Name: キャピラリー ゾーン電気泳動タンデム質量分析法による大規模なトップダウン プロテオミクス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 学ぶキャピラリー電気泳動タンデム質量分析法による大規模トップダウンプロテオミクス。CZE-ESI-MS/MSを用いてプロテオフォームの高感度分離と同定を行い、翻訳後修飾やタンパク質アイソフォームの機能解析を支援します。

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著者は、親切に実験のためのエシェリヒア属大腸菌のセルを提供するためミシガン州立大学化学科で Heedeok 香港のグループをありがとうございます。著者に感謝 (太陽と X. Liu) に一般的な医学の国立研究所、国立衛生の健康 (NIH) 助成金 (X. Liu) に R01GM118470 とグラント R01GM125991 からサポート。

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ここでは、単純な蛋白質のサンプルの proteoforms の高分解能特性と複雑なプロテオーム サンプルで proteoforms の大規模な同定に CZE MS/MS を使用する詳細なプロトコルを提供します。CZE-MS/MS システムのダイアグラムは、図 1に示すです。プロトコルの 4 つの重要なステップがあります。まず、キャピラリー分離の内壁の高品質 LPA コーティングの準備は非常に重要です。LPA コーティングのキャピラリー分離は、キャピラリー中で EOF を減らす、CZE の分離ウィンドウを広げるし、その内壁19へのタンパク質吸着を削減できます。LPA コーティングを作るのための重合反応実行を介してアクリルアミド (モノマー) と (重合開始剤)、過硫酸アンモニウムの混合物をトリガーする水浴のキャピラリーを加熱することによって続いて毛細管を充填、反応22。風呂の水のタイミングは重要です。あまりにも短い反応時間、不完全な反応と貧しいコーティングに します。...

