3 D ダイナミック文化システムの多層間葉系幹細胞シートの構築
2018年10月20日
この資料では、プロパティが有利な幹細胞幹細胞の多層シートを構築するため効率的かつ実行可能な方法を提供します。
幹細胞療法は、多くの疾患に対する有望な治療法として広く報告されている。そして、細胞シート技術は、細胞の保持とターゲット内の生存率を向上させるために開発されています。細胞シートの構築中、不十分な栄養供給は、幹細胞の機能の喪失のための重要な問題であり、不十分な幹細胞の特性は、最終的に生体内の治療効果に影響を与えるだろう。
利用可能な多層幹細胞シート製品を準備することを目的として、当社のチームは、細胞化された極大、心膜および細胞シート足場を開発しました。足場に基づいて、多層細胞スターターは、すぐに非ペプチド水素で構築され、動力学灌流システムは、インビトロで幹細胞の栄養供給を確保するために使用されます。乾燥したDBP足場を取り出し、黒いベースの中央に置きます。
DBP足場に白い張力リングを置き、ティッシュキャリアに貼り付けます。DBP足場が組織キャリアに完全に固定されていることを確認してください。DBP足場に100マイクロリットルの培養培地を加えます。
スキャフォールドを摂氏37度のインキュベーターに入れ、15分間浸します。培養器から細胞を取り出し、培養皿から培養液を取り出し、2ミリリットルの温かいPBSで細胞を軽く洗う。培養皿からすべてのPBSを取り出し、液体が残らないようにします。
皿に1.25%トリプシン溶液に2ミリリットルを加え、3分間細胞をインキュベートします。2ミリリットルの培養培地を添加してトリプシン効果を停止する。皿から細胞をそっと洗います。
新しい15ミリリットルの遠心チューブに細胞懸濁液を移す。重力220倍の重力で細胞を5分間遠心し、細胞沈積物を得る。上清を取り出し、細胞堆積物を拭き取ります。
3ミリリットル10%スクロース溶液で細胞を再中断します。10マイクロリットルの細胞懸濁液を吸引し、コンテンツ細胞数はヘモサイトメーターを読み取り、300万個の細胞を抽出し、新しい1.5ミリリットル遠心管で移送します。5分間、220平方根の細胞を遠心分離し、上清を完全に除去し、細胞沈降物を得る。
20マイクロリットル10%スクロース溶液を調製します。細胞を穏やかに再中断し、均一な懸濁液を得る。懸濁液の上部に20マイクロリットルのペプチドハイドロゲルを加え、Tと懸濁液を細胞に加え、DBP足場を取り出し、組織キャリアを離れ、混合物をT.吸引して微積分中央値を穏やかに吸引し、DBP足場に均等に加えます。
組織キャリアの底に1ミリリットルのカルシウムメデテートを加えます。培養皿に4ミリリットルの文化培地をそっと加え、細胞シートを現れます。培養器に細胞を2時間入れて培養する。
動的灌流系には、ガス交換用の灌流培養容器とガラス瓶が含まれる。図に示すように、組立体は動的灌流システムである。ガラス瓶に2つの水力ミリリットル培養中央値を加えます。
培養容器のチャンバーに細胞シートを挿入し、容器内に3ミリリットル培養中央値を加え、培養器に動的灌流システムを入れて、ポンプを開始する。バイポジティブリカンベントで培養コンテナを開きます。培養容器から細胞シートを取り出し、培養皿に入れます。
1つの鉗子を使用して組織キャリアを固定し、別の2つの鉗子を使用して白い張力リングを黒いベースから分離します。最後に、多層セルシートを取得する。DBP足場は透明である。
SEMの再販は、大学がキャプチャされ、コンポーネントが完全に予約されていることを示しています。細胞シートは、短い保存のために鉗子によって得られ、保持することができる。これらの細胞シートは、1.5ミリリットルの円筒形チューブに移すことができる。
例えば、幹細胞マーカーCD9OおよびCD29に対するBMFCの高陽性の細胞示しから始まるモデルとして。セル構築後、BMFCはセルシートを離れ、CD 90とCD29の高い膨張レベルを維持する。多層セル構造の構築は、プロトコルの重要なステップです。
このパン時間は、PH値がSAから中性に変化する場合に4つのヒドロゲルを必要とし、したがって、表面イオンを除去するためにスクロース溶液で細胞を洗浄することが重要である。また、細胞懸濁液とパンチヒドロゲルの体積比は、一時的な多層構造を構築するための良好な味方ではない。3D幹細胞構造の形成後、多層構造を安定させるとともに幹細胞の生存能力を維持するためには、動的灌流システムが重要であることがわかります。
培養中中央値の動的浸潤は、幹細胞が多層構造内で細胞のコンテキストを増殖し、外挿することを容易にし、また、動的培養温度計は、異なる幹細胞タイプに応じて調整されるべきである。
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概要
この記事は、望ましい幹細胞特性を有する多層幹細胞シートを構築するための効率的で実現可能な方法を提供します。この研究は、特に細胞シート構築中の栄養供給に関する幹細胞療法の課題に対処します。
研究の主要部分
科学の分野
- 幹細胞療法
- 細胞シート技術
- 再生医療
背景
- 幹細胞療法は様々な疾患に対する有望な治療法です。
- 細胞シート技術は細胞の保持と生存を向上させます。
- 栄養供給の不足は幹細胞機能の喪失につながる可能性があります。
- 効果的な治療結果を得るためには、幹細胞特性を向上させることが重要です。
研究目的
- 多層幹細胞シート製品を調製すること。
- 幹細胞の栄養をサポートする足場を開発すること。
- in vivoで幹細胞の治療効果を高めること。
使用された方法
- 細胞化された極性化された心膜と細胞シート足場の開発。
- ノナペプチド水素を用いた多層細胞の構築。
- 栄養供給のための動的灌流システムの実装。
- 細胞シート組立のための乾燥DBP足場の利用。
主な結果
- 多層幹細胞シートの成功的な構築。
- in vitroでの幹細胞への栄養供給の改善。
- 幹細胞の保持と機能の向上。
- in vivoでのより良い治療結果の可能性。
結論
- 開発された方法は、幹細胞シート構築に効率的で実現可能である。
- 栄養供給の対処は幹細胞療法の成功にとって重要である。
- 将来の応用は様々な疾患の治療効果を改善する可能性がある。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Stem cell therapy faces challenges in cell retention and survival post-transplantation, limiting therapeutic efficacy. This protocol addresses insufficient nutrient supply during in vitro culture by integrating a dynamic perfusion system with a decellularized scaffold, enhancing stem cell bioactivity and sheet stability. The approach supports scalable production of multilayered mesenchymal stem cell sheets for regenerative medicine applications.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of stem cell behavior in a 3D microenvironment that mimics native tissue architecture.
