Name: 小さい干渉の RNA のマクロファージへの配信のための車両としてポリエチレンイミン被覆された酸化鉄ナノ粒子の in VitroとIn Vivo (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: 学ぶポリエチレンイミン被覆酸化鉄ナノ粒子を用いたマクロファージへのsiRNA導入法。in vitroおよびin vivoで効率的な遺伝子サイレンシングを実現し、慢性炎症性疾患やがん治療への応用が期待されます。

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この作品は、中国の国家自然科学基金 (81772308) とキー研究開発中国プログラム (第 2017YFA0205502) によって支えられました。

含む生きた動物は動物に従って実行されたすべてのメソッドは気し、中国・東南大学のガイドラインを使用します。
1. プリンスエド ワード島 SPIONs の作製
<ol><li>
オレイン酸変性 SPIONs の作製
	<ol>
<li>した FeCl3•6H2O および FeSO4•7H2O N2の保護の下で水に溶解します。<ol>
<li>ビーカーにした FeCl3•6H2O の 28 g と 20 g の FeSO4•7H2O に 80 mL の脱イオン水を追加します。ガラス管を通して水に N2を導入して固形物が溶解するまで攪拌します。</li>
			<li>アンモニア水 (28%) の 40 mL の添加に続いて 800 の rpm の撹拌速度の 72 ° C に反応混合物を加熱します。5 分間かき混ぜます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>上記の溶液に滴下オレイン酸の 9 mL を追加し、72 ° C、3 h でかき混ぜます。</li>
		<li>部屋の温度 (RT) に得られた溶液を冷却します。磁気分離によるソリューションを沈殿させます。</li>
		<li>SPIONs 3 を含む沈殿物を洗うエチルアルコールを絶対 x、その後、N-ヘキサン 100 mL で沈殿物。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ジメルカプトコハク酸変性 SPIONs の作製
	<ol>
<li>オレイン酸 (OA) の 800 mg を追加-N-ヘキサン 200 mL に分散 SPIONs を変更し、60 ° C の水浴中で 3 首フラスコにアセトン 200 mL に分散したジメルカプトコハク酸 (DMSA) 400 mg 注: 前の手順から得られる OA 変更スパイの濃度を決定するには、スパイの分散の少量 (1 mL など) を取る N-ヘキサンを揮発し、結果の粉の重量を量る。</li>
		<li>1,000 rpm で攪拌、還流と上記の溶液に滴下トリエチルアミンの 200 μ L を追加します。</li>
		<li>撹拌し、還流の 5 h は後に、、磁気分離による黒い沈殿物を取得します。</li>
		<li>水酸化テトラメチル アンモニウムを用いた水溶液の pH を調整することによって脱イオン水中の親水性の SPIONs を均一分散させます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SPIONs-PEI の準備
	<ol>
<li>PEI ソリューション (10 kDa) 2 時間 1,000 rpm で機械的攪拌下で 500 mL 三首フラスコ内に滴下 DMSA 変更スパイ コロイド溶液を追加 (WFe: Wペイ= 1:3)。 注: 電荷とプリンスエド ワード島 SPIONs のサイズは Wペイする WFeの比率によって異なります。WFe: Wプリンスエド ワード島比 1:3 は PEI SPIONs siRNA 配信に適したを合成するための良い出発点にすることができます。</li>
		<li>100 kDa の分子量カットオフと 15 mL の内容を持つ限外ろ過チューブに得られた溶液を追加します。その後、残りの溶液が 1 mL になるまで 10 分間 5,400 × g で遠心します。ボリューム 15 mL を再び作るし、上記の手順 10 を繰り返しますソリューションに脱イオン水を追加 x 最終製品を入手します。その後、0.22 μ m のフィルターを通してソリューションをフィルターし、4 ° C で最終的な製品をストア</li>
		<li>フェナントロリン17を用いた比色法によるプリンスエド ワード島 SPIONs の Fe の濃度を決定します。1 mg Fe/mL の濃度に無菌純水で PEI SPIONs を希釈し、4 ° C で保存</li>
		<li>プリンスエド ワード島スパイ ソリューション (1 mg Fe/mL) の 10 μ L を脱イオン水に 1 mL に希釈します。次に、動的光散乱装置による流体サイズ、ゼータ電位をテストします。 注: についての範囲で PEI SPIONs を準備する 30-50 nm。このサイズの範囲で siRNA 結合と細胞内取り込みに及ぼす NP サイズは重要であると表示されません。PEI SPIONs 軸受の平均電位以上 37 mV は、トランスフェクションの線量範囲に有毒であることし、安全性を確保するための細胞毒性の試金を実行必要があります。表面電荷とナノ粒子のサイズは、プリンスエド ワード島のコンテンツを調整することによって目的の範囲内で制御できます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 準備中とプリンスエド ワード島-スパイ/siRNA NPs の Agarose ゲル電気泳動
<ol><li>最終濃度 20 μ M (0.26 μ g/μ L) を生成するための水の RNase フリーで siRNA を希釈します。</li>
	<li>0、1、2、4、および 8 というラベルの付いた 5 つの RNase フリー遠心チューブを準備します。ラベルは、異なる Fe: siRNA の重量比を表します。ピペット 3 μ L のすべてのチューブ (siRNA/チューブの ~0.8 μ g) に siRNA ソリューション。</li>
	<li>プリンスエド ワード島 SPIONs の形でそれぞれ 0、1、2、4、および 8、ラベルの付いたチューブに Fe の 6.4 μ g、3.2、1.6 0.8 0 を追加します。各管の総サンプル ボリューム未満 20 μ L をまま。上下に軽くピペッティングで混ぜます。</li>
