Name: 吸水性 Microbiopsy サンプリングと低侵襲、同時血と肌分析のための RNA の抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: 学ぶ吸水性マイクロバイオプシーによる低侵襲的な皮膚と血液の同時サンプリング法。RNA抽出と定量PCRを用いて皮膚疾患のバイオマーカー発見に応用可能で、瘢痕を残さず臨床研究参加者の安全性を向上させる革新的技術です。

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NHMRC 奨学金 APP1109749 と APP1111216、クイーンズランド大学百周年記念奨学金、国際大学院研究奨学金を認識したいと思います。

研究は、大学の南オーストラリア人間倫理委員会 (200607) とクイーンズランド大学人間研究倫理委員会 (HREC-13-QPAH-551 と UQ2013001551) 地下鉄南人間研究倫理委員会によって承認されました。
1. 吸水性 Microbiopsy の作製
<ol><li>レーザーのそれぞれ 50 μ m 医療グレードのステンレス スチール シートと吸音層 (ろ紙) からマイクロニードルの部分をカット (図 1)。 注: プランジャーやデバイスの場合など、他の部品は、ラピッドプロトタイピング技術、3 D プリントなどで製造されています。</li>
	<li>5 分 70% エタノール (エタノール) での吸音層を除いて、すべての部品を浸漬し、空気は 30 分間、その後それらを乾燥します。</li>
	<li>中 (図 1 a) 吸収層を持つ、3 層マイクロニードルを組み立てます。</li>
	<li>組み立てのマイクロニードルをプランジャーのスリットに挿入します。</li>
	<li>春に、プランジャーをケース (図 1 c) に挿入します。針の品質を確保する組立手順にも触れるマイクロニードルを避けてください。</li>
	<li>使用する前に γ 放射線滅菌パッケージに組み立てられた吸水性 microbiopsy をシールします。</li>
</ol>2. 吸水性 Microbiopsy とサンプリング
<ol><li>使い捨て手袋とスプレー手 70%、鉗子などのツールを着る江藤。</li>
	<li>アルコール ワイプでアプリケーション サイトをサニタイズします。</li>
	<li>ガンマ線照射滅菌パッケージからプロセスのマイクロニードルを触れることがなく、microbiopsy を削除します。</li>
	<li>春音 'クリック' があるまでと場所でプランジャー ロックを圧縮するプランジャーを引きによってデバイスをロードします。</li>
	<li>サンプリング領域が固定位置にあることを確認、サンプリングされる皮膚デバイスを目指します。</li>
	<li>デバイスが、皮膚に対してほぼ垂直であることを確認し、≥ 1 kg の力を肌の上にデバイスに適用します。 注: は皮膚下に力を加えるマイクロニードルの十分な溶込みを確保するため必要です。</li>
	<li>トリガーを押すし、10 の最小値のための場所でデバイスを保持吸収する血液サンプルの s。 注: デバイスが 10 の前に解放された場合 s、キャプチャされた以下のサンプルがあります。</li>
</ol>3. RNA の抽出
注: microbiopsied のサンプルから RNA の絶縁に最適なメーカーのプロトコルから RNA 抽出手順が変更されました。特に指定しない限り、すべての試薬および RNA の抽出で使用される列はキットに含まれます。
<ol><li>優しく手でピストンとケースから吸収性マイクロニードルを引き出します。マイクロニードルの先端が接触しないように何か除去中。</li>
	<li>プランジャーから吸収性マイクロニードルを削除します。滅菌ピンセットのペアを持つマイクロニードルの 2 つの穴を保持し、それを引き出します。</li>
	<li>そのままマイクロニードルを 2 mL 遠心チューブに入れて (RNA 分離キットからではなく材料の表を参照してください)、下に向かって下向きの針側が抽出バッファーの 50 μ L で充填されました。サンプル損失を最小限に抑えるために、5 分のドライアイスにサンプルを処理する前にチューブを残します。</li>
	<li>渦簡潔に (3-5 秒) の先端からサンプリングされた材料の一部を削除します。</li>
	<li>42 ° C で 30 分間ロッカーに管内マイクロニードルを孵化させなさい 注: 緩衝液に吸収される吸収層すぐに。</li>
	<li>滅菌鉗子を用いた 2 mL および microfuge の管の上端のマイクロニードル (針の反対側) のレベルの上の部分を配置します。</li>
