Name: 時空ゲスト活性型タグとしてケージの分子接着剤を用いた生細胞内の核内移行を制御 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学ぶ光誘導型核内移行法によるケージ分子接着剤タグを用いた標的薬物送達。生細胞内で量子ドットなどのゲスト分子を核に選択的に移行させる革新的なドラッグデリバリー技術を習得する。

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ナノバイオの統合、東京の大学中心を認めます。この作品は文部の若手研究 (B) (26810046) k. o. して、部分的にサポート費補助金特別推進研究 (25000005). a. r. m. のおかげで日本社会の研究奨学金のための科学振興) 若手研究者の博士課程教育リーディング (GPLLI) のためのプログラム。

1. 接着剤-R のケージでお客様の準備のタグします。
<ol><li>ボールリテーナ入り接着剤 NBD ソリューションを準備します。<ol>
<li>ボールリテーナ入り接着剤 NBD (図 1) を次の手順に説明した20を合成します。</li>
		<li>乾燥ジメチルスルホキシド (DMSO) でボールリテーナ入り接着剤-NBD (10 mM) の原液を準備します。 注: は、暗闇の中で原液を保存します。ソリューションは、水性バッファーまたは使用時の細胞培養媒体で希釈することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ボールリテーナ入り接着剤 QD ソリューションを準備します。<ol>
<li>ボールリテーナ入り接着剤 dibenzocylooctyne (ボールリテーナ入り接着剤-DBCO) の合成 (図 1)20以前の手順を説明します。</li>
		<li>乾燥 DMSO のボールリテーナ入り接着剤-DBCO (10 mM) の原液を準備します。</li>
		<li>ボールリテーナ入り接着剤-量子ドットの作製、アジ化修飾ドット (アジ化量子ドット; をまず準備します。図 3)。DMF の 400 μ L に 100 μ L のアジド PEG4 NHS エステル (図 3) のジメチル ホルムアミド (DMF、125 μ M) ソリューションを追加 (500 nM) アミン修飾 PEG (アミン QD; でコーティングされた量子ドット (Qd) のソリューション図 3)。室温で 1 h の混合物をかき混ぜなさい。</li>
		<li>24 h 3,500 分子量カットオフ (MWCO) で再生セルロース膜を使用して DMF の 800 mL に対しての得られた溶液を dialyze します。</li>
		<li>ボールリテーナ入り接着剤-DBCO 50 μ m に DMF の原液を希釈します。後透析液 (図 3) にソリューションの 200 μ L を追加し、室温で 3 h の混合物をかき混ぜなさい。</li>
		<li>再生セルロース膜 (25,000 MWCO) を使用して DMF の 800 mL に対して 24 時間の結果のソリューションを dialyze します。</li>
		<li>200 に得られた溶液を希釈 DMF の nM。</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig3.jpg"> 図 3:ボールリテーナ入り接着剤-量子ドットの作製の模式図.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
2. 顕微鏡観察の Hep3B 細胞サンプルの調製
<ol><li>イーグル最小必須培地 (実装された EMEM) 37 ° C で 5% 未満 10% 牛胎児血清 (FBS) を含む人間の肝細胞癌 Hep3B 細胞を維持 CO2。</li>
	<li>種細胞実験の前日。実装された EMEM の 8 室のガラス基板のウェルあたりの種子 5.0 × 103</li><li></ol><ol><li> </li><li><li></li><li> </li><li></li><li></li></ol><ol><li></li><li><li></li><li></li></ol><ol><li></li><li><li></li><li></li><li></li></ol><ol><li></li><li></li><li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol>