トップダウン プロテオミクス (TDP)、プロテオーム内 proteoforms の大規模解析を目指します。TDP が高い複雑さのためのエレクトロ スプレー イオン化タンデム質量分析法 (ESI ・ MS/MS) 解析の前にそのままな蛋白質の効果的な液相分離とプロテオーム1,2 の大規模な濃度のダイナミック レンジに依存しています。 ,3,4,5。キャピラリー ゾーン電気泳動法 (CZE) は、彼らのサイズ-電荷比6に基づく生体分子の分離のための強力な手法です。CZE はのみ、オープン鋼管溶融シリカ毛細管、背景の電解質 (BGE)、および電源ユニットを必要とする比較的簡単です。圧力または電圧、使用して毛細血管にそのままな蛋白質のサンプルを読み込むことができ、BGE で毛細血管の両端を浸漬、高電圧を適用することによって分離を開始しました。CZE 超高分離効率のアプローチすることができます (> 100 万の理論的な版)7生体分子の分離のため。CZE MS が広く使用されている逆相液体クロマトグラフィー (市販清涼飲料水) よりも大幅に高い感度-8そのままな蛋白質の質量分析。CZE MS には、大規模なトップダウン プロテオミクスのための大きな可能性がありますが、プロテオミクスで広い応用は低いサンプル積載と狭い分離ウィンドウを含むいくつかの問題によって妨害されました。CZE でボリュームを読み込む一般的なサンプルは、通常9,nL 未満 10010,11に対応する総細孔容積の約 1% です。CZE の分離ウィンドウは、通常、強力な電気浸透流 (EOF)9,10のため 30 分以内です。これらの問題は、多数の proteoforms と複雑なプロテオームから低の豊富な proteoforms を識別するための CZE MS/MS を制限します。
CZEを介してオンライン サンプル濃度の方法 (例えば固相マイクロ抽出 [SPME]12,13、フィールド拡張サンプル スタッキング [フェス]9のボリュームを読み込むサンプルを改善するために多くの努力をなされています。,11,14、および動的 pH ジャンクション15,16,17,18)。フェスおよび動的 pH ジャンクション SPME、伝導度と pH のサンプル バッファーと、BGE の大きな違いをのみ必要とするよりも簡単です。フェスは、BGE、検体サンプル ゾーンと、キャピラリー中で BGE ゾーン間の境界上のスタッキングにつながるより多くの低い伝導性を持つサンプル バッファーを採用しています。動的 pH ジャンクションは、基本的なサンプル プラグイン (例えば、50 mM 重炭酸アンモニウム、pH 8) およびサンプル プラグの両側に酸性の BGE (例えば5% [v] 酢酸、pH 2.4) を利用します。毛細血管の射出端高正電圧のアプリケーションに基本的なサンプル プラグの滴定が発生するタイトなプラグに CZE 分離を経る前に、検体を中心します。最近、太陽グループ体系的に比較してフェスと動的 pH ジャンクションそのまま蛋白質のオンライン スタッキングのためタンパク質濃度のオンラインのフェスよりもはるかに優れた性能を作り出すことができる、動的な pH の接合部を示すときサンプル注入量総細孔容積19の 25% であった。
中立的コーティング分離毛細血管 (例えば、線形ポリアクリルアミド [LPA]) は、減速 CZE 分離し、分離ウィンドウ20,21を拡大、キャピラリー中で EOF を減らすために採用されています。最近、Dovichi グループ、毛細血管の内壁安定 LPA コーティングの準備のための簡単な手順を利用して開発過硫酸アンモニウム (APS) イニシエーターとフリーラジカル産生と重合22 の温度 (50 ° C).太陽グループは非常に最近では、ボリュームと 90 分分離ウィンドウ19ロード 1 マイクロリットル スケールのサンプルに達するキャピラリー LPA コーティング分離とそのまま蛋白質の CZE 分離の動的 pH 接合法に用いられます。この CZE システムは、大規模なトップダウン プロテオミクス CZE MS/MS を使用してドアを開きます。
CZE MS MS に CZE のカップルに非常に堅牢で敏感なインタ フェースが必要です。3 つの CE MS インターフェイスはよく発達し、CE-MS の歴史の中で実用化されている、コーアクシャル シースフロー インターフェイス23、ESI エミッタ24、多孔性の先端を使用して sheathless のインターフェイスと電気速度論的励起シース フロー インターフェイス25,26です。低 zeptomole ペプチド検出限界9に達している、電気速度論的励起シース フロー インターフェイス ベース CZE MS/MS、以上 10,000 ペプチッド識別 (Id)、hela 細胞から細胞プロテオーム単一の14、高速解析を実行そのままな蛋白質11生体分子26の高い安定性と再現性のある解析。最近、LPA コーティング分離キャピラリ、動的 pH 接合法電気速度論的励起シース フロー インターフェイスを用いてエシェリヒア属大腸菌(E. 大腸菌) プロテオーム19 の大規模なトップダウン プロテオミクス ,27。CZE MS/MS プラットフォームに近づいて単一の19とほぼ 6,000 proteoform Idを介してサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) で結合を実行以上 500 proteoform Id-市販清涼飲料水分別27。結果は、大規模なトップダウン プロテオミクス CZE MS/MS の能力を明確に示します。
ここで、大規模なトップダウン プロテオミクス CZE MS/MS を使用する詳細な手順を説明します。CZE MS/MS システム採用オンライン濃度タンパク質、MS、orbitrap に CZE を結合の電気速度論的励起シース フロー インターフェイスの動的 pH 接合法、キャピラリー中で EOF を抑える LPA コーティング キャピラリー質量蛋白質および proteoform IDによるデータベース検索のための TopPIC (TOP-Down Mass Spectrometry-Based Proteoform の同定と機能解析) ソフトウェアの MS、MS/MS スペクトルのコレクションの分析計