	<li>マイクロニードルの上部は、キャップとチューブの間の行われているように、チューブのふたを閉じます。</li>
	<li>30 の最大速度、または g x 16,000 でチューブをスピン デバイスの吸音層からサンプリングされた材料を削除する s。</li>
	<li>緩衝液に浸漬せず、ピンセットで慎重にマイクロニードルを削除します。チューブを維持し、マイクロニードルを破棄します。</li>
	<li>新しい微量遠心チューブに慎重に抽出された RNA を含む上清 3,000 x g で 2 分間ピペットでサンプルを遠心分離機します。</li>
	<li>精製カラム フィルター膜の上にエアコンのバッファーの 250 μ L を追加し、室温で 5 分間インキュベートします。</li>
	<li>16,000 g x または 1 分最大速度でコレクションの管の列を遠心します。</li>
	<li>70% の 50 μ L を追加手順 3.9 から収集したサンプルに江藤。上下に軽くピペッティングでよく混ぜます。</li>
	<li>前処理精製カラムに混合物 (~ 100 μ L) を転送します。</li>
	<li>30 16,000 × g で遠心分離によって続いて 100 × g、すぐにで 2 分間遠心流れを介して削除する s。</li>
	<li>8,000 × g に精製カラムに 1 分間遠心洗浄バッファー 1 (W1) の 100 μ L を追加します。</li>
	<li>DNase 溶液を準備するには、DNase 私別の遠心でバッファー RDD の 35 μ L に在庫ソリューションは各サンプルのチューブの 5 μ L を追加します。ミックスを軽く反転します。 注: DNase 処理で実行される精製カラムの代わりに PCR プレートでその後、サンプルの量のためです。</li>
	<li>浄化列膜に直接 DNase インキュベーション ミックス 40 μ L を追加します。15 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>浄化列膜に W1 の 40 μ L を追加します。8,000 × g で遠心する 15 の s。</li>
	<li>精製カラムに DNase 処理し 8,000 × g で 1 分間遠心後洗浄バッファー 2 (W2) の 100 μ L をピペットします。</li>
	<li>精製カラムに W2 の別の 100 μ L を追加し、16,000 x g チェック任意の残留洗浄バッファーに対して浄化列に 2 分間遠心します。再 1 分 16,000 × g で遠心分離機の洗浄バッファーが残っている場合。</li>
	<li>精製カラムをキットで提供される新しい 0.5 mL 遠心チューブに転送します。</li>
	<li>RNase フリー水 (RNA 分離キットには付属していません) の溶出バッファー (EB) ではなく精製カラムの膜の上に直接 11 μ L をピペットします。膜に RNase フリー水を最大限に吸収できるように RNase フリー水を塗布しながら、膜の表面にピペットの先端をそっと触れます。2 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>遠心分離機の列で、RNase フリー水を配布し、RNA を溶出する 1 分で 16,000 x g の遠心分離機に 1,000 x g で 1 分の列。 注: RNA 定量は試料の少量のため推奨されません。</li>
	<li>ポイント #1 の停止: cDNA 合成がすぐに実行されない場合、-80 ° c 総 RNA のサンプルを格納します。 注: は、RNA サンプルの低濃度を与え、必要に応じて凍結を避けるため。</li>
</ol>4. cDNA 合成
<ol><li>(3.25) のステップから氷の上凍結サンプルを解凍します。</li>
	<li>以下の手順に従って cDNA 合成キットの総 RNA からの cDNA を合成します。</li>
	<li>反応混合物の準備: 総 RNA、TransAmp バッファー、逆転写酵素の 1 μ L、DNase、RNase フリーの水の 4 μ L x 5 の 4 μ L の 11 μ L。ピペットで穏やかに混合します。</li>
	<li>サーマルサイクラー装置で逆のトランスクリプションを実行: 10 分、15 分、42 ° C の 25 ° C に続いて 85 ° C、5 分で最後の逆転写酵素不活性化ステップ。</li>
	<li>ポイント 2 を停止: 使用するまで-80 ° c 逆転写サンプルを格納します。</li>