	<li>プリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合体の形成を許可する 30 分間常温混合物を孵化させなさい。この期間の間に 3% の agarose 高純度 agarose のゲルを作る。 注: (たとえば、5 または 6) 他の Fe: siRNA 比追加ペイ-スパイ-sirna 複合は準備およびテストが可能します。</li>
	<li>6 x 5 μ L のサンプルごとの DNA の読み込みバッファーの 1 μ L を追加し、慎重に混ぜます。すべてのサンプルをロードし、ブロモフェノールの青ゲルの長さの 3 分の 2 まで移行まで 5 V/cm で電気泳動を実行します。エチジウム ブロマイド (EB) 15 ~ 20 分でゲルを染色します。 注: 作りたて電気泳動バッファーと EB 液使用する必要があります。</li>
	<li>UV のイメージング システムの下で siRNA バンドを視覚化します。PEI SPIONs と錯体を形成する siRNA で Fe: siRNA 比を確認し、その結果、無料 siRNA を表すバンドが遅滞または検出されません。</li>
</ol>3. RAW264.7 マクロファージのIn Vitroトランスフェクション
<ol><li>マウスのマクロファージ様 RAW264.7 細胞 DMEM を使用して 10 cm 皿中含む 10% 牛胎児血清 (FBS) 5% CO2インキュベーターで 37 ° C で 100 μ g/mL ストレプトマイシンあたり 100 U/mL ペニシリンあたりを完了します。</li>
	<li>トランスフェクション前日細胞から培地を吸引、リン酸緩衝生理食塩水 (pH 7.4) でそれらをすすいでください。10 cm 皿に 0.25% トリプシンの 1 mL を追加します。5% CO2インキュベーターで 37 ° C で約 5-10 分のための RAW264.7 細胞を trypsinize します。</li>
	<li>ときに細胞の大半をデタッチ (5-10 分) 後、トリプシンを不活化する料理に DMEM 完全培地 5 mL を追加します。単一セルの細胞塊の分散を上下にピペットで移しなさい。</li>
	<li>細胞懸濁液を滅菌 15 mL の円錐管に転送します。それは清ルート削除で 3 分間 300 × g で遠心します。</li>
	<li>新鮮な DMEM 完全培地 5 mL で細胞を再懸濁し、セルをカウントします。</li>
	<li>プレート 9 × 104セルごと完全 DMEM 培地 2 mL で 6 ウェル プレートでよく、37 ° c 24 時間約 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。 メモ: 異なるサイズのプレートを使用している場合は、細胞のトランスフェクション時に 80% の confluency に到達できるように相対的な表面積に比例してめっきセル密度を調整します。</li>
	<li>セル密度が 80% と、細胞からメディアを取り出して、ウェルあたり DMEM 完全培地 1 mL を置き換えます。プリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合が用意されている (約 30 分) の使用のため準備ができているまでプレートをインキュベーターに戻ります。</li>
	<li>プリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合の準備: プリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合トランスフェクション実験に必要な量を計算します。1.5 mL 遠心チューブ RNase フリー、指定された Fe: siRNA の比率で siRNA を PEI SPIONs の適切な量をミックスします。例えば、4 の Fe: siRNA 比率で fe 100 μ g を含むペイ-スパイ/siRNA NPs を準備する 100 に追加 μ (1 mg Fe/mL) PEI SPIONs sirna (0.26 μ g/μ L)、96 μ L にはマイクロ ピペットをゆっくり混合すること続きます。室温 30 分間インキュベートします。 注: 任意の付随的損失の勘定合計の最終的な質量を超える 10% は、プリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合体のボリュームを準備します。低鉄: siRNA 比、する siRNA 分子は PEI SPIONs に完全に読み込まれ、潜在的な細胞毒性を最小限に抑えるためしたがって、PEI SPIONs の少量を使用できますでペイ-スパイ-sirna 複合体を作る。Fe: siRNA 比の最適化のためのパイロット実験 (遅滞ゲルの試金) が必要です。</li>
	<li>インキュベーター (ステップ 3.7) から 6 ウェル プレートを取り出してください。各ウェルに滴下ペイ-スパイ-sirna 複合体の必要なボリュームを追加し、均一な配分を確保するように慎重にプレートを旋回します。細胞摂取または遺伝子ノックダウン効率 (1-3 d) の評価まで、インキュベーターにプレートを返します。 注: ~ 15 μ g 鉄/mL の濃度でペイ-スパイ/siRNA 株マクロファージが潜在的な細胞毒性を最小限に抑えながらトランスフェクション効率を最大化します。</li>
</ol>4. 実験的関節炎ラットにおけるマクロファージへの siRNA の全身配信
<ol><li>7 週齢は、特定の病原体フリー男性 Wistar ラットを取得します。7 d 使用前のラットを慣らすし、十分な食料と水を提供します。上記18としてラットにアジュバント関節炎 (AA) を誘導します。</li>
	<li>プリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合 3.8 の手順で説明するように準備します。</li>
	<li>AA ラット経由尾静脈にプリンスエド ワード島-スパイ/siRNA NPs (0.3 mg/kg の siRNA の) を挿入します。細胞内取り込みを介して、例えば、フローサイトメトリー、組織体内を介して、例えば、リアルタイム蛍光イメージング システム、評価や治療効果に基づいて、例えば、臨床的、組織学的、およびレントゲン写真希望の時間に分析は、18 ををポイントします。 注: 細胞およびティッシュの体内研究目的の NPs 内の単回投与でラットを扱う治療学 3 週連続週 × テスト 1 NPs でラットを注入します。</li>
</ol>

