットルの円錐形の管に入れ、テストチューブラックに空の管を脇に置く各注射器の開いた端に腎臓溶液を注ぎます。その後、慎重に50ミリリットルチューブに針を通して各溶液の遅い押出しのためのプランジャーを交換してください。PBSを渦巻くチューブあたり5ミリリットルのPBS溶液で15ミリリットルの円錐チューブを洗浄し、残りの腎臓組織を可溶化します。ちょうど実証したように、洗浄内容物を適切な50ミリリットルチューブに押し出します。3回目の洗浄を押し出した後、各注射器に21ゲージの針を装備する。50ミリリットルチューブの内容物を小さなボア針洗浄を通して50ミリリットルチューブの第2セットに押し出し、実証したように最初の50ミリリットルチューブ内容物を新鮮なPBSで3回押し出します。3回目の洗浄と押出の後、各チューブの総体積を追加のPBSで最大50ミリリットルにし、一晩で4°Cのロッカープレートのラックにチューブを置きます。加工から5日以内に、16個の断面を含むグリッドを、12ウェルプレートの6つの井戸の底に置きます。腎臓液の管を数回軽く反転させてペレット組織を再懸濁する。12ウェルプレートの3つのウェルのそれぞれに腎臓ごとに各均質化溶液の3つの500マイクロリットルのアリコートを慎重に追加します。PBSの等量で各ウェルの内容物を希釈します。逆顕微鏡のステージにプレートを置きます。球体構造、赤みを帯びた色相、および個々の糸球体の体に付着した前または後の動脈によって糸球体を特定する。グリッド化された各区間あたりの糸球体数をカウントして、グリッドあたりのカウントを合計して、ウェルあたりの糸球体の合計数を計算します。次に、1ウェル当たりの糸球体の数を100倍にして、腎臓当たりの糸球体の平均数を求める。本代表的実験では、14日間の車両を注入したマウスの総腎数は、腎臓当たり約12,500個のネフロンであった。しかし、アンジオテンシン2回の注入は、約40ミリメートルの水銀によって心房圧を増加させ、全腎数の有意な26%の減少と関連していた。ラット腎新生のこの遺伝的モデルでは、2つの腎臓を持って生まれた動物は、実証された酸マセレーション後に腎臓あたり約27,500個のニーフロンを含むと計算され、孤独な腎臓で生まれたラットは総腎数が有意に低いことがわかった。両方の実験からの推定値は、ラットで以前に報告された範囲と一致した。酸マセレーション法は、特に二分性分量法や磁気共鳴画像法などのニーフロンを数えるため、より多くの労力を要し、コストのかかる技術を備えていない実験室で、腎臓全体の腎数を推定するのに理想的です。この方法は磁気共鳴画像法によって決定される数の5%の内にある腎臓の腎腎番号全体の高い効率、および再生可能な推定を可能にする。腎数の評価は、腎不全数の減少が慢性腎臓病などの心血管疾患のリスクの増加に関連付けられているため、臨床的関連性の高いものである。塩酸を使用すると非常に危険であり、手袋、保護眼鏡、実験室のコートを着用するなど、予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

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酸性揉捻法を用いた全腎ネフロン数の推定

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