</ol>5. qPCR 反応とデータ解析
注: qPCR 反応のためのプライマーは、NCBI プライマー爆発 (www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) を使用してゲノム DNA の増幅を避けるためにイントロン境界にまたがるよう設計されました。本研究で使用される参照の遺伝子はRPLP0 (詳細についての議論を参照してください)。
<ol><li>(ステップ 4.5) から氷の凍結サンプルを解凍します。</li>
	<li>以下の手順に従って qPCR マスター ミックス キットと qPCR を実行します。</li>
	<li>反応あたり以下を含むマスター ミックスを調製: 2 x qPCR の反作用の組合せ、DNase 自由水の 2.2 μ、10 μ M 逆プライマー 0.4 μ 10 μ M 前方プライマー 0.4 μ L の 5 μ L。ピペットで穏やかに混合します。トリプリケートのサンプルを設定します。</li>
	<li>各ウェル、384 ウェル PCR プレートと、2 μ l 各サンプル (10 μ L/ウェルの合計) からの cDNA にマスター ミックスの 8 μ L をピペットします。 注: テンプレート コントロール (NTC) して、逆転写酵素制御なし (-RT) ネガティブ コントロールとして含まれています。</li>
	<li>接着フィルム、プレートを密封し、遠心分離機の簡潔に。</li>
	<li>リアルタイム サーマルサイクラーの増幅反応を実行: 2 分 (ポリメラーゼ活性化)、95 ° C、5 95 ° C の 40 のサイクルに続いて s (変性)、10 の 60 ° C s (焼鈍) および 10 のための 72 ° C s (拡張子)。</li>
	<li>既知濃度のテンプレートから調製した標準曲線から補間することによってサンプルの RNA 濃度を計算します。<ol>
<li>ソフトウェアで新しいテストを作成します。</li>
		<li>定義と基準を設定板のシリアル希薄を設定するをクリックします。</li>
		<li>選択し、標準およびサンプルの井戸を手配します。適用をクリックします。</li>
		<li>標準曲線を評価するために、[結果] タブの分析を] をクリックします。増幅効率とエラー実験条件を満たして、斜面、R2値を確認します。</li>
		<li>Ct 値に基づいて基準曲線に視覚的に未知のサンプルの数量を確認してください。 メモ: 標準曲線、希釈倍率の選択などの建設は公開プロトコル11,12,13に従って実行されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>(Ct は refence 遺伝子に正規化) ΔCt 法を用いた mRNA の遺伝子発現解析を実行します。<ol>
<li>ΔCt 値を取得する参照の遺伝子の Ct 値からターゲット遺伝子の Ct 値を減算します。</li>
		<li>平均技術の ΔCt 値をレプリケートします。</li>
		<li>プロットおよび統計ソフトウェア11,14と遺伝子発現の解析 (材料の表を参照してください)。 注: 別の方法として、遺伝子発現解析が公開プロトコル13によるとされます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Kirstein, O. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+invasive+microbiopsies%3A+a+novel+sampling+method+for+identifying+asymptomatic%2C+potentially+infectious+carriers+of+Leishmania+donovani%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+for+parasitology%22%5BJournal%5D)">Minimally invasive microbiopsies: a novel sampling method for identifying asymptomatic, potentially infectious carriers of Leishmania donovani.</a> International journal for parasitology. 47, 609-616 (2017).</li>
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</ol>