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</ol>

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マクロファージは、エレクトロポレーション、カチオン性リポソーム、脂質種などの一般的に使用される nonviral アプローチを使って耐火物。ここでマクロファージ siRNA を使って信頼性と効率的な方法について説明しました。現在のプロトコルを使用して、以上マクロファージのような未加工 264.7 のセル (図 2 b) とラット腹腔マクロファージ18の 90% ことができることをトランスフェクトした siRNA 細胞生存率の有意な障害なし。このメソッドは、酸化鉄のコアと PEI のシェルから成るナノキャリアは配信プラットフォーム ペイ-スパイに依存します。つまり、プロトコルの最初のキーのステップは PEI SPIONs siRNA 配信に適した合成。通常、PEI コーティング SPIONs から用意されてオレイン酸コーティング SPIONs、オレイン酸が直接交換 SPIONs の表面から PEI またはその誘導体15、配位子交換法による正荷電を持つ親水性の NPs を生成します。表面...

マクロファージは、さまざまな量とはいえ体のすべての組織に分布する自然免疫系細胞の種類です。様々 なサイトカインや他のメディエーターを生産することによって、彼らは、微生物病原体の侵入に対する生体防御、損傷組織の修復、1組織の恒常性を維持するために重要な役割を果たします。その重要性のためマクロファージ継続的に集中的な研究の対象とされています。しかし、にもかかわらずその、遺伝子機能研究の有病率、siRNA による遺伝子サイレンシングはためマクロファージでは成功しにくいこれらの細胞、特に、プライマリ マクロファージ-transfect に困難が多い。これは毒性細胞膜は化学的に最もよく確立されたトランスフェクション アプローチに関連付けられている時 (例えばポリマーと脂質) の比較的高度に起因することができますまたは物理的に (例えば、電気穿孔法によると遺伝子銃) 中断 siRNA 分子マクロファージの生存率2,3を大幅に削減、膜を通過させる。さらに、マクロファージが専用食細胞分解酵素が豊富です。これらの酵素は、siRNA、特定遺伝子の siRNA は、細胞3,4に配信されている場合でも、その沈黙の効率を弱体化の整合性を損なうことができます。したがって、効果的なマクロファージ標的 siRNA 送達は配信4整合性および siRNA の安定性を保護する必要があります。
ますます機能不全マクロファージが開始し、自己免疫疾患、動脈硬化、癌などの特定の一般的な臨床疾患の進行に関与していることは明らかです。このためと、例えば、siRNA、マクロファージの機能を調節することは、これら疾患5,6,7を治療するための魅力的な方法論として発展しています。多くの進歩を遂げて、siRNA を用いた治療戦略の主要な挑戦は全身投与の siRNA とマクロファージは、望ましくない副作用につながる不十分な siRNA 吸収の悪い細胞の特異性。最適な細胞選択性に乏しいし、頻繁にオフ対象薬物ロードのナノ粒子 (NPs)、細網内皮系によってキャプチャされるの彼らの自発的な傾向により、副作用につながる無料核酸治療薬と比較してください。大食細胞は生体内で、最小限の副作用8と治療効果の向上を可能にする、受動的ターゲティングを設計することができます。無機ナノキャリア、様々 なリポソームや高分子9現在 NPs RNA 分子の配信のために探検が含まれます。その中でも、ポリエチレンイミン (PEI)、カチオン性高分子結合し、安定した NPs に核酸を凝縮できるのタイプは容量9,10を提供する最高の RNA を示しています。PEI は、核酸の酵素的及び非酵素的分解を防ぐ、セル膜を渡る彼らの転送を仲介する、自分の細胞内放出を促進します。当初 DNA 配信試薬として導入されたが、プリンスエド ワード島その後体内siRNA 配信、いずれかのローカルまたは全身9,10の魅力的なプラットフォームとなることを示した。
超常磁性酸化鉄ナノ粒子 (SPIONs) は、生物医学、その磁気特性、生体適合性、生物学的に重要なオブジェクト、高表面面積、体積比に匹敵するサイズのために偉大な約束を示していると容易に適応病原体の添付ファイル11面。例えば、造影剤とマクロファージによる急速な吸収としてその潜在的なユーティリティのため SPIONs は、イメージ組織マクロファージ12好きな臨床ツールとして浮上しています。文献にはためのキャリアとして SPIONs のいくつかのレポートが含まれています SPIONs は核酸配信車11,13,14,15、我々 の知識としては広く研究もされている中マクロファージ標的 siRNA 送達。SPIONs による遺伝子デリバリーの彼らの表面は親水性カチオン性ポリマー、負荷電の核酸静電魅了できテザーの層でコーティング通常。その表面が低分子量 (10 kDa) 分岐プリンスエド ワード島 (PEI SPIONs) と変更された SPIONs を合成する方法を紹介します。これらの磁気 nanoplatforms の採用 siRNA は、細胞への siRNA トランスポートを有効にするプリンスエド ワード島-スパイ-sirna 複合を形成を凝縮していますし。