<ol><li>Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gene+therapy+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human gene therapy comes of age.</a> Nature. 357, 455-460 (1992).</li>
<li>Roth, J. A., Cristiano, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+for+Cancer%3A+What+Have+We+Done+and+Where+Are+We+Going%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going.</a> Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).</li>
<li>Verma, I. M., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENE+THERAPY%3A+Twenty-First+Century+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).</li>
<li>Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Import+Mediated+by+Nuclear+Localization+Signal+Peptide+Sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences.</a> Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).</li>
<li>Martin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+protein+targeting+to+the+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Principles of protein targeting to the nucleolus.</a> Nucleus. 6, 314-325 (2015).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+nuclear+targeting+ability+of+nuclear+localization+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Targeting%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals.</a> Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).</li>
<li>Ventura, B. D., Kuhlman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Go+in%21+Go+out%21+Inducible+control+of+nuclear+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Go in! Go out! Inducible control of nuclear localization.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 34, 62-71 (2016).</li>
<li>Watai, Y., Sase, I., Shiono, H., Nakano, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nuclear+import+by+light-induced+activation+of+caged+nuclear+localization+signal+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Regulation of nuclear import by light-induced activation of caged nuclear localization signal in living cells.</a> FEBS Letters. 488, 39-44 (2001).</li>
<li>Engelke, H., Chou, C., Uprety, R., Jess, P., Deiters, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Protein+Function+through+Optochemical+Translocation%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synthetic+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of Protein Function through Optochemical Translocation.</a> ACS Synthetic Biology. 3, 731-736 (2014).</li>
<li>Mogaki, R., Hashim, P. K., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guanidinium-based+%26%2334%3Bmolecular+glues%26%2334%3B+for+modulation+of+biomolecular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Guanidinium-based &#34;molecular glues&#34; for modulation of biomolecular functions.</a> Chemical Society Reviews. 46, 6480-6491 (2017).</li>
<li>Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Glues+Carrying+Multiple+Guanidinium+Ion+Pendants+via+an+Oligoether+Spacer%3A+Stabilization+of+Microtubules+against+Depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).</li>
<li>Okuro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+Effects+of+a+Guanidinium+Ion+Appended+Dendritic+%26%2334%3BMolecular+Glue%26%2334%3B+on+the+ATP-Driven+Sliding+Motion+of+Actomyosin%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%2C+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic &#34;Molecular Glue&#34; on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).</li>
<li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoclickable+Dendritic+Molecular+Glue%3A+Noncovalent-to-Covalent+Photochemical+Transformation+of+Protein+Hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).</li>
<li>Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Shape+Effects+of+Molecular+Glue+on+Supramolecular+Tubulin+Assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies.</a> ACS Nano. 8, 904-914 (2014).</li>
<li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+glues+for+manipulating+enzymes%3A+trypsin+inhibition+by+benzamidine-conjugated+molecular+glues%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues.</a> Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).</li>
<li>Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boronic+Acid-Appended+Molecular+Glues+for+ATP-Responsive+Activity+Modulation+of+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).</li>
<li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+Photoswitch%3A+Selective+Photochemical+Modulation+of+Enzymes+under+Physiological+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions.</a> Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).</li>
<li>Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductively+Cleavable+Nanocaplets+for+siRNA+Delivery+by+Template-Assisted+Oxidative+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).</li>
<li>Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinduced+Bioorthogonal+1%2C3-Dipolar+Poly-cycloaddition+Promoted+by+Oxyanionic+Substrates+for+Spatiotemporal+Operation+of+Molecular+Glues%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%2C+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).</li>
<li>Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+Molecular+Glues+as+Photoactivatable+Tags+for+Nuclear+Translocation+of+Guests+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).</li>
<li>Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friction-Mediated+Dynamic+Disordering+of+Phospholipid+Membrane+by+Mechanical+Motions+of+Photoresponsive+Molecular+Glue%3A+Activation+of+Ion+Permeation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-water-content+mouldable+hydrogels+by+mixing+clay+and+a+dendritic+molecular+binder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder.</a> Nature. 463, 339-343 (2010).</li>
<li>Tamesue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+versus+Dendritic+Molecular+Binders+for+Hydrogel+Network+Formation+with+Clay+Nanosheets%3A+Studies+with+ABA+Triblock+Copolyethers+Carrying+Guanidinium+Ion+Pendants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).</li>
<li>Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+passive+permeability+barrier+of+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes.</a> EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).</li>
<li>Best, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Click+Chemistry+and+Bioorthogonal+Reactions%3A+Unprecedented+Selectivity+in+the+Labeling+of+Biological+Molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Click Chemistry and Bioorthogonal Reactions: Unprecedented Selectivity in the Labeling of Biological Molecules.</a> Biochemistry. 48, 6571-6584 (2009).</li>
<li>Klán, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoremovable+Protecting+Groups+in+Chemistry+and+Biology%3A+Reaction+Mechanisms+and+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy.</a> Chemical Reviews. 113, 119-191 (2013).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