利害の対立が宣言されていません。

これらの結果を示す分子特性評価のための皮膚や血液の混合物のシンプルで低侵襲のサンプリングのためのツールとして吸水性 microbiopsy が使えます。私達のプロトコルに従ってデバイス アプリケーションは RNA 量別のアプリケーション プロトコル (図 3) と回復の違いが示すように、信頼性の高い結果を得るために不可欠です。サンプルが抽出される RNA の抽出のためのステップの処理以降のサンプル高確立したプロトコル15,16に似ていますその上吸収 microbiopsy に変更される RNA の抽出の最初の手順から別のキーの変更下流のアプリケーションの結果を改善するために水の RNase フリーの使用であります。また、この研究で使用される参照の遺伝子がRPLP0であることを言及する価値があります。RPLP0関数が別の細胞と組織の種類17の知られているは、非黒色腫皮膚癌および前癌病変18で使用するための適切な参照の遺伝子として報告されています。
デバイスの主要な限界の 1 つは、時間がかかり、潜在的、特に RNA のような敏感なサンプル サンプルの損失のチャンスを増加するデバイスから microbiopsy の除去です。それにもかかわらず、予冷却 2 mL 遠心チューブ、ドライアイスなどの滅菌処理のツールによる問題を克服できます。
吸収性の microbiopsy の使用は簡単、集中的な訓練を必要としません。従来の生検は、microbiopsy があれば RT qPCR などの確立された分子診断技術と分子特性は必要ではありません。さらに定量化し吸水性 microbiopsy のサンプリング能力を発揮、人間の皮膚組織からの RNA 抽出を含んだ前の文献を調べた。典型的な 3.0 または 4.0 mm の皮膚から、生検をパンチ、3 つの研究は、50 〜 200 抽出した RNA 量を報告している皮膚組織19,20,21mg 当たり ng。1.43 と比較する平均 (図 3)、サンプリングされた皮膚組織の重量で吸収性の microbiopsy から回収された RNA の ng は 0.29 115 範囲と予想皮膚パンチ生検研究から同じ RNA の組織比率に基づいて μ g。
問題の一部は簡単に解決することができますが、このプロトコルは潜在的な落とし穴は、ないわけです。たとえば、RNA 抽出データは、10 の保持時間 (図 3) ともかなりの変化を提案しました。問題を解決するには、1 つの潜在的なソリューションにはアプリケーション プロトコルの最適化が含まれます。力などのパラメーターは、皮膚に適用し、テストおよびサンプル抽出の変動を減らすために最適化時間を保持している必要があります。他の潜在的な問題は、サンプルの整合性と回復に影響を与える可能性がありますデバイスから microbiopsy の除去です。RNA の抽出の microbiopsy を削除することは効果的な方法が、全体の手順は面倒です, とサンプルは、プロセスの汚染にさらされるかもしれない。したがって、サンプル処理プロトコルの変更はサンプルの整合性を確保し、サンプルの損失を防ぐためにすることが望ましい。
上記の 2 つの問題が処理されると、デバイスは臨床研究のための標準的なツールになることが期待されます。デバイスは、同時に皮膚や血液のサンプルをキャプチャし、このする必要があります考慮する遺伝子発現データを分析する際に注意することが重要です。結論としては、このプロトコルは結合された皮膚と採血と相対的な遺伝子発現プロファイルの処理以降のサンプルのための簡単かつ低侵襲ツールとしての吸水性 microbiopsy の実行に関する詳細をについて説明します。

皮膚生検は皮膚をサンプリングするため皮膚科で最も重要なテクニックの 1 つと皮膚病の病理組織学的評価を通じてその後診断です。生検法には、ブレードやパンチ生検を使用して試験1の患者の皮膚に疑わしい病変を削除する専門医療機関にはが含まれます。テクニックは効果的な非常に侵略的、終点は通常分子生物学技術2,3を含む臨床研究の制限します。皮膚疾患の分子生物学的解析には、病理組織学的解析ができないし、こうして促進薬剤探索と疾患診断4,5非常に特定の生物学的情報を提供する可能性があります。その上、最も分子技術のサンプル需要は比較的小さい動物の使用の削減につながる可能性がありますと複製の大きい数を許可します。したがって、ある明確な臨床研究における分子解析を可能にし参加者のリスクを下げる方法の必要があります。
フィールドでそのような必要性に対処するため当社グループは、新規マイクロニードル ベースの診断プラットフォーム、シンプルで低侵襲の方法6の血液と混合肌の小さな量のコレクションを可能にする吸収性の microbiopsy を開発しました。この文書の目的は、臨床研究における RNA の抽出による分子の分析を容易にするツールをサンプリングとして吸水性 microbiopsy を記述するためです。
以前は、microbiopsy、皮膚組織7の小さな断片を抽出する 3 層鋼プレート デザイン製マイクロニードルから成っている皮膚 microbiopsy の最初のバージョンを説明しました。このデバイスの目新しさは、効率的な組織抽出3を許可するマイクロニードルから複数の接触ポイントから来ています。対照的に、円形皮膚生検は 1 つだけの接触ポイントを提供し、単にいくつかのケースで任意のサンプルをキャプチャすることがなく肌を涙します。皮膚 microbiopsy に基づいて、我々 は最近血液と皮膚機能のサンプリングを持つ吸水性 microbiopsy を開発しました。デバイスは、最近の疫学的研究6で資源に乏しい地域で使用可能であること示されています。
その単純な設計のため吸水性 microbiopsy は、ほんの数秒で実行でき、広範なトレーニングを必要としません。また、局所麻酔薬が必要でない、アプリケーション サイトは瘢痕を発生しません。存在のプロトコルは、分子生物学的解析の対象となる皮膚のデータを取得するトレーニング関連のサンプリングなしの研究者や医療従事者をできます。我々 は将来的に皮膚研究のルーチンになる特定のデバイスを期待します。
Microbiopsy は、分子診断技術6,8,9,10, ヒトパピ ローマ ウイルス DNA の検出、このプロトコルなどを含んだ他の皮膚病の研究で報告されているが吸収性の microbiopsy のサンプルの抽出と処理技術の詳細を説明する最初のです。さらに、これは皮膚と microbiopsy サンプルの血液細胞の相対的な遺伝子発現プロファイルを記述する最初のレポートです。