- Operational Value: Provides a reproducible platform for assessing mesenchymal stem cell marker retention (CD90, CD29) under dynamic culture conditions.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by maintaining stemness and proliferation capacity in vitro.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, multilayered cell sheets with quantifiable structural integrity for downstream functional assays.
- Operational Value: Uses RAD16-I peptide hydrogel and perfusion culture to ensure uniform cell distribution and nutrient access across layers.
- Scalability: Facilitates preparation of cell sheets compatible with forceps handling and transfer to standard tubes for biobanking or further processing.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains stem cell viability and expansion potential, critical for preclinical efficacy modeling.
- Operational Value: Dynamic perfusion system stabilizes 3D structure over 48-hour culture, reducing variability in sheet thickness and cellularity.
- Translational Continuity: Bridges discovery-stage sheet fabrication with preclinical validation by preserving stem cell phenotype.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling early-stage stem cell amplification and sheet formation prior to functional testing or in vivo implantation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on stem cell-niche interactions in a controlled, perfused 3D environment.
- Screening: Delivers assay-ready multilayered sheets with consistent cellular composition for compound or cytokine screening.
- Analytics: Enables quantitative assessment of stem cell marker preservation (e.g., CD90, CD29) as a readout of culture success.
- Translational Research: Provides a disease-relevant system for evaluating stem cell paracrine activity and engraftment potential.
- Enterprise Reuse: Scaffold and perfusion components can be standardized across projects for reproducible stem cell sheet production.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in stem cell functionality through maintained marker expression and proliferation.
- Operational Value: Standardized scaffold preparation and perfusion culture reduce batch-to-batch variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enhancing stem cell yield and viability before downstream applications.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stem cell candidates based on sheet integrity and bioactivity metrics.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell isolation, hydrogel handling, and perfusion system setup.
- Dependent on access to decellularized porcine pericardium, RAD16-I peptide hydrogel, and sterile perfusion bioreactors.
- Necessitates standardization of cell suspension-to-hydrogel volume ratios for consistent multilayer formation.
- Adaptation to other stem cell types may require optimization of perfusion flow rates and culture duration.
- Practical limitation: Manual handling steps (e.g., scaffold transfer, ring removal) introduce operator-dependent variability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
1:02
Preparations Before Cell Sheet Construction
1:39
Preparing Cells for Cell Sheet Construction
3:22
Preparing BMSCs and RAD16-I Peptide Hydrogel Mixture
4:36
In vitro Culture of 3D Multilayered Cell Sheet Using a Dynamic Culture System
5:18
Obtain the Multilayered MSC Cell Sheet
5:49
Results
6:34
Conclusion