タンパク質の光トリガーの転流、細胞の核の前の調査は、ケージ NLS7,8,9を使用して達成されています。前述したように、これらのメソッドに NLS タグ付きタンパク質の細胞質を組み込む付加的な技術が必要です。対照的に、私たちボールリテーナ入り接着剤 R タグにより誘起核移行だけでなく、ゲストの細胞内取り込みできます。ボールリテーナ入り接着剤 R タグのこの機能は、生体内でアプリケーションで有利です。
ボールリテーナ入り接着剤 R タグは、量子ドットなど、細胞の核のゲスト高分子を提供できます。ここで採用されているドットが大きい直径 (DH = 15 ~ 20 nm) 核気孔より (〜 5 nm)24核に拡散できない受動的他の高分子を提供する可能性を...

遺伝情報を運ぶ、細胞核の 1 つ最も重要な細胞内小器官細胞内薬物送達ターゲットとして遺伝子複製の変調から式は、がんを含むさまざまな病気の治療に有効と遺伝1,2,3 を障害します。薬のデリバリー、ペプチドの活用は、ような核局在化信号 (NLS)4,5,6が広く検討されているタグを付けます。ただし、望ましくない副作用を減らすために核移行の時空間的制御が必要です。
以前は、ケージ NLS7,8,9を使用して、細胞の核蛋白質の光トリガー転流を実現しています。NLS は、6細胞質輸送タンパク質に結合して細胞核に移行します。報告の方法でケージの NLS を軸受ゲスト蛋白質はマイクロインジェクション8で細胞質に組み込まれてまたは遺伝コードの拡張手法9を使用してターゲット細胞で発現直接。したがって、細胞内取り込みと光誘起核移行を実現できる手法は実用的なアプリケーションのために有利です。
ここで、細胞樹状突起のケージ分子接着 (ボールリテーナ入り接着剤-R は、図 1) タグを使用してお客様の核内移行を光トリガーをについて説明します。水溶性の分子接着剤10、11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,タンパク質11,12,13,14,15、しっかりと接着した23複数区+ペンダントをベアリングが以前開発されています。 16,17, 核酸18,19、20、リン脂質膜21、そして粘土ナノシート22,23を通じて、複数の塩橋区+ペンダントとターゲットにされグループの形成。ボールリテーナ入り接着剤-R の区+ペンダントは光分解性陰イオン グループ、酪酸置換 nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) によって保護されています。ボールリテーナ入り接着剤-R が付いたお客様は生活に取り込まれ、細胞のエンドサイトーシスによってエンドソーム (図 2) でご滞在。光照射に伴い、ボールリテーナ入り接着剤-R のBANVOC グループは、アンケージ分子接着剤 (Uncaged接着剤-R) 複数の区+ペンダントを運ぶタグ ゲストの移行を容易に屈する戸建します。細胞質は細胞核 (図 2) が続きます。ボールリテーナ入り接着剤 R タグが紫外線や深刻な毒性なし二光子励起近赤外線 (NIR) ライトへの露出によってケージですることができます。高分子のお客様だけでなく、小分子ボールリテーナ入り接着剤 R タグ量子ドット (Qd) と蛍光色素 (nitrobenzoxadiazole; を使用してお客様の時空制御の核配信を紹介します。NBD) の例として、それぞれ。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig1.jpg"> ボールリテーナ入り接着剤-R の図 1: 概略構造ボールリテーナ入り接着剤-R の 9 のためのイオン (Gu+) ペンダントが酪酸置換 nitroveratryloxycarbonyl (BANVOC) グループによって保護されています。BANVOC グループは二光子励起近赤外光照射によって裂かれます。ボールリテーナ入り接着剤研究の焦点のコアは nitrobenzoxadiazole (NBD) または dibenzocylooctyne (DBCO) のいずれかで修飾します。参照20から許可を得て転載。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig2.jpg"> 図 2: お客様の核内移行を光トリガーの模式図ボールリテーナ入り接着剤 R タグを持つ共役します。ゲスト/ボールリテーナ入り接着剤 R 共役は生活に取り込まれ、細胞のエンドサイトーシスを介して。光照射に伴い、ボールリテーナ入り接着剤 R タグはタグ ゲストのエンドソーム脱出を容易にすることができますUncaged接着剤 R タグを生成するケージではありません。その後、タグ付けのゲストは、細胞核に移行します。参照20から許可を得て転載。