<table><tbody><tr><td><強>吸収性マイクロバイオプシーの作製とサンプリング</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>吸収性マイクロバイオプシー</td><td>Trajan Scientific and Medical</td><td>N/A</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.trajanscimed.com/ Whatmanフィルターペーパー、グレード1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WHA1001325</td><td>N/A</td></tr><tr><td>RNA抽出</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PicoPure RNA単離キット</td><td>ThermoFisher</td><td>KIT0214</td><td>プロトコルに記載されているすべての緩衝液を含む</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free 蒸留水</td><td>ThermoFisher</td><td>10977015</td><td>RNA溶出ステップにおけるRNA品質の向上</td></tr><tr><td>2.0 mL 微量遠心チューブ、滅菌済み</td><td>Thomas Scientific</td><td>1226S74</td><td>N/A</td></tr><tr><td>微量遠心分離機 5415R</td><td>Eppendorf</td><td>Z605212</td><td>N/A</td></tr><tr><td>cDNA synthesis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiFAST cDNA Synthesis Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-65053</td><td>N/A</td></tr><tr><td>CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System</td><td>Bio-Rad</td><td>1855196</td><td>N/A</td></tr><tr><td>qPCR 反応およびデータ解析</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiFAST SYBR Lo-ROX Kit</td><td>Bioline</td><td>BIO-94005</td><td>qPCR反応ステップに記載されている試薬を含む</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学接着フィルム</td><td>ThermoFisher Scinentific</td><td>4311971</td><td>N/A</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate</td><td>ThermoFisher Scinentific</td><td>4343370</td><td>N/A</td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td><td>ThermoFisher Scinentific</td><td>4485694</td><td>N/A</td></tr><tr><td>GraphPad Prism (v6.04)GraphPad</td><td></td> <td>N/A;Windows版</td><td>qPCRでのプロットと統計解析 データ解析ステップ</td></tr><tr><td>PCRプライマー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPLP0 F</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>N/A</td><td>ATC AAC GGG TAC AAA CGA GTC</td></tr><tr><td><>RPLP0 R</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>N/A</td><td>CAG ATG GAT CAG CCA AGA AGG</td></tr><tr><td>TYR F</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>N/A</td><td>TCA GCA CCC CAC AAA TCC TAA</td></tr><tr><td>TYR R</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>N/A</td><td>AAT CGG CTA CAG ACA ATC TGC</td></tr><tr><td>KRT14 F</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>N/A</td><td>CCT CCT CCC AGT TCT CCT</td></tr><tr><td>KRT14 R</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>N/A</td><td>ACA CCA CCT TGC CAT CG</td></tr><<tr><td>em>CD3E F</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>N/A</td><td>CAA AGG GGA CAA AAC AAG GAG</td></tr><tr><td>CD3E R</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N/A</td><td>GTT CTC CAG AGG GTC AGA TG</td></tr><<tr><td>em>CD19 F</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N/A</td><td>TTC TGC CTG TGT TCC CTT G</td></tr><tr><td>CD19 R</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N/A</td><td>GCG TCA CTT TGA AGA ATC TCC T</td></tr></tbody></table>

吸水性 microbiopsy サンプリングと低侵襲、同時血と肌分析のための rna の抽出

Absorbent Microbiopsy Sampling and RNA Extraction for Minimally Invasive, Simultaneous Blood and Skin Analysis

