Name: 酵母の4D顕微鏡検査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: 学ぶ多色4D共焦点顕微鏡法で出芽酵母の細胞内小器官動態を解析する手法です。蛍光標識構造の時間追跡により、細胞生物学研究における細胞内動態の理解を深めます。

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この作業は、NIH助成金R01 GM104010によってサポートされました。NIHが出資するがんセンターサポートグラントP30 CA014599が支援する統合顕微鏡コア施設で、Vytas Bindokasとクリスティン・ラボノへの蛍光顕微鏡検査の支援をありがとうございます。

1. 準備
<ol><li>非蛍光最小NSD培地2を作る。リボフラビンの不在は、バックグラウンド細胞内緑色蛍光および関連する光毒性を減少させるものと予想される。</li>
	<li>酵母株を~23°Cで一晩成長させ、良好な通気性を持つ50mLのバッフルフラスコで5mL NSDで対数相にする。分析の約3〜4時間前に、最終的なOD600がイメージング時に0.5〜0.8となるように、新鮮なNSDで酵母培養を希釈する。</li>
	<li>コンカバリンA(ConA)の2mg/mL溶液を調調す。必要に応じて、液体窒素でこの溶液のアリコートを凍結し、-80 °Cで保存します。</li>
	<li>ConA溶液をマイクロ遠心分離機で5分間全速力で回し、イメージングを妨げる可能性のある粒子状物質を除去します。その後、きれいな35ミリメートルカバーグラス底部顕微鏡皿に上清の250 μLを追加します。15分後、dH2 Oの2mLで2〜3回洗浄し、乾燥させます。</li>
	<li>ConAコーティングされた皿に酵母培養物の250 μLを追加し、細胞が付着できるように10分待ち、2mL NSDで2〜3回静かに洗浄します。細胞を2 mLの新鮮なNSDで覆います。</li>
</ol>2. イメージング
<ol><li>63xまたは100xオイル浸漬レンズを使用してください。1.40の数値絞り(NA)で十分ですが、より高いNAレンズも使用できます。</li>
	<li>フレーム サイズを 256 x 128 (幅 x 高さ) にフォーマットします。フレームサイズを大きくする必要がある場合、共焦点顕微鏡に共振スキャナーが装備されている限り、幅を大きくしてもスキャン速度は低下しません。</li>
	<li>ズーム係数を調整して、ピクセルサイズを~80 nmにします。</li>
	<li>最大スキャン速度(通常は8 kHz)を使用します。双方向Xスキャンが使用可能な場合はオンにし、制御実験で2方向からのスキャンがレジスタに登録されていることを確認する場合。</li>
	<li>ラインの累積を 4 または 6 に設定します。平均化の代わりに累積 (合計) を使用してください。</li>
	<li>ピンホールを 1.2 エアリー ユニットに設定します。経験的に、生きた酵母細胞をイメージングする場合、この設定は1.0 Airyユニットの標準的な選択よりも多くの光子を捕捉し、解像度の顕著な損失を引き起こしません。</li>
	<li>各蛍光チャネルについて、励起波長を設定し、高感度検出器を割り当て、発光波長範囲を設定し、可能な場合はフォトン計数モードをオンにする。波長の選択は、蛍風素に依存します。一例として、485nmでGFP蛍光を励起し、495〜550nmから集め、555nmでmScarlet蛍光を励起し、562〜625nmから集める。</li>
	<li>各レーザーの強度をできるだけ低く設定します。この設定は経験的に決定する必要があります。適切な強度は、5分のムービーの終わりまでに蛍光シグナル漂白を50%以下で、騒々しいが解釈可能な画像配列を捕捉します。ここで使用される共焦点顕微鏡(材料の表を参照)では、この強度は5%の順序でレーザーパワー設定に対応しています。</li>
	<li>カバースリップから反射光を取り込まないように、ノッチフィルタまたはタイムゲーティングを使用します。タイム ゲーティングが使用可能な場合は、ゲーティング ウィンドウを 0.6 ~ 10.0 ns に設定します。</li>
	<li>ブライトフィールドイメージングをオンにし、データ収集に低感度検出器を使用します。ゲインをセルをはっきりと見えるレベルに設定します。プリズムは信頼性の高い蛍光データの捕捉を妨げるため、差動干渉コントラスト(DIC)を使用しないでください。</li>