<table><tbody><tr><td>溶融シリカキャピ</td><td>ラリーPolymicro Technologies</td><td>1068150017</td><td>50 & micro;M I.D. 360 & マイクロ;MのO.D.</td></tr><tr><td>水酸化ナトリウムペレットマクロ</td><td>ンファインケミカルズ</td><td>7708-10</td><td></td></tr>腐食性<tr><td>LC-MSグレードの水</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>W6-1</td><td></td></tr>塩<tr><td>酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>SA48-1</td><td></td></tr>腐食性<tr><td>メタノール</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>A456-4</td><td>有毒、健康被害</td></tr><tr><td>3-(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>M6514</td><td>湿気と熱に敏感な</td></tr><tr><td>フッ化水素酸</td><td>アクロスオーガニック</td><td></td><td>423805000 高毒性</td></tr><tr><td>アクリルアミド</td><td>アクロスオーガニック</td><td>164855000</td><td>有毒、健康被害</td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>A3678</td><td>健康被害、酸化剤</td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>シトクロム C</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>ミオグロビン</td><td>Σ-Aldrich</td><td>M1882</td><td></td></tr><tr><td>&szlig;-カゼイン</td><td>Sgma-Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>炭酸脱水酵素</td><td>ΣΣ-Aldrich</td><td>C3934</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Σ-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Alfa Aesar</td><td>36428-36</td><td></td></tr><tr><td>DL-ジチオスレイトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>健康被害</td></tr><tr><td>ヨードアセアミド</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>AC122270250</td><td>健康被害</td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>A117-50</td><td>腐食性、健康被害</td></tr><tr><td>C4 トラップ カラム</td><td>Sepax Technologies</td><td>110043-4001C</td><td>3 & マイクロ;m粒子、300およびAring;細孔、内径 4.0 mm 内径 10 mm 長</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>A998SK-4</td><td>有毒、酸化剤</td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1066-33-7</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 急流フィルター</td><td>Thermo Scientific</td><td>126-0020</td><td>0.2 &micro;m CN 膜、直径 50 mm</td></tr> の<tr><td>大腸菌細胞</td><td></td><td></td><td>K-12 MG1655</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>BCA アッセイ</td><td>Thermo Scientific</td><td>23250</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A11-1</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質脱塩用HPLCシステム</td><td>Agilient</td><td>1260 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>CEオートサンプラー</td><td>CMPサイエンティフィック</td><td>ECE-001</td><td></td></tr><tr><td>エレクトロキネティックポンプシースフローインターフェース</td><td>CMPサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive HFハイブリッド四重極/オービトラップ質量分析計</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サッターフレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー</td><td>サッター機器</td><td>P-1000</td><td></td></tr>細胞<tr><td>溶解用超音波細胞破壊器</td><td>ブランソン</td><td>101063196</td><td>モデルS-250A</td></tr><tr><td>真空濃縮器</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>SPD131DDA-115</td><td></td></tr></tbody></table>

キャピラリー ゾーン電気泳動タンデム質量分析法による大規模なトップダウン プロテオミクス

Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry

キャピラリー ゾーン電気泳動-エレクトロ スプレー イオン化タンデム質量分析法 (CZE-ESI MS/ミリ秒) を特徴付ける複雑なプロテオームの proteoforms を目指して、トップダウン プロテオミクスの便利なツールとして認識されています。しかし、大規模なトップダウン プロテオミクス CZE MS/MS のアプリケーションは低サンプル読み込み容量によって妨害された、CZE の分離ウィンドウを絞り込みます。ここでは、プロトコルは、大規模なトップダウン プロテオミクス 1 マイクロリットル スケール サンプル容積と 90 分分離ウィンドウ CZE MS/MS を使用して説明します。CZE MS/MS プラットフォームは線形ポリアクリルアミド (LPA) に基づいて-コーティング分離非常に低い電気浸透流、スタッキングのタンパク質、高効率でダイナミック オンライン pH ベース接合のサンプル濃縮法と毛細血管を非常に高感度で電気速度論的励起シース フロー-MS インターフェイスの高イオン トラップ質量質量解像度とスキャン速度が。プラットフォームは、単純なそのままな蛋白質のサンプルの高解像度特性との様々 な複雑なプロテオーム proteoforms の大規模解析に使用できます。例として、標準的な蛋白質の混合物の非常に効率的な分離とプラットフォームを使用して多くの不純物の高感度検出が示されています。別の例として、このプラットフォームは以上 500 proteoform を作り出すことができるし、単一 CZE-MS/MS の大腸菌プロテオームから 190 のタンパク質同定を実行します。

図 1は、実験で使用される動的な pH ベース接合 CZE ESI MS システムの図を示しています。基本的なバッファーでサンプルの長いプラグは、LPA コーティング分離キャピラリー酸性 BGE でいっぱいに注入されます。高電圧を適用する後 I および II、分析サンプル ゾーンに集中されるを介して動的な pH 接合法。CZE MS システムのパフォーマンスを評価するには、標準的な蛋白質の混合物 (シトクロム c、リゾチーム、β-カゼイン、ミオグロビン、CA、および BSA) 通常分析します。標準蛋白質の混合物の代表的なレーザービームを図 2に示します。標準蛋白質の混合物は通常分離効率とシステムの再現性を評価し、少なくとも、実行します。図 2Bに示すように、いくつかのタンパク質の理論的な版の数の分離効率を評価で...