従来の皮膚生検は、化粧品に敏感な部分やその侵襲による小児のアプリケーションを含む臨床研究を制限します。ここでは、皮膚や血液の混合物の低侵襲のサンプリングのため吸収性マイクロニードル ベースのデバイス、吸収性の microbiopsy を使用するためのプロトコルについて述べる。私たちの目標は、臨床研究、皮膚疾患と臨床研究参加者のリスクを減らすのためのバイオ マーカーの確立で急速な進歩を促進するためにです。従来皮膚生検する方法と対照をなして吸収 microbiopsy 数秒以内に実行することができます、そのシンプルなデザインのための集中的な訓練を必要としません。本報告では読み込みとボランティア上のアプリケーションを含む、吸収性の microbiopsy の使用をについて説明します。その後、吸収のサンプルからの RNA を隔離する方法を示します。最後に、我々 は、定量的逆転写 PCR (RT qPCR) 血液 (CD3EとCD19) と皮 (KRT14やTYR) の mRNA 発現量を定量化するための使用を示します。述べる方法は、棚キットおよび試薬を利用します。このプロトコルでは、皮膚と同じ吸収 microbiopsy マトリックス内の血の同時サンプリング低侵襲アプローチを提供しています。我々 は、皮膚科学研究へのこのアプローチを支持する人間の倫理委員会、医師やボランティアを発見しました。

皮膚 microbiopsy のマイクロニードルが皮膚約 500 μ m の深い7を侵入することを以前報告した.皮膚 microbiopsy のマイクロニードル デザインは高吸水性 microbiopsy (図 2 a) の 1 つに似ています。血液吸収のための中間の吸収層で構成され吸収性 microbiopsy 中肌 microbiopsy には皮膚組織の機械的キャプチャ用のチャネルが含まれています。吸音層の使用はまた、マイクロニードル寸法に若干の違いにつながった (吸収: 1.50 × 0.50 × 0.21 mm 対皮膚: 1.50 × 0.50 × 0.15 mm)。
図 2 bを示していますアプリケーション サイト 5 分吸収後、肌 microbiopsies が男性ボランティアの左掌腕に適用されました。2 つのマイクロニードル デザイン間の類似性、両方のデバイスからアプリケーション サイトでした、軽微な紅斑と対等であります。両方のアプリケーションのサイトは、左の傷と 48 時間後の背後にある顕著でした。これは、この低侵襲デバイスが画面の複数アプリケーション サイトを支援するまたは定期的に実行する可能性を持っているという仮説をサポートします。
図 2 cボランティア男性の掌側のアームに適用された後吸水性 microbiopsy の吸収層の代表的な画像を表示します。図のように、皮膚のいくつかの小さな作品は、マイクロニードルの先端近く捕獲され、いくつかの血液をろ紙におこった。これはデバイスが皮膚を浸透し、皮膚と同じ吸収 microbiopsy マトリックス内で同時に血を捕獲したことを示します。図 2 dはサンプリングした後の皮膚 microbiopsy、比較のため microbiopsy の前の世代。皮膚 microbiopsy のチャネルが皮膚の小片を捕獲したが、マイクロニードルの血の量は吸収性の microbiopsy に比べて小さかった。両方のアプリケーションのサイトが 48 時間以内に顕著でした。実験では、吸収性の microbiopsy は 10 の保持時間を適用した後アプリケーション、皮膚の中 microbiopsy すぐ後にリリースされたデザインで差を適用します。
吸水性 microbiopsy の 2 つのグループがアプリケーション プロトコルに基づくこの実験に関与していた図 3 aのように、: '即時リリース' と 10年の保持 '。'即時リリース' グループのデバイスは、アプリケーションの直後にアプリケーション サイトから削除されているデバイスと同じ皮膚の元の microbiopsy プロトコルを使用して適用しました。10 の保持するため ' デバイスは、10 は、申請後の場所で開催されたグループ、サンプルのコレクションを改善するために s。吸水性 microbiopsy の 2 つのグループは、アプリケーション アプローチ可能性がありますサンプル量に与える影響を実証するセットアップされました。10 の保持時間は、アプリケーションの時間回復可能なサンプル量に影響を与えることを示す臨床的に妥当な時間として選ばれました。