	<li>Zステップ間隔を0.25~0.35μmに設定し、Zスタックあたり約20~25の光学切片を収集して酵母細胞全体の体積を画像化します。「下」がカバースリップに向かって移動するようなイメージングの方向性を指定します。</li>
	<li>一般的なムービーの場合は、Z スタック間の時間間隔を 2 秒に設定し、ムービーの再生時間を 5 ~ 10 分に設定します。比較的遅いダイナミクス。</li>
	<li>最後のチャンネルの明るいフィールド画像を含むLIFファイルとしてムービーを保存します。この段階では、より高いビット深度は不要であり、処理パイプラインは 8 ビット TIFF データを受け入れるように構成されています。</li>
</ol>3. デコンボリューション
<ol><li>従来の最大尤度推定アルゴリズムを使用して、逆畳み込みソフトウェアを起動します(「材料の表」を参照)。</li>
	<li>ステップ 2.13 で生成されたデータ・セットを開きます。「デコンボリューション ウィザード」を選択します。「パラメータ ウィザード」に表示される値を調べます。イメージング パラメータを検出し、正しく表示する必要があります。「屈折率」の下で、酵母細胞質を近似するために「埋め込みメッド」の値を1.40に変更します。[カバースリップ] で「起動エディタ」と「推定位置」と「OK」を選択し、カバースリップ位置を設定します。[すべての検証済み設定] と [同意] を選択します。</li>
	<li>各蛍光チャネルの「デコンボリューションウィザード」に進みます。背景推定モードとして「手動」を選択します。生データ蛍光強度プロファイルを調べて、推定背景値(通常は約0.1)を決定します。</li>
	<li>逆畳み込み設定メニューに「最大反復」値40を入力し、漂白剤補正をオフにします。推定 SNR 値 (通常は約 5.0) を入力します。「デコンボルブ」をクリックします。</li>
	<li>必要に応じて、元のデータファイルに戻り、背景とSNR値を調整し、薄暗い構造から本物の蛍光を除去することなくノイズが十分に除去されるまで、逆畳み込みを繰り返します。</li>
	<li>ブライトフィールドとデコンボルブ蛍光チャンネルをマージします。ImageJ の後続のムービー編集手順では、赤が最初、緑(存在する場合)が次に、青 (存在する場合) が次に、明るいフィールドが最後になるようなチャンネルを配置します。イメージ シーケンスを 8 ビット TIFF ファイルとして保存します。</li>
</ol>4. 漂白剤補正とムービー生成
<ol><li>デコンボルブされたイメージ シーケンスを ImageJ に読み込み、[イメージ > ハイパースタック > スタック] を選択してハイパースタックに変換します。ドロップダウンメニューから「xyzct」を選択し、チャンネル数、Zスタックスライス、タイムフレーム(http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector)を入力します。</li>
	<li>[イメージ > カラー > チャンネルを分割] を選択します。</li>
	<li>http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_correctorから入手可能なImageJプラグインを使用して、光漂白のための蛍光チャネルを修正します。そのプラグインがダウンロードされ、インストールされたら、プラグイン > EMBLtools > 漂白剤補正を選択します。[指数フィット] を選択します。</li>
	<li>ブライトフィールドと漂白剤補正蛍光チャンネルをハイパースタックにマージするには、[イメージ > カラー > マージ チャネル] を選択します。結果のハイパースタックを 8 ビット TIFF ファイルとして保存します。</li>
	<li>
<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58618/ImageJ.zip" target="_blank">このプロトコルで提供されるカスタム ImageJ プラグインをインストールします。</a>付属のドキュメントの指示に従って、イメージ シーケンスを表示、編集、および定量化し、投影された Z スタックの最終的なムービーを作成します。</li>
</ol>