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table><tbody><tr><td>アジド-PEG4-NHS エステル</td><td>クリックケミストリーツール</td><td>AZ103</td><td></td></tr><tr><td>Q-dot 655 ITK</td><td>Invitrogen</td><td>Q21521MP</td><td></td></tr><tr><td>再生セルロース膜 (MWCO 3,500)</td><td>日本ジェネティクス</td><td>TOR-3K</td><td></td></tr><tr><td>再生セルロース膜 (MWCO 25,000)</td><td>ハーバード大学装置</td><td>7425-RC25K</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B 細胞</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td></td></tr><tr><td>8チャンバーガラス基板</td><td>Nunc</td><td>155411JP</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル培養プレート</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>Eagle's minimal essential medium (EMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30406.02</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水 (D-PBS)</td><td>和光純薬Industries</td><td>045-29795</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Lonza Walkersville</td><td>PA-3015</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>同人堂</td><td>H342</td><td></td></tr><tr><td>Cell Counting Kit-8</td><td>同人堂</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査顕微鏡</td><td>Carl-Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>2光子励起レーザー(Mai Tai laser, Spectra-Physics)搭載</td></tr> <tr><td>共焦点レーザー走査型顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>TCS SP8</td><td></td></tr><tr><td>キセノン光源</td><td>アサヒスペクトル</td><td>LAX-102</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>分子デバイス</td><td>SpectraMax パラダイム</td><td></td></tr></tbody></table>

時空ゲスト活性型タグとしてケージの分子接着剤を用いた生細胞内の核内移行を制御

Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

細胞核は、遺伝子の複製の変調から最も重要な細胞内小器官の一つを細胞内薬物送達ターゲットとして、式は様々 な疾患の治療に有効です。ここでは、光トリガー核移行を利用するお客様のケージが複数のためイオン (Gu+) ペンダント (酪酸置換アニオン光分解性グループによって保護されて分子接着剤 (ケージ接着剤 R) タグを紹介します。nitroveratryloxycarbonyl;BANVOC)。ボールリテーナ入り接着剤-R が付いたお客様は生活に取り込まれ、細胞のエンドサイトーシスによってエンドソームのまま。しかし、光照射に伴い、ボールリテーナ入り接着剤-R がアンケージ分子接着剤 (Uncaged接着剤-R) 複数の区+ペンダントを運ぶエンドソーム脱出とゲストの後の核移行を容易にするに変換されます。このメソッドは、タグ付けのお客様は細胞核に続いて細胞質に移行できますので核ターゲット サイト選択の薬物送達のための有望な場合にのみ長。ケージ接着剤 R タグは、小分子のお客様だけでなく、量子ドット (Qd) など高分子のゲストを提供できます。ケージ接着剤 R タグは紫外線だけでなく、組織に深く浸透することができます, 二光子励起近赤外線 (NIR) ライトとケージですることができます。