我々 は、細網内皮のシステム16の細胞によって SPIONs の自発的な貪食能を理由バインディングの強力な能力と相まって、PEI SPIONs に siRNA の効率的な輸送に適したレンダリングしますペイによる核酸を凝縮マクロファージ。ここで表示されるデータは、PEI スパイ/siRNA による遺伝子サイレンシング文化だけでなく、体内のマクロファージの可能性をサポートします。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>37°Cで暖かい。使用前のCウォーターバス</td></tr> ウ<tr><td>シ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>A31608-02</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (1.5 ml)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>テトラゾリウムベースのMTSアッセイキット</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>細胞毒性分析用</td></tr><tr><td>RAW 264.7 細胞株</td><td>Cell Bank of Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China</td><td>TCM13</td><td></td></tr><tr><td>組織培養プレート (6ウェル)</td><td>コーニング</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>組織培養皿(10 cm)</td><td>コーニング</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>RNaseフリーチューブ(1.5 ml)</td><td>AXYGEN</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>遠心チューブ(15 ml)</td><td>コーニング</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Wistarラット</td><td>上海実験動物センター中国 アカデミー科学</td><td></td><td></td></tr><tr><td>バチルス・カルメット&ndash;グーユーキュート;凛凍結乾燥粉末</td><td>National Institutes for Food and Drug Control, China</td><td></td><td>for inducing adjuvant arthritis in rats</td></tr><tr><td>siRNA</td><td>GenePharma (上海, 中国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cy3-siRNA</td><td>RiboBio (広州, 中国)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン (10 kDa)</td><td>Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>E107079アンモニア水</td><td>アラジン化学試薬株式会社</td><td></td><td></td>A112077</tr><tr><td>オレイン酸</td><td>アラジン化学試薬(株)</td><td></td><td></td>O108484</tr><tr><td>ジメチルスルホキシドア</td><td>ラジン化学試薬株式会社</td><td></td><td></td>D103272</tr><tr><td>FeSO4&ブル;7H2O</td><td>Sinopharm化学試薬Co.、</td><td></td>FeCl3&bull 10012118<td></td></tr><tr><td>株式会社;6H2O</td><td>Sinopharmの化学試薬Co.、株式会社</td><td>10011918</td><td></td></tr><tr><td>Dimercaptosuccinic酸</td><td>のアラジンの化学試薬Co.、株式会社。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D107254限外ろ過管</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylammonium hydroxideの解決</td><td>アラジンの化学試薬Co.、株式会社。</td><td></td><td></td>T100882</tr><tr><td>粒度・ゼータ電位計</td><td>イギリス・マルバーン</td><td>Nano ZS90</td><td></td></tr></tbody></table>