<ol><li>Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+formation+of+transitional+ER+sites+and+Golgi+structures+in+Pichia+pastoris%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris.</a> Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).</li>
<li>Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D+confocal+imaging+of+yeast+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">4D confocal imaging of yeast organelles.</a> Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).</li>
<li>Losev, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+maturation+visualized+in+living+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Golgi maturation visualized in living yeast.</a> Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).</li>
<li>Papanikou, E., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+Golgi+apparatus%3A+insights+and+mysteries%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries.</a> FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).</li>
<li>Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+yeast+Golgi+cisternal+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation.</a> Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).</li>
<li>Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Budding+yeast+has+a+minimal+endomembrane+system%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Budding yeast has a minimal endomembrane system.</a> Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).</li>
<li>Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPI+selectively+drives+maturation+of+the+early+Golgi%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">COPI selectively drives maturation of the early Golgi.</a> eLife. 4, 13232(2015).</li>
<li>Rothstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting%2C+disruption%2C+replacement%2C+and+allele+rescue%3A+integrative+DNA+transformation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast.</a> Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).</li>
<li>Carlton, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+live+simultaneous+multiwavelength+four-dimensional+optical+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).</li>
<li>Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+phototoxicity+in+live+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).</li>
<li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy%2C+and+how+to+avoid+it%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (8), 1700003(2017).</li>
<li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+Image+to+ImageJ%3A+25+years+of+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li>
<li>Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+fluorescent+proteins+for+use+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A review of fluorescent proteins for use in yeast.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).</li>
<li>Day, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+deconvolution+of+very+weak+confocal+signals%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Improved deconvolution of very weak confocal signals.</a> F1000Research. 6, 787(2017).</li>
<li>Bhave, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+enlargement+in+Arf-depleted+yeast+cells+is+due+to+altered+dynamics+of+cisternal+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation.</a> Journal of Cell Science. 127, Pt 1 250-257 (2014).</li>
<li>Rossanese, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+actin%2C+Cdc1p+and+Myo2p+in+the+inheritance+of+late+Golgi+elements+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).</li>
<li>Connerly, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sec16+is+a+determinant+of+transitional+ER+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Sec16 is a determinant of transitional ER organization.</a> Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).</li>
<li>Genové, G., Glick, B. S., Barth, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brighter+reporter+genes+from+multimerized+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins.</a> BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).</li>
<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy.+3rd+edn%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn</a>. , Springer. (2006).</li>
<li>Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COPI+is+essential+for+Golgi+cisternal+maturation+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics.</a> Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).</li>
<li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy%2C+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740(2015).</li>
<li>Grimm, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+to+improve+fluorophores+for+live-cell+and+single-molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy.</a> Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).</li>
<li>Casler, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation-driven+transport+and+AP-1-dependent+recycling+of+a+secretory+cargo+in+the+Golgi%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi.</a> Journal of Cell Biology. , Epub ahead of print (2019).</li>
</ol>

著者らは、彼らが競合する金銭的利益を持っていないと宣言します。

酵母オルガネラの4D共焦点イメージングは、複数のパラメータの慎重なチューニングを必要とします。主な懸念は、光漂白と光毒性です。一般的な 4D ムービーでは、何千もの光学セクションを収集する必要があるため、レーザー照明はできるだけ低く抑える必要があります。タンパク質蛍光タンパク質タグは、タグ付けされたタンパク質16、17の発現を増加させることなくシグナルを増強するために使用することができる。スキャン速度を最大化すると、写真のダメージを抑え、Zスタックを適切に短い間隔でキャプチャできます。XYとZの両方でナイキスト限界にあるボクセルサイズは、理論的には光学セットアップ18から入手可能な情報を回復しながら、光の露出を最小限に抑えます。最終的には、光部の信号含有領域の各ボクセルは、通常、1~3個のフォトンのみを受け取ります。この情報量は、単一の Z スタックで最適なイメージングを行う場合、またはデコンボリューションに対して通常推奨される情報量をはるかに下回っています。しかし、デコン...