、光照射前にボールリテーナ入り接着剤 NBD と培養 Hep3B 細胞展示、インテリアから点状蛍光性の放出 (λext = 488 nm;図 4 aと4 C、緑)。543 で励起による得られた類似の顕微鏡写真、エンドソームにボールリテーナ入り接着剤 NBD がローカライズされているを示す赤色蛍光色素 (図 4 b 4 C、赤) の nm。したがって、ボールリテーナ入り接着剤 NBD (図 4、緑) に割り当てることができる蛍光性の放出がヘキスト 33342 で可視化された細胞の核外観察された (λext = 710 nm、光子。図 4青)。UV...

このプロトコルでは、ケージ分子接着剤タグを使用して生きている細胞での核内移行を光トリガーについて説明します。このメソッドは、サイト選択的核ターゲット ドラッグデリバリーの有望です。

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

この方法は、特定の細胞粒状に薬物を送達する方法など、薬物送達の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ガスの核転位が光によって誘導され得る点である。この手順を実演するのは、私のグループの卒業生であるモガキ・リナと有坂昭夫です。他の場所でより詳細に記載されるようにケージ状の分子接着剤を結合したジベンゾシクロオクチンを合成して量子ドット連結ケージ分子接着剤の調製を開始する。乾燥したDMSOでジベンゾシクロオクチンに結合したケージ分子接着剤の10ミリモルのストック溶液を調製する。次に、まずアスアイを機能化した量子ドットを作ることによって、量子ドット連結ケージ分子接着剤を調製する。これを達成するために、アミン機能化ペグでコーティングされた量子ドットの500ナノモルを含むDMF溶液の400マイクロモルaseye PEG4 NHSエステルの100マイクロモルaseye PEG4のエステルを加えます。室温で1時間かき混ぜます。得られた溶液を再生セルロース膜に入れ、800mlのDMFに対して24時間透析します。次に、ジベンゾシクロオクティンをDMFで50マイクロモルに結合したケージ分子接着剤のストック溶液を希釈し、その200マイクロリットルを透析後溶液に加える。混合物を室温で3時間かき混ぜます。次に、得られた混合物を、25000の分子量を遮断した再生セルロース膜を用いて800mlの新鮮なDMFに対して24時間透析する。24時間後に得られた溶液をDMFで200ナノモルに希釈した。ヒト肝細胞癌HEP3 B細胞を、標準的な培養条件下で10%FBSを含むイーグルの最小必須培地で維持します。実験の1日前に、培養培地の200マイクロリットルの5000HEP3 B細胞を8チャンバーガラススライドの各ウェルに入れた。その後、スライドを覆い、24時間インキュベーターに入れます。翌日、培養培地を取り除き、100マイクロリットルの予温PBSで細胞を2回リンスします。8チャンバースライドの各ウェルに、蛍光染色ケージ分子接着剤の10マイクロモルを含むFBSフリー培地200マイクロリットルを加えます。3時間培養後、培養培地を取り出し、100マイクロリットルのPBSで細胞試料を2回リンスする。Endoソームを視覚化するには、LysoTracker Redなどの追加の赤色蛍光色素の100ナノモルを含む培養培地の200マイクロリットルを追加します。得られた細胞サンプルを20分間インキュベートする。その後、培養液を取り出し、100マイクロリットルのPBSで細胞試料を2回リンスする。その後、細胞を200マイクロリットルの培養培地に戻す。蛍光染色ケージ分子接着剤の核転位を誘導するために、細胞を365ナノメートルのバンドパスフィルタを装備した100ワットのキセノン光源の下に置く。細胞をU

spatiotemporally-controlled-nuclear-translocation-guests-living-cells

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

COS - 7の蛍光標識は、生細胞イメージングのためにSNAP - Tag融合タンパク質を発現する

単一分子顕微鏡は、核輸送への新たな洞察を提供approch。...