RNA の量回復 2 つの吸収 microbiopsy グループから 10 の開催のための即時リリース' 0.33 ± 0.39 ng と 1.43 ± 0.88 ng をいた ' (図 3 a, n = 20)、余分な保持時間と 4 倍の増加を示唆しています。これは 10 の保持時間と吸収装置を適用するより多くの RNA 抽出の結果であることを示します。吸音層 (図 3 c) に増加した血液サンプルの存在により違いがあります。確かに、'即時リリース' グループ (図 3 b) が 10年の保持と比較して吸音層と血のような量を収集するために失敗しました ' グループ (図 3 c)。また、最もすぐにリリースされた microbiopsies が x 軸、または否定的なイベントをされた RNA の非常に低い金額を表示示唆に近かったに注意する必要があります。したがって、結果は保持時間は吸収層で吸収する血のための時間がかかることがあります、デバイスの性能に影響を与えるをだろうという仮説を検証しました。
血と皮膚サンプリング デバイスが設計されているため、qPCR は比較のために両方のデバイスのための皮膚や血液バイオ マーカーの発現を検出する使用されました。メラノサイトとKRT14実行可能な表皮のケラチノ サイト マーカーとしてのバイオ マーカーとしてチロシナーゼ、 TYRを使いました。皮膚 microbiopsy サンプルは、比較のための実験に含まれていた。図 4で示すとおり、皮膚や吸収性 microbiopsies、デザインの違いにより異なって適用されていたにもかかわらず式レベル両方の皮膚マーカー TYR KRT14によって示されるように両方のデバイスと同等のデータ。白血球細胞のバイオ マーカー (CD3E、 CD19、B 細胞と T 細胞) 皮膚 microbiopsy サンプルのよりも吸収性の microbiopsy サンプルでより普及していることがわかった。この結果, 吸収 microbiopsy は血のコレクションでより良い実行が、まだ肌の microbiopsy と比較して皮膚をキャプチャするための能力を維持 (n = 5)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58614/58614fig1.jpg"> 図 1。吸水性 microbiopsy の作製します。(a) 3 層マイクロニードル。(b) デバイスの各地。(c) 組み立てられた吸収の microbiopsy。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58614/58614fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58614/58614fig2.jpg"> 図 2。吸水性 microbiopsy は男性ボランティアの左掌腕に傷跡を残さず、皮膚や血液のサンプルを同時にキャプチャすることができた。(a) 吸収、皮膚 microbiopsies のマイクロニードルを比較。(b) アプリケーション アプリケーション後吸収、皮膚の microbiopsies 5 分で左を地します。(c、d)塗布後の吸収と皮膚 microbiopsies のニードル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58614/58614fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58614/58614fig3.jpg"> 図 3。吸水性 microbiopsy キャプチャより多くの血と RNA サンプル 10 s. の適用(デバイスをすぐに解放よりも RNA の高い量で起因した a) 10 秒後アプリケーション保持時間 (n = 20)。誤差は平均から標準偏差を表す (* * *p&lt; 0.0001)。(b, c)アプリケーションの即時リリース' と 10年の保持後吸収性の microbiopsies の代表的な写真 ' のアプローチ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58614/58614fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58614/58614fig4.jpg"> 図 4。皮膚と吸収性 microbiopsies の mRNA 発現レベルの比較 (n = 5)。参照の遺伝子RPLP0の遺伝子発現を正常化していた。誤差は平均から標準偏差を表す (*p&lt; 0.05)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58614/58614fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