エンドメンブレンシステムのコンパートメントは一定のフラックスにあり、その完全な特性は生細胞イメージングを必要とします。ここでは、4D(タイムラプス3D)共焦点顕微鏡を用いて、発芽酵母の蛍光標識されたコンパートメントを可視化するプロトコルを説明します。この方法は、ピチア・パスマティスとサッカロマイセス・セレビシエ1、2、3の分泌コンパートメントのダイナミクスを追跡するために開発された。このプロトコルは、個々のシスターナが光学的に溶解可能である非積層ゴルジを有するS.セレビシアeに焦点を当てています。S.セレビシエの珍しいゴルジ組織は、ゴルジ・シスターナが最初に常駐初期ゴルジタンパク質とラベルを付け、その後、常駐後期ゴルジタンパク質を獲得しながら、それらのタンパク質を失う4D顕微鏡によるデモンストレーションを可能にしました3 、5.この遷移は、初期のゴルジタンパク質Vrg4がGFPで標識され、後期ゴルジタンパク質Sec7が単光赤色蛍光タンパク質で標識される歪みを作り出すことによって可視化することができる。個々のシスターナを追跡すると、成熟は緑から赤への変換3として観察される。このタイプの分析は、タンパク質の局在化とコンパートメントの同一性に関する貴重な情報を提供できます。たとえば、到着時刻と出発時刻をわずかにオフセットした 2 つのタンパク質は、静止画像で異なるコンパートメントにラベルを付ける場合がありますが、4D ムービーでは、異なる時点 6、 7 で同じコンパートメントにラベルを付けることができます。.したがって、4D顕微鏡検査は、そうでなければ明らかではない現象を明らかにする。
酵母コンパートメントの有益な4D顕微鏡検査は、適切な手順と機器2で達成することができます。可能な限り、蛍光タンパク質タグは、過剰発現アーティファクトを回避するために遺伝子置換8によって行われる。細胞内構造は非常に動的であることが多いため、時間の経過と同時に構造を確実に追跡するためには、4Dイメージングが必要です。ここで説明するプロトコルは、高感度検出器を備えたレーザー走査共焦点顕微鏡を採用しています。この装置によって、S.cerevisiaeの全細胞容積は、2つのs間隔が典型的である、ほぼ1〜3秒ごとに共焦点顕微鏡によってイメージ化することができる。データは、蛍光体の標識密度とその光物理学的特性に応じて、最大5〜15分間収集することができます。主なハードルは、光漂白を最小限に抑えることです。この目的のために、レーザー強度を可能な限り低く保ち、共焦点スキャン速度を最大化し、光学パラメータは、過度の光暴露を避けながら関連情報をキャプチャするためにナイキスト限界で画像するように構成されています。これらの設定はまた、光毒性を緩和することが期待され、生細胞イメージング9、10、11の間にしばしば見落とされる要因である。得られた騒々しいデータは、蛍光強度の定量を容易にするために漂白剤補正および破壊アルゴリズムで処理されます。
高品質の 4D ムービーでも、酵母コンパートメントは多数、異機種混在、およびモバイルである傾向があるため、分析は難しくなります。共焦点顕微鏡検査の本質的な制限と、長時間の4Dイメージングに必要な非最適な設定のために、互いに近い蛍光構造を解決することは困難です。この問題は、標識期間中に光学的に溶解可能な少数の蛍光構造に焦点を当てることで回避できる。コンパートメント。確実に追跡できる蛍光コンパートメントは、投影されたZスタックのムービーを見て、各時間ポイントの光学セクションがコンピュータ画面上に配列される一連のモンタージュを作成することによって識別されます。この分析では、カスタム ImageJ12プラグインを使用して、個々の構造を単独で追跡できます。
最近の方法論文は、酵母13における蛍光タンパク質の使用ならびに酵母細胞2の4D共焦点イメージングの理論および実践をカバーした。このプロトコルは、4Dイメージング実験の主要な実用的な側面に焦点を当てています。これには、前述のプロシージャに対するいくつかの機能強化と、ImageJ プラグイン コードとドキュメントの更新されたバージョンが含まれています。示されている例はゴルジダイナミクスに焦点を当てていますが、このプロトコルは他の酵母コンパートメントのイメージングにも同様に適しています。

<table><tbody><tr><td>35 mm ガラス底皿 No. 1.5</td><td>MatTek</td><td>P35G-0.170-14-C</td><td>イメージング皿</td></tr><tr><td>コンカナバリン A 粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2010</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Vector Laboratories</td><td>CB-1000</td><td></td></tr><tr><td>ライカ SP8 共焦点顕微鏡</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカ アプリケーション スイート X&nbsp;</td><td>ライカ マイクロシステムズ</td><td></td><td>顕微鏡ソフトウェア</td></tr><tr><td>Huygens エッセンシャル ソフトウェア バージョン 17.04</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td></td><td>デコンボリューション</td></tr><tr><td>ソフトウェア ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td>画像処理および解析ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