小さい干渉の rna のマクロファージへの配信のための車両としてポリエチレンイミン被覆された酸化鉄ナノ粒子の in vitroとin vivo

Polyethyleneimine-coated Iron Oxide Nanoparticles as a Vehicle for the Delivery of Small Interfering RNA to Macrophages In Vitro and In Vivo

免疫応答の調節に重要な役割のためマクロファージは集中的な研究の対象とされている継続的に、自己免疫疾患、動脈硬化、癌などの多くの疾患で有望な治療上のターゲットを表します。プローブおよびマクロファージ機能を操作する任意の貴重なアプローチは、RNAi による遺伝子サイレンシングただし、マクロファージ siRNA トランスフェクションが頻繁に技術的に挑戦すると考慮し、現時点では、マクロファージに siRNA に専念ほとんど方法論 。ここでは、大食細胞への siRNA のターゲット配信の手段としてポリエチレンイミン被覆された超常磁性酸化鉄ナノ粒子 (PEI SPIONs) を使用してのプロトコルを提案する.プリンスエド ワード島 SPIONs は、バインドおよび Fe: siRNA の重量比が 4 になったら完全に siRNA を凝縮、上記が可能です。生体外で、これらのナノ粒子が効率的に提供 siRNA プライマリ マクロファージとマクロファージのような未加工 264.7 のセル行の transfection のため最適な用量での妥協のセル実行可能性なしに、最終的には、彼らを誘導します。siRNA を介したターゲット遺伝子の沈黙。体外siRNA トランスフェクションに使用されている、離れて PEI SPIONs、また体内のマクロファージに siRNA を配信する有望なツールです。その磁気特性と遺伝子サイレンシングの能力の機能の組み合わせの観点から全身投与のペイ-スパイ/siRNA 粒子は、マクロファージの機能を調節するのみならず、マクロファージをイメージして追跡を有効にするを期待されています。PEI SPIONs が大食細胞への siRNA 配信簡単、安全、かつ効果的 nonviral プラットフォームを表します本質的の in vitroとin vivoの両方。

サイズとゼータ 29 48 nm の範囲、PEI SPIONs このプロトコルで準備の潜在性 (多分散性インデックス: 0.12 - 0.23) と 30 48 mV、それぞれ。12 ヶ月以上明らかな集計なしの 4 ° C で水に安定していた。彼らの siRNA の結合能を評価するには、PEI SPIONs Fe: siRNA 重量比はさまざまな siRNA と混合。図 1は、Fe: siRNA の重量比に達する 4 から無料 siRNA のバンドは完全に行方不明、PEI SPIONs に成功した siRNA バインドを意味を示します。バイオ医療応用でプリンスエド ワード島の主要な関心事はその毒性の高分子量および高用量に特に強い正の電荷の結果であります。図 2 a、プリンスエド ワード島-SPIONs、ゼータとの潜在的な示すように、30.5 と 37 の mV は 30 μ g 鉄/mL、二倍の濃度 (15 μ g/mL の Fe) より高い通常セルの ...

