吸水性 Microbiopsy サンプリングと低侵襲、同時血と肌分析のための RNA の抽出

この方法は、皮膚疾患のバイオマーカーの確立を促進し、また臨床研究参加者のリスクを低減することができます。この技術の主な利点は、集中的なトレーニングを必要とせず、傷跡を残さないということです。微生物検光の5分前に、空の2ミリリットル遠心管をドライアイスの上に5分間置く。

使い捨て手袋を着用し、アルコール拭きで被写体上の塗布部位を消毒する前に、70%エタノールで手と工具をスプレーします。マイクロニードルに触れることなく、滅菌されたガンマ放射線パッケージからマイクロバイオプシーを取り出し、クリックが聞こえ、プランジャーが所定の位置にロックされるまでプランジャーを引っ張ります。サンプリング領域が固定位置にあるように、サンプリングする皮膚に対して、おおよそ垂直な角度で装填された装置を目指し、少なくとも1キログラムの力の中で、その装置を皮膚に塗布する。

次に、トリガーを押して、デバイスを少なくとも 10 秒間保持します。デバイスが10秒前に放出された場合、血液吸収とその後の分析にも変動する可能性が高くなります。サンプルが吸収されたら、ケースからプランジャーと吸収性マイクロニードルをそっと引っ張り、滅菌鉗子を使用してマイクロニードルの2つの穴を引っ張ってプランジャーから取り除きます。

ドライアイスのチューブに50マイクロリットルの抽出バッファーを加え、ドライアイスニードル側のチューブに無傷のマイクロニードルを置きます。除去プロセス中にマイクロニードルの先端が何かに触れないように注意してください。マイクロニードルチップからサンプル材料を収集し、42°Cで30分間ヒートブロックまたはウォーターバスでチューブをインキュベートするために、チューブを3〜5秒間ボルテックスします。

インキュベーションの最後に、滅菌鉗子を使用してマイクロフュージチューブの上端にマイクロニードルレベルの後端を配置し、マイクロニードルの上部がキャップとチューブの間に所定の位置に保持されるようなチューブの蓋を閉じます。チューブを遠心分離して、デバイスの吸収剤層からサンプル材料を収集し、チップをバッファー溶液に浸さずに慎重にマイクロニードルを取り除くために鉗子を使用します。サンプルを再び遠心分離し、上清を新しいマイクロ遠心管に慎重に移します。

次に、250マイクロリットルのコンディショニングバッファーを精製カラムフィルター膜に加え、室温で5分間インキュベーションし、遠心分離によってバッファーを希釈します。抽出したRNAサンプルに70%エタノールの50マイクロリットルを加え、穏やかな混合を行い、混合物を事前調整された精製カラムに移します。直ちにチューブを2回遠心分離してフロースルーを除去し、続いて100マイクロリットルの洗浄バッファー1で洗浄する。

DNA消化の場合、調製したてのDNAインキュベーションミックスを40マイクロリットルを精製カラム膜に直接加え、室温で15分間インキュベーションし、次に40マイクロリットルの洗浄バッファー1で洗浄します。遠心分離の終わりに、100マイクロリットルの洗浄バッファー2でカラムを洗浄し、精製カラムに残留洗浄バッファーがないか確認します。精製カラムを、RNA抽出キットに用意されている0.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移し、ピペットの先端を精製カラムの膜に直接配置して、11マイクロリットルのRNA sPRE水をカラムに追加します。

室温で2分間のインキュベーションの後、カラムを遠心分離してカラム全体にRNA sPRE水を分配し、RNAを溶出させる1回を行う。次に、cDNA合成がすぐに行われない場合は、RNAサンプルの合計をマイナス80°Cで保存します。吸収性マイクロバイオプシーマイクロニードルは、皮膚と血液の同時サンプリングの間に吸収層を有する鋼板の2層からなる。

吸収性微生物叢の使用は、わずか軽度の紅斑を誘発し、48時間後には目立たない。穿刺後、マイクロニードルの先端付近に小さな皮膚が取り込まれ、血液が濾紙に吸収される。穿刺直後に吸収性マイクロニードルを取り除くと、サンプル容量およびその後の抽出mRNA量は、穿刺後10秒間保持した後に得られた量よりも著しく低くなる。

同様のレベルの皮膚マーカー発現は、定量PCR分析により吸収性微生物検査およびその前身の皮膚微生物検査を使用した後に検出される。しかし、吸収性微生物検査サンプリング後に有意に高いレベルの白血球バイオマーカー発現が検出され、吸収性マイクロバイオプシーマイクロニードルは、皮膚微生物叢と同じ皮膚サンプル捕捉能力を維持しながら、採血に対してより良い性能を発揮することを示唆している。したがって、この技術を適用する際には、信頼できる結果を得るためには、提案に従ってデバイスを適用することが不可欠であることを覚えておくことが重要です。

したがって、この手順に従って、リアルタイムPCRのような他の方法は、比較的遺伝子発現プロファイリングのために従うことができる。私たちはまだデバイスを開発していますが、この技術は、皮膚科の化粧品や小児科のアプリケーションのために、サンプリングを行うための臨床研究への道を開いたと確信しています。