酵母の4d顕微鏡検査

4D Microscopy of Yeast

このプロトコルの目的は、発芽酵母の生細胞における膜コンパートメントの形成と形質転換を特徴付けることを特徴付ける。酵母の多くの細胞内コンパートメントは動的であり、その特性を完全に理解するには、タイムラプスイメージングが必要です。マルチカラー4D共焦点蛍光顕微鏡は、5-15分の時間スケールで細胞内コンパートメントの挙動と組成を追跡するための強力な方法です。セクション。この目的を達成するために、光漂白と光毒性は非常に低いレーザーパワーで急速にスキャンすることによって最小化され、ピクセルの次元およびZステップ間隔はフル解像度でイメージをサンプリングすることと互換性がある最も大きい値に設定される。結果として得られる 4D データ セットはノイズが多いですが、デコンボリューションによってスムージングできます。質の高いデータであっても、細胞内構造は多く、異種的で、移動性が高いため、分析段階は困難です。このニーズを満たすために、カスタムImageJプラグインは、コンピュータ画面上のアレイ4Dデータに書き込まれ、対象の構造を特定し、個々の構造を分離するためにデータを編集し、蛍光時間コースを定量化し、投影されたZスタックのムービーを作りました。4D ムービーは、成熟によってひっくり返る一時的なコンパートメントと安定したコンパートメントを区別する場合に特に便利です。このようなムービーは、コンパートメント融合などのイベントを特徴付けたり、特定の突然変異やその他の摂動の影響をテストするためにも使用できます。

ここで与えられた例は、デュアルカラー4D共焦点顕微鏡3によって可視化された2つの酵母ゴルジ・シスターナの成熟を定量化する。酵母細胞には10-15ゴルジ・シスターナエの順序で含まれており、それぞれが約2-4分の時間の経過とともに成熟し、初期のゴルジマーカーVrg4をGFPでタグ付けし、後期ゴルジマーカーSec7を赤色蛍光でタグ付けすることで可視化することができます。mCherryやmScarletなどのタンパク質。個々のcisternaラベルは、最初にVrg4マーカーでラベルを付け、次にマーカーが交換される短い遷移を経て、Sec7マーカーでラベルを付けます。
細胞は非常に移動性である複数のゴルジ・シスターナを含んでいるので、ラベリング期間全体を通して個々のシスターナに従うことを困難です。シスターナエは、多くの場合、画像データの時間的および空間的な制限を考えると、明確に解決するには近すぎます。また、ゴルジ・シ...

このプロトコルは、多色4D(タイムラプス3D)共焦点顕微鏡を用いた発芽酵母における蛍光標識細胞内コンパートメントの分析について説明する。イメージ投射パラメータは、光の損傷を制限しながら、適切な信号をキャプチャするために選択されます。カスタム ImageJ プラグインを使用すると、ラベル付き構造体を追跡し、定量的に分析できます。

酵母の4D顕微鏡検査

The goal of this protocol is to characterize how membrane compartments form and transform in live cells of budding yeast. Many intracellular compartments ...