ポリエチレンイミン (PEI) を使用しての方法を述べる-siRNA 株マクロファージの超常磁性酸化鉄ナノ粒子をコーティングします。これらのナノ粒子は効率的に大食細胞の体外および体内と沈黙のターゲット遺伝子の発現を siRNA を提供できます。

小さい干渉の RNA のマクロファージへの配信のための車両としてポリエチレンイミン被覆された酸化鉄ナノ粒子の in VitroとIn Vivo

Because of their critical role in regulating immune responses, macrophages have continuously been the subject of intensive research and represent a ...

このメジャーは、主要な質問に答えるのに役立ちます。人間学の分野で。その答えは、病理学的状態に対する生理学的終わりの下でのマクロファージの機能における。この技術の主な利点は、ポリエチレンイミンコーティングが細胞を損なうことなく効率的にen vitroを可能にすることです。最適な用量の下で.この技術の意味は、多くの慢性炎症性疾患および癌の治療および診断に及ぶ。マクロファージが病因に不可欠な役割を果たす場所。手順を実証するナジアになります。私の研究室の大学院生。そして、カイシュアン・ワンはシャオフア博士の研究室の大学院生です。アリン酸修飾超常磁性酸化鉄ナノ粒子またはSPIONの最初の調製物は、塩化6水和物のファラスの28グラムを追加します。そして20グラムのファラは、80ミリリットルの脱イオン水を含むビーカーにヘプタハイドレートを自液する。そして、溶液に窒素を導入するためにガラス導管を使用しています。固形物が溶けるまで撹拌する。反応混合物を1分800回転で攪拌しながら摂氏72度に加熱します。そして、ビーカーに28%アンモニア水の40ミリリットルを追加します。5分後、9ミリリットルのアリル酸ドロップを賢明に加えます。そして、連続攪拌で3時間摂氏72度で混合物を維持します。インキュベーションの終わりに、得られた溶液を室温まで冷却する。そして、標準的なプロトコルに従って磁気分離を介して混合物を沈殿させる。次いで沈殿を含むSPIONを絶対エチルアルコールで3回洗浄します。そして、100ミリリットルのn-ヘキサンで沈殿物をアスペルスする。ジマーカプトアクリル酸を調製するために、SPIONの加えて800ミリグラムのアリン酸を加えたSPIONを修正した。200ミリリットルのn-ヘキサンと400ミリグラムのジマーカプトアクリル酸に分散し、200ミリリットルのアセトンを摂氏60度の水浴中の3つの首のフラスコに分散させた。次に、1分間に1000回転で攪拌し、還流して、フラスコに200マイクロリットルのトリエチルアミンドロップを加えます。黒色沈殿は、5時間後の磁気分離により得られる。次に、水酸化テトラメチルアンモニウムを使用して、脱イオン水中の親水性SPIONの均質分散液のpHを調整します。縮退ポリエチレンイミンは、SPIONを付加し、ジマーキャプトをアクリル酸修飾SPIONのコロイド溶液を10キロダルトンポリエチレンイミン溶液にドロップします。500ミリリットルの3つの首のフラスコで、1分間に1000回転で機械的に2時間攪拌する。インキュベーションの終わりに、100キロダルトンの分子量と15ミリリットルの含有量を遮断した超濾過チューブに得られた溶液を追加します。残りの溶液が1ミリリットルの体積に達するまでサンプルをセントラフを使用します。溶液に脱イオン水を加え、体積を15ミリリットルに戻します。そして、ちょうど実証したように、ソリューションをセントラフィンスして水分補給します。その後、摂氏4度で保存するための22ミクロンのフィルタを介して溶液をフィルタリングします。siRNAナノ粒子を調製するには、最初に調製した20マイクロモルsiRNA溶液の3マイクロリットルを5つの標識RNAの無料マイクロセントロアフィンスチューブに追加します。0、8、1.6、3.2、6.4マイクログラムのポリエチレンイミンSPIONをそれぞれゼロ、1、2、4、8とラベル付けしたチューブに加えます。穏やかなピペットと混合した後、ポリエチレンイミンSPION siRNA複合体を形成できるように、室温で30分間サンプルをインキュベートします。そして、I純度アガロースで3%アガロースゲルを調製する。インキュベーションの最後に、各チューブにサンプル5マイクロリットルあたり6X DNAローディングバッファーの1マイクロリットルを追加し、慎重に混合します。その後、すべてのサンプルをゲルにロードします。そして、5ボルト/センチメートルで電気泳動を実行します。ブロモフェノールブルー染料がゲルの長さの3分の2を移行するまで。