この記事では、吸収性の microbiopsy テクニックを実行する方法と、皮膚や血液のシンプルで同時サンプリングのための RNA の抽出のサンプルを使用して、低侵襲な方法を示しています。

吸水性 Microbiopsy サンプリングと低侵襲、同時血と肌分析のための RNA の抽出

Conventional skin biopsy limits the clinical research that involves cosmetically sensitive areas or pediatric applications due to its invasiveness. Here, ...

この方法は、皮膚疾患のバイオマーカーの確立を促進し、また臨床研究参加者のリスクを低減することができます。この技術の主な利点は、集中的なトレーニングを必要とせず、傷跡を残さないということです。微生物検光の5分前に、空の2ミリリットル遠心管をドライアイスの上に5分間置く。使い捨て手袋を着用し、アルコール拭きで被写体上の塗布部位を消毒する前に、70%エタノールで手と工具をスプレーします。マイクロニードルに触れることなく、滅菌されたガンマ放射線パッケージからマイクロバイオプシーを取り出し、クリックが聞こえ、プランジャーが所定の位置にロックされるまでプランジャーを引っ張ります。サンプリング領域が固定位置にあるように、サンプリングする皮膚に対して、おおよそ垂直な角度で装填された装置を目指し、少なくとも1キログラムの力の中で、その装置を皮膚に塗布する。次に、トリガーを押して、デバイスを少なくとも 10 秒間保持します。デバイスが10秒前に放出された場合、血液吸収とその後の分析にも変動する可能性が高くなります。サンプルが吸収されたら、ケースからプランジャーと吸収性マイクロニードルをそっと引っ張り、滅菌鉗子を使用してマイクロニードルの2つの穴を引っ張ってプランジャーから取り除きます。ドライアイスのチューブに50マイクロリットルの抽出バッファーを加え、ドライアイスニードル側のチューブに無傷のマイクロニードルを置きます。除去プロセス中にマイクロニードルの先端が何かに触れないように注意してください。マイクロニードルチップからサンプル材料を収集し、42°Cで30分間ヒートブロックまたはウォーターバスでチューブをインキュベートするために、チューブを3〜5秒間ボルテックスします。インキュベーションの最後に、滅菌鉗子を使用してマイクロフュージチューブの上端にマイクロニードルレベルの後端を配置し、マイクロニードルの上部がキャップとチューブの間に所定の位置に保持されるようなチューブの蓋を閉じます。チューブを遠心分離して、デバイスの吸収剤層からサンプル材料を収集し、チップをバッファー溶液に浸さずに慎重にマイクロニードルを取り除くために鉗子を使用します。サンプルを再び遠心分離し、上清を新しいマイクロ遠心管に慎重に移します。次に、250マイクロリットルのコンディショニングバッファーを精製カラムフィルター膜に加え、室温で5分間インキュベーションし、遠心分離によってバッファーを希釈します。抽出したRNAサンプルに70%エタノールの50マイクロリットルを加え、穏やかな混合を行い、混合物を事前調整された精製カラムに移します。直ちにチューブを2回遠心分離してフロースルーを除去し、続いて100マイクロリットルの洗浄バッファー1で洗浄する。DNA消化の場合、調製したてのDNAインキュベーションミックスを40マイクロリットルを精製カラム膜に直接加え、室温で15分間インキュベーションし、次に40マイクロリットルの洗浄バッファー1で洗浄します。遠心分離の終わりに、100マイクロリットルの洗浄バッファー2でカラムを洗浄し、精製カラムに残留洗浄バッファーがないか確認します。精製カラムを、RNA抽出キットに用意されている0.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、ピペットの先端を精製カラムの膜に直接配置して、11マイクロリットルのRNA sPRE水をカラムに追加します。室温で2分間のインキュベーションの後、カラムを遠心分離してカラム全体にRNA sPRE水を分配し、RNAを溶出させる1回を行う。次に、cDNA合成がすぐに行われない場合は、RNAサンプルの合計をマイナス80°Cで保存します。吸収性マイクロバイオプシーマイクロニードルは、皮膚と血液の同時サンプリングの間に吸収層を有する鋼板の2層からなる。吸収性微生物叢の使用は、わずか軽度の紅斑を誘発し、48時間後には目立たない。穿刺後、マイクロニードルの先端付近に小さな皮膚が取り込まれ、血液が濾紙に吸収される。穿刺直後に吸収性マイクロニードルを取り除くと、サンプル容量およびその後の抽出mRNA量は、穿刺後10秒間保持した後に得られた量よりも著しく低くなる。同様のレベルの皮膚マーカー発現は、定量PCR分析により吸収性微生物検査およびその前身の皮膚微生物検査を使用した後に検出される。しかし、吸収性微生物検査サンプリング後に有意に高いレベルの白血球バイオマーカー発現が検出され、吸収性マイクロバイオプシーマイクロニードルは、皮膚微生物叢と同じ皮膚サンプル捕捉能力を維持しながら、採血に対してより良い性能を発揮することを示唆している。したがって、この技術を適用する際には、信頼できる結果を得るためには、提案に従ってデバイスを適用することが不可欠であることを覚えておくことが重要です。したがって、この手順に従って、リアルタイムPCRのような他の方法は、比較的遺伝子発現プロファイリングのために従うことができる。私たちはまだデバイスを開発していますが、この技術は、皮膚科の化粧品や小児科のアプリケーションのために、サンプリングを行うための臨床研究への道を開いたと確信しています。

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Research

JoVE Journal

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吸水性 Microbiopsy サンプリングと低侵襲、同時血と肌分析のための RNA の抽出

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