この方法では、酵母細胞の構造を何分間かかまた3次元で追跡し、細胞内小器官やコンパートメントの動態を研究することができます。4Dイメージングは、特に一過性の構造やマーカーに関する細胞内ダイナミクスに関する信頼できる結論を導き出すことができることを保証します。手順を実証することは、私の研究室のポスドクであるナタリー・ジョンソンです。23°Cで、定義された非蛍光合成の5ミリリットル、またはNSD、培地、良好な高揚質を有する15ミリリットルのバッフルフラスコに関心のある酵母株の一晩培養を成長させることから始める。分析の3〜4時間前に、新しいNSD培地で対数相酵母培養を希釈し、600ナノメートル(OD600)で最終的な光学密度がイメージング時に0.5〜0.8になるようにします。培養の準備が整う少なくとも1時間前に、遠心分離機は、全速力で5分間、コンカナバリンA溶液あたり2ミリグラムのアリコートを全速力でペレットし、250マイクロリットルの上清をきれいな35ミリメートルガラス底顕微鏡皿に加える。15分後、1回の蒸留水を2ミリリットルで2~3回洗浄し、乾燥後にコンカナリンAコーティング皿に250マイクロリットルの酵母培養液を加える。細胞が付着するまで10分間待ち、新鮮なNSD培地を2ミリリットルで皿をさらに2〜3回静かに洗います。その後、新鮮なNSDの2ミリリットルで細胞をカバー.酵母細胞を画像化するには、共焦点光顕微鏡上で少なくとも1.4の開口を持つ63X油浸漬レンズを選択します。ここでは、63X対物レンズの代わりに100X対物レンズを使用することもできます。次に、液浸油で見つけた物を対物レンズの上に置きます。取得モードタブのドロップダウンメニューから、xyztを選択します。[XY] タブで、フレーム サイズを高さ 256 x 128 にフォーマットします。最大スキャン速度は、通常は 8 キロヘルツの順序で使用します。双方向の X スキャンが使用可能な場合はオンにし、ズーム倍率を 9 に調整すると、ピクセル サイズは約 80 ナノメートルになります。100Xの目標を使用する場合は、ズーム倍率を調整して、約80ナノメートルのピクセルサイズを維持します。次に、行の累積を 4 つまたは 6 に設定します。ピンホールを 1.2 風通しユニットに設定し、可能であれば白色光レーザーをオンにします。次に、励起波長とパーセントレーザーパワーを各蛍光チャネルに設定します。使用可能な場合は、最大統合時間の選択を解除して、設定タブでフォトンカウントモードの使用を有効にします。各蛍光チャネルに対して、高感度検出器を割り当て、発光波長範囲を設定し、光子カウントモードをオンにします(可能な場合)。ガラス皿から反射光を取り込まないように、各蛍光チャネルの時間計数を0.6~10ナノ秒に設定します。次に、明視野イメージングをオンにし、データ収集用に低感度検出器を選択します。ライブイメージングモードをオンにし、セルがはっきりと見えるまで明るいフィールドチャンネルのゲインを上げます。フォトンカウントモードの場合は、グレー値の範囲を手動から自動に変更して、蛍光信号を表示します。Zスタックを設定して酵母細胞の全容を画像化し、下がカバースリップに向かって移動するようにイメージングの方向性を指定します。Z-スタックあたり約20~25の光セクションを得るために、Zステップ間隔を0.25~0.35マイクロメートルに設定し、使用可能であればガルボフローをオンにします。一般的なムービーでは、Z スタック間の時間間隔を 2 秒に設定し、ムービーの再生時間を 5 ~ 10 分に設定します。その後、ムービーを LIF ファイルとして保存します。映画のデコンボリューションの場合は、古典的な最尤推定アルゴリズムを使用する適切なデコンボリューションソフトウェアプログラムを起動し、データシリーズを開きます。デコンボリューション ウィザードとパラメータ エディタを選択して、イメージング パラメータが検出され、正しく表示されていることを確認します。埋め込み培地屈折率の値を1.4に変更して、酵母細胞質に近似します。次に、エディタを使用してカバースリップ位置を推定します。[検証済みをすべて設定] を選択して[承諾]をクリックし、[入力ウィザード]を選択します。次の矢印をクリックして、ポイントスプレッド関数の選択とトリミング前処理ステージをバイパスし、各蛍光チャネルのデコンボリューションウィザードを進みます。計算対数垂直マッピング関数を選択し、生データ蛍光強度プロファイルを検査します。手動をバックグラウンド推定のモードとして設定し、バックグラウンド値を入力して[承認]をクリックします。最大反復回数の値を 40 のままにして、推定信号対ノイズ比を入力します。次に、漂白剤補正をオフにして、[デコンボルブ]をクリックします。ノイズが薄暗い構造から本物の蛍光を除去せずに十分に除去された場合、デコンボリューション結果ウィンドウで次のチャネルに受け入れるを選択します。すべての蛍光チャネルが十分にデコンボルブされたら、[すべて完了]をクリックし、最初に赤チャンネルを配置し、次に緑、青、明るいフィールドチャネルを配置して、ImageJでのその後の編集を行います。