トランスフェクションの1日前に、PBSでRAW264.7細胞培養のようなマウスマイクロファージを洗浄する。そして、5%の二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で5〜10分間、25%トリプシンの1ミリリットルで細胞を処理します。大部分の細胞が切り離されている場合。完全なDMENの5ミリリットルでトリプシンを不活性化します。次いで、溶液を数回ピピートして、任意の細胞クラスターを分散させる。細胞懸濁液を無菌15ミリリットルのコナッケルチューブに移して遠心分離します。その後、カウントのための新鮮な完全なDMENの5ミリリットルで細胞を再中断します。完全なDMEN濃度のミリリットル当たり4.5倍の4番目の細胞に細胞を希釈します。そして、細胞培養インキュベーター中の24時間のインキュベーションのために6つのウェルプレートの各ウェルに培地の2ミリリットルを追加します。翌日、ポリエチレンイミンSPION siRNAナノ粒子の適切な比率を、ちょうど実証したように穏やかな混合で1.5ミリリットルのRNAストリームマイクロ遠心チューブで調製する。そして、ポリエチレンイミンSPION siRNAナノ粒子複合体の適切な体積を、1ミリリットルの新鮮な培地に置き換えられた各ウェルに添加します。ポリエチレンイミンSPION si複合体を調製します。この例ではポリエチレンイミンSPIONの多くの月は、このようにそれらの潜在的な毒性を最小限に抑えて使用することができます.その後、プレートを慎重に旋回して、ウェルボトム全体にナノ粒子の均等な分布を達成します。その後の細胞更新または遺伝子ノックダウン欠損解析まで、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。ゼータ電位30.5および37ミリボルトのポリエチレンイミンSPIONは、1ミリリットル当たり30マイクログラムまでの濃度で明らかな細胞毒性を示さない。これは、通常、細胞トランスフェクションに使用される濃度よりも約2倍のレンタルです。ポリエチレンイミンSPIONのゼータポテンシャルは48ミリボルトですが有毒です。検査された最低用量でも。フローサイトメトリーで分析したように、細胞の90%以上は、1ミリリットル当たり15マイクログラムの鉄で蛍光標識ポリエチレンイミンSPION siRNA複合体でトランスフェクトすることができます。青い染色を破砕することによって細胞内在化に及ぼすポリエチレンイミンSPION siRNA濃度の影響の評価は、1ミリリットル当たり7.5マイクログラムの鉄での最小検出可能な染色を明らかにする。しかし、ポリエチレンイミンSPION siRNA取り込みの飽和のために鉄のより高い濃度で増加しない1ミリリットル当たり鉄の15マイクログラムではっきりと目に見えるスポット。ポリエチレンイミンSPIONの収容特異的なsiRNAを有する腹膜マクロファージは、非特異的なsiRNAと比較してタール系mRNAレベルの有意な減少を示す。siRNAがエンドサイトージクルから細胞質に脱出してRNA干渉機械に到達できることを示唆する。さらに、CD11b陽性およびCD3陽性細胞のポリエチレンイミンSPION siRNAナノ粒子複合体の単回投与の静脈注射後、CD11bによってナノ粒子のより効率的な取り込みを明らかにし、CD11bによってマクロファージを発現するマクロファージをCD11bによって、検査した全臓器の任意の時点で行う。この手順を試みている間に、37ミリボルト以下の平均データ電位を有するポリエチレンイミンSPIONを調製し、低鉄対siRNA比でポリエチレンイミンSPION siRNA複合体を調製することを忘れないでください。この技術は、研究者が癌などのヒト疾患の動物モーターにおけるマクロファージを標的とする治療可能性を探求する必要性を比較する。

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Research

JoVE Journal

Medicine

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学ぶポリエチレンイミン被覆酸化鉄ナノ粒子を用いたマクロファージへのsiRNA導入法。in vitroおよびin vivoで効率的な遺伝子サイレンシングを実現し、慢性炎症性疾患やがん治療への応用が期待されます。

小さい干渉の RNA のマクロファージへの配信のための車両としてポリエチレンイミン被覆された酸化鉄ナノ粒子の in VitroとIn Vivo

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