核輸送の1分子イメージング

光による小さなGTPase活性の時空間制御の方法が記載されている。このメソッドは、ラパマイシン誘発性FKBP-FRBのヘテロと写真ケージシステムに基づいています。光照射の最適化は、細胞内レベルでの低分子量GTPaseの時空間時間的制御の活性化を可能にします。...

生きた細胞の細胞内レベルでの秒のタイムスケールの上に小さなGTPase活性の時空間操作

単一分子追跡と組み合わさ光活性化局在化顕微鏡（PALM）は、生大腸菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用の直接観察及び定量化を可能にする。...

光活性化単一分子追跡を使用してライブ細菌細胞におけるタンパク質-DNA相互作用を可視化する

このプロトコルは、全反射蛍光顕微鏡を使用して、生細胞の表面上の単一の受容体を視覚化し、追跡し、それによって受容体の横方向の移動性、受容体複合体のサイズを分析し、一過性の受容体-受容体相互作用を視覚化する方法を説明しています。このプロトコールは、他の膜タンパク質に拡張することができます。...

単一分子蛍光顕微鏡による受容体ダイナミクスの高分解能時空間解析

このプロトコルでは、T リンパ球活性型ペプチド-MHC T 細胞活性化の正確な時空間制御を有効にするを使用してアクティブにするイメージング...

活性型アゴニストを用いた T 細胞活性化の空間的で、一時的なコントロール

安易な蛍光アッセイであるアミノ アミノアシル tRNA-合成酵素/tRNA ペア哺乳類細胞で発現したタンパク質に非正規のアミノ酸 (ncAAs) を組み込むことの効率を評価する. します。サイトと bioorthogonal GPCR の生きているセルのラベルを連結する光橋マッピングを含む ncAAs の G タンパク質共役受容体 (Gpcr)...

光橋マッピングおよび生きている哺乳類細胞における Bioorthogonal 化学の Gpcr にプローブを化学物質の遺伝的結合の最適化

どのように FRAP など photoactivation のマイクロ ・ photomanipulation...

マイクロマニピュレーション技術形成ダイナミクスの解析と細胞骨格のレギュレータの売り上げ高

このプロトコルは、緑色蛍光タンパク質 (GFP) の融合タンパク質マーカーとして、4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) による熱ストレス蛋白質の核移行を追跡する方法を示しますを汚します。プロトコルを汚す DAPI は速く、GFP...

緑色蛍光タンパク質タグと 4', 6-Diamidino-2-phenylindole線虫の染色によるタンパク質細胞内局在を検出

本研究では、細胞質内に送達される磁気マイクロビーズを介して細胞核に直接力を加え、生細胞蛍光イメージングを同時に行うための新しいプロトコルを提示します。...

3D磁力アクチュエータと多機能蛍光イメージングを組み合わせて核メカノバイオロジーを研究

このプロトコルでは、オプトジェネティクスツールによる核細胞質輸送の追跡から得られた生細胞イメージングデータの自動解析を効率的にセットアップし、実行する方法について説明します。...

LEXYおよびLINuSオプトジェネティクスツールと自動画像解析を使用して、生細胞の核細胞質輸送ダイナミクスを定量化します

学ぶ光誘導型核内移行法によるケージ分子接着剤タグを用いた標的薬物送達。生細胞内で量子ドットなどのゲスト分子を核に選択的に移行させる革新的なドラッグデリバリー技術を習得する。

時空ゲスト活性型タグとしてケージの分子接着剤を用いた生細胞内の核内移行を制御

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