詳細なプロトコルは、分離、同定、キャピラリー ゾーン電気泳動-エレクトロ スプレー イオン化タンデム質量分析法 (CZE-ESI MS/ミリ秒) を使用して蛋白質のサンプルの proteoforms の特性に記述されています。単純な蛋白質のサンプルの proteoforms の高分解能特性と複雑なプロテオーム サンプルで proteoforms の大規模な同定のプロトコルを使用できます。

Capillary zone electrophoresis-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (CZE-ESI-MS/MS) has been recognized as a useful tool for top-down ...

この方法は、タンパク質アイソフォームの大規模かつ高解像度の特性評価と、細胞内のタンパク質の翻訳後修飾の向上に役立ちます。この技術の主な利点は、キャピラリーゾーン電気泳動質量分析法が、インタクトなタンパク質の高効率分離と高感度検出を提供できることです。キャピラリーを前処理するには、窒素ガスを10 psiで少なくとも12時間乾燥させます。次に、シリンジポンプを使用してメタノール中の50%体積3-プロピルメタクリレートで毛細管を充填する。キャピラリーの両端をシリカゴムで密封します。少なくとも24時間室温でインキュベートした後、テキストプロトコルに記載されているように、分離毛細血管の内壁に線形ポリアクリルアミドコーティングを続ける。毛細血管の一部を穏やかな炎で焼き、毛細血管の一端から約4センチメートル離れたポリアミド外側コーティングを取り除きます。ポリアミドコーティングを完全に除去するために拭くことによって毛細血管の焦げた部分を静かにきれいにします。200マイクロリットルチューブの端に毛細管外径と同じサイズの小さな穴を開け、この穴を通すとキャピラリーを十分に保持します。焼けた部分がチューブ内に入るまで、焼けた部分に近いキャピラリーの端を穴を通して通します。次に、HF溶液がキャピラリーの焼けた部分の約半分になるように、約150マイクロリットルのHFを200マイクロリットルチューブに加えます。HF溶液中のキャピラリーを室温で90~100分間インキュベートします。テキストプロトコルに記載されているように、標準的なタンパク質混合物と大腸菌サンプルを調製します。キャピラリーゾーン電気泳動(CZEシステム)を設定するには、サンプル、バックグラウンド電解質、および分離キャピラリーをCZEオートサンプラーにロードします。CZE 自動サンプラーの手動制御ページでサンプル荷重を選択します。バックグラウンド電解質バイアルをオートサンプラーのバッファトレイにロードし、バッファトレイ内の位置を示します。次に、サンプルバイアルをオートサンプラーのサンプルトレイにロードし、サンプルトレイ内の位置を示します。手動制御を使用して、自動サンプラーを位置合わせ位置に配置します。さて、キャピラリーの非エッチング端を使用してCZEオートサンプラーに分離毛細管をロードします。サンプルの体積が 50 マイクロリットル未満の場合は、キャピラリーの射出端の高さを調整します。手動制御を使用して、自動サンプラーをスタンバイに切り替えます。システム内のサンプル位置を入力し、キャピラリーをサンプルに移動します。キャピラリーの射出端をさらに下に押し下げて、サンプルバイアルの底部に到達します。手動制御を使用し続け、20 psiの圧力を使用して20分間、背景電解質で毛細管を洗い流す。さて、商業電気的にポンプされたシースフローインターフェースを質量分析計の前面に取り付ける。シースバッファーリザーバに、10%体積メタノールと0.2%体積のギ酸を含むバッファーを LCMS グレードの水で充填します。注射器で手動で圧力をかけ、シースバッファとのインターフェイスでTを洗い流します。エレクトロスプレーエミッタの外径1ミリメートルの端部をスリーブチューブに通し、フィッティングを介してエミッタをTの1つのポートに接続します。単にシースバッファーでエミッタを充填するために注射器で再度Tをフラッシュします。エミッタのオリフィスと質量分析計の入り口の間の距離を、インターフェースに付属のカメラの助けを借りて約2ミリメートルに調整します。シースバッファーバイアルに2~2.2キロボルトの電圧を適用してエレクトロスプレーを行います。次に、スプレー電圧を調整して安定したエレクトロスプレーに到達します。このプロセス中に毛細血管の射出端に低圧を適用して、毛細血管に気泡がないことを確認します。スプレー電圧をオフにし、分離キャピラリーのエッチングされた端をTを通してエミッタにそっと通り込み、さらに押し込めません。