酸性揉捻法を用いた全腎ネフロン数の推定

酸マセレーション法は、腎臓に関する重要な質問に答え、特定の遺伝子がネフロンの発達にどのように寄与するか、または糖尿病や高血圧などの特定の状態がネフロン数にどのような影響を与えるかに関する重要な質問に答えるのに役立ちます。これは、胎児の発達と腎不全の喪失の間に生まれた個人が腎病理に関連付けられているネフロンの総数として重要である。酸マセレーション法の主な利点は、磁気共鳴画像法のような他のネフロン計数法よりも速く、より再現性が高く、安価で、時間が短いということです。

この技術は、腎機能に対する腎座数の影響の相関を促進し、特定の遺伝子がネフロンの機能と発達にどのような影響を与えるかを理解するために重要である。全体的なニーフロン数に影響を与える遺伝子または因子の研究は、病気関連のネフロンの損失を制限するように設計された薬理学的または遺伝的アプローチの開発に役立ちます。良い実験技術と実践により、この方法に新しい個人は、腎臓腎番号全体の信頼性と再現性推定を可能にする酸マセレーション法の習得を容易に得る必要があります。

まず、細かい手術用ハサミを使用して、正中線に沿ってマウスの腹腔を開きます。慎重に腸と生殖脂肪を動物の右側にシフトします。総解剖を使用して、左腎臓を分離し、左腎動脈と静脈を切断し、PBSの適切なラベル付けされた重量ボートに臓器を置く腎臓を慎重に除去する。

同じ方法で右の腎臓を収集し、PBSで事前に湿らせた外科ガーゼの上に両方の腎臓を置きます。付着非腎組織と腎カプセルを素早く除去します。次に、各腎臓に個別に左右の器官の重量を記録する重量を量る。

計量後、PBSなしで適切にラベル付けされた計量ボートに各腎臓を戻し、きれいなカミソリの刃を使用して各臓器を縦半分に切断します。各腎臓の半分を切り取り、各半分を2ミリメートルまたは小さく切ります。同じカミソリの刃を使用して、慎重に適切にラベル付けされた15ミリリットルの円錐管に刻んだ腎臓片を転送します。

換気の良いフュームフードに、各チューブに6モル塩酸を5ミリリットル加えます。次に、腎臓酸混合物を軽く攪拌してから、チューブを摂氏37度の水浴に90分間入れます。酸マセレーションの終わりに、腎臓あたり1つの5ミリリットルシリンジに1つの18ゲージ針を取り付け、慎重に注射器のプランジャーを取り除きます。

注射器をヒュームフードの中の個々の50ミリリットルの円錐形の管に入れ、テストチューブラックに空の管を脇に置く各注射器の開いた端に腎臓溶液を注ぎます。その後、慎重に50ミリリットルチューブに針を通して各溶液の遅い押出しのためのプランジャーを交換してください。PBSを渦巻くチューブあたり5ミリリットルのPBS溶液で15ミリリットルの円錐チューブを洗浄し、残りの腎臓組織を可溶化します。

ちょうど実証したように、洗浄内容物を適切な50ミリリットルチューブに押し出します。3回目の洗浄を押し出した後、各注射器に21ゲージの針を装備する。50ミリリットルチューブの内容物を小さなボア針洗浄を通して50ミリリットルチューブの第2セットに押し出し、実証したように最初の50ミリリットルチューブ内容物を新鮮なPBSで3回押し出します。

3回目の洗浄と押出の後、各チューブの総体積を追加のPBSで最大50ミリリットルにし、一晩で4°Cのロッカープレートのラックにチューブを置きます。加工から5日以内に、16個の断面を含むグリッドを、12ウェルプレートの6つの井戸の底に置きます。腎臓液の管を数回軽く反転させてペレット組織を再懸濁する。

12ウェルプレートの3つのウェルのそれぞれに腎臓ごとに各均質化溶液の3つの500マイクロリットルのアリコートを慎重に追加します。PBSの等量で各ウェルの内容物を希釈します。逆顕微鏡のステージにプレートを置きます。

球体構造、赤みを帯びた色相、および個々の糸球体の体に付着した前または後の動脈によって糸球体を特定する。グリッド化された各区間あたりの糸球体数をカウントして、グリッドあたりのカウントを合計して、ウェルあたりの糸球体の合計数を計算します。次に、1ウェル当たりの糸球体の数を100倍にして、腎臓当たりの糸球体の平均数を求める。

本代表的実験では、14日間の車両を注入したマウスの総腎数は、腎臓当たり約12,500個のネフロンであった。しかし、アンジオテンシン2回の注入は、約40ミリメートルの水銀によって心房圧を増加させ、全腎数の有意な26%の減少と関連していた。ラット腎新生のこの遺伝的モデルでは、2つの腎臓を持って生まれた動物は、実証された酸マセレーション後に腎臓あたり約27,500個のニーフロンを含むと計算され、孤独な腎臓で生まれたラットは総腎数が有意に低いことがわかった。

両方の実験からの推定値は、ラットで以前に報告された範囲と一致した。酸マセレーション法は、特に二分性分量法や磁気共鳴画像法などのニーフロンを数えるため、より多くの労力を要し、コストのかかる技術を備えていない実験室で、腎臓全体の腎数を推定するのに理想的です。この方法は磁気共鳴画像法によって決定される数の5%の内にある腎臓の腎腎番号全体の高い効率、および再生可能な推定を可能にする。

腎数の評価は、腎不全数の減少が慢性腎臓病などの心血管疾患のリスクの増加に関連付けられているため、臨床的関連性の高いものである。塩酸を使用すると非常に危険であり、手袋、保護眼鏡、実験室のコートを着用するなど、予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。