その後、イメージ シーケンスを 8 ビット TIF ファイルとして保存し、チャンネルごとに 1 つのファイルを選択し、変換モードとしてストレッチをコントラストします。漂白剤補正の場合は、デコンボルブされたイメージシーケンスを ImageJ にインポートし、[イメージ]、[ハイパースタック]、[スタックからハイパースタック] の順にクリックして、イメージをハイパースタックに変換します。ドロップダウンメニューからxyzctを選択し、チャンネル数、Zスタックスライス、および時間枠を入力します。写真の漂白のための蛍光チャネルを補正するには、画像、色、スプリットチャンネル、および蛍光チャンネルを選択し、プラグイン、EMBLツール、漂白剤補正、および指数フィットを選択します。次に、[画像]、[カラー]、[チャンネルの結合] を選択して、明るいフィールドと漂白補正された蛍光チャンネルをハイパースタックにマージし、その後のムービー生成と編集のためにデコンボルブと漂白補正されたハイパースタックを 8 ビット TIF ファイルとして保存します。デコンボルブおよび漂白補正されたデータセットをスケールされたモンタージュに変換するには、[プラグイン]、[IJ_Plugins]、[モンタージュシリーズを作成]を選択し、関連する8ビットハイパースタックを選択します。[開く] をクリックし、[OK] をクリックしてすべてのスライスを使用してモンタージュを作成し、もう一度 [OK] をクリックして推奨される尺度係数の値を受け入れます。8ビットTIFファイルとして元のモンタージュを保存し、プラグイン、IJ_Plugins、ハイパースタックとOKにモンタージュシリーズを選択し、すべての時間枠を含む元のモンタージュから4Dハイパースタックを作成します。元の平均投影ムービーを生成するには、まずプラグイン、IJ_Plugins、プロジェクトハイパースタック、およびOKを選択して ZProjection のデフォルトパラメータを受け入れます。平均投影ムービーを 8 ビットの TIF ファイルとして保存し、ムービーを検査して、ラベリング期間内に追跡できる個々の構造を特定します。ムービーの再生中に確実に追跡できる構造を特定し、その構造を分析用に分離することは、この手順の最も重要なステップです。次に、プラグインのユーザーガイドの指示に従って、モンタージュを編集して目的の構造を分離します。対象の構造を含む期間の編集されたモンタージュから4Dハイパースタックを作成し、編集したハイパースタックを保存します。編集した4Dハイパースタック内の孤立した構造の蛍光強度を時間の経過とともに定量化するには、「プラグイン、IJ_Plugins、編集済みムービーの分析」を選択し、Zスタック間の時間間隔を入力して、「OK」をクリックします。分離構造の最終的なムービーを作成するには、[プラグイン]、[IJ_Plugins]、[プロジェクトハイパースタック] を選択し、含める Z スタック スライスを指定し、[投影タイプ] として [平均強度] を選択して、[OK] をクリックします。編集したデータに対して元のデータを含む4Dハイパースタックを作成するには、プラグイン、IJ_Plugins、2つのハイパースタックをマージし、最初に2つ上に配置します。編集したデータに対してオリジナルデータを含む4Dハイパースタックからムービーを生成するには、「プラグイン」「IJ_Plugins」「プロジェクトハイパースタック」を選択し、含めるZスタックスライスを指定し、投影タイプとして「平均強度」を選択して、「OK」をクリックします。ここで、生データのZスタック投影の第1フレームを、同じデコンボルブおよび漂白補正データと比較することができる。同じデコンボルブおよび漂白剤補正されたムービーからのこれらのフレームは、分析された2つのシスタンナを示し、最初に緑色のバナデート耐性グリコシル化タンパク質4またはVrg4マーカーで標識し、後に赤い分泌7またはSec7遺伝子輸送タンパク質マーカーを用いた。このモンタージュは、デコンボルブと漂白剤補正されたハイパースタックから作成され、編集前と編集後の単一の時点ですべての光学セクションを表示し、選択されたシステルナエのいずれかから信号を分離できるようにします。この図では、投影された Z スタックの最終ムービーのフレームが、図の上部にオリジナルの投影と下部に編集された投影で表示されます。選択されたゴルジ・シスタンネからの緑色および赤色蛍光シグナルの定量化により、緑色のVrg4マーカーが到着し、約80秒間持続し、その後、赤いSec7マーカーが到着し、約60秒間持続し、2つのマーカー間に短い重なりが生じます。この手順を実行する場合は、有効期間を通じて明確に追跡できる構造を特定することが重要です。同じタイプの分析は、突然変異または他のタイプの特異的摂動を行った後に行うことができる。この技術は、酵母をモデルシステムとして使用して、ゴルジシステルネおよび小胞子出口部位の動的挙動を研究する道を開いた。

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