毛細管の注入端で低圧を停止した後、シースバッファーでエミッタを少し洗い流します。再度、スプレー電圧を2~2キロボルトにして、スプレーをテストします。メインのインストゥルメント画面のファイルドロップダウンメニューから新しい方法を選択します。そこでは、サンプルバイアルの開始として入口を選択し、サンプルバイアルを終了し、サンプルとしてトレイ、圧力を5 psi、キロボルトをゼロ、サンプル注入の場合は95秒として選択します。次いで、入口を入口バイアル、トレイを緩衝液、圧力をゼロpsi、キロボルトを30、持続時間を4,200秒として標準タンパク質混合物サンプルを分離する。大腸菌プロテオーム試料の分離のために、入口を入口バイアル、トレイを緩衝器、圧力をゼロpsi、キロボルトを20、持続時間を6,600秒に設定する。最後に、入口を入口バイアルとして、トレイをバッファとして、圧力を10 psi、キロボルトを30、キャピラリーフラッシュの場合は600秒として選択します。今度は、4倍イオントラップマスク分光計を使用して、無傷のタンパク質分析のためのMSおよびMS/MSパラメータを設定します。チューンファイルの設定を調整するには、インタクトプロテインモードをオンにして、0.2のトラップ圧力を使用します。イオン転写キャピラリー温度を摂氏320度、SレンズRFレベルを55度に設定します。CZE MS/MS実験を実行するには、まず実行シーケンスを選択して、質量分析計コンピュータでデータ取得方法を開始します。次に、キャピラリー電気泳動自動サンプラーコンピュータ上でキャピラリー電気泳動シーケンスを開始します。TopPIC スイートと TopPIC グラフィカル ユーザ インターフェイスで、TopPIC を使用してデータベース検索を実行します。データベース ファイルをクリックし、検索する適切なデータベースを選択します。スペクトルファイルをクリックし、生成されたms2を選択します。入力として生成された msalign ファイル。MS1 機能ファイルを選択し、生成された機能ファイルを選択します。ヨウドアセトアミド処理による固定修飾としてシステインカルバミドメチルC57を設定する。おとりデータベース機能を選択し、カットオフ設定で、スペクトルレベルの横にあるドロップダウンメニューで偽検出率を選択します。スペクトル レベルで誤検出率を 0.01 に設定します。生成機能を選択したまま、エラー許容値を100万分の15に設定します。プロテオフォームレベルで偽検出率を0.05に設定します。[詳細パラメータ]で、ドロップダウンメニューの質量シフトの最大数として2を選択します。未知の変更の最大質量シフトを500ダルトンに設定します。その他のパラメータはすべてデフォルト値のままにして、グラフィカルユーザーインターフェースの右下にあるスタートボタンをクリックします。標準タンパク質混合物の代表的なエレクトロフェログラムが示されている。標準タンパク質混合物は、通常、システムの分離効率および再現性を評価するために少なくとも重複して実行される。分離効率は、いくつかのタンパク質の理論プレートの数で評価することができます。再現性は、タンパク質強度と移動時間の相対標準偏差によって評価することができる。CZE MS/MSプラットフォームは、様々な複雑なプロテオームにおけるプロテオフォームの大規模な特性評価に使用でき、高い信頼度を持って1回の実行で500以上のプロテオフォームと190個のタンパク質を同定することができます。ここで、エレクトロフェログラムの視野でズームして、システムの分離窓を評価するために使用することができる。非常に低いE値およびスペクトルFDRは、プロテオフォームIDの高い信頼度を示唆している。一致した断片イオンの数が多いほど、IDの高い信頼度をさらに示している。安定同位体標識法またはラベルフリー法をCZE MS法に組み込むことで、様々な条件で細胞内のタンパク質細胞の存在量がどのように変化するかを決定することができます。この技術は、その開発後、トップダウンプロテオミクスの分野の研究者が細胞内の様々な生物学的プロセスを調節する際のプロテオフォームの役割を探求する道を開きました。フッ化水素酸の使用は非常に危険であり、適切な個人用保護具や緊急処置を実施するなどの予防措置は、常にこの手順を実行する際に行われるべきであることを忘れないでください。

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キャピラリーゾーン電気泳動タンデム質量分析法による大規模なトップダウンプロテオミクス

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