Name: 肺のマイクロ Rna 発情周期にわたってプロファイリングのオゾン暴露マウスの (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: 学ぼうマウスの肺マイクロRNAプロファイリング法。発情周期の段階を評価し、オゾン暴露による炎症遺伝子制御への影響を調査する技術です。肺免疫学の研究に応用可能です。

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この研究は、NIH K01HL133520 (PS) と K12HD055882 (PS) からの助成金によって支えられました。著者は博士ジョアンナ フロロスのオゾン暴露試験との援助をありがちましょう。

ここで説明するすべての方法は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ペンシルベニア州立大学のによって承認されています。
1。 発情周期の段階の評価
<ol><li>C57BL/6 マウス (8-9 週齢) を使用して Machholz ら10で説明した片手マウス拘束テクニック女性を正しく抑制します。</li>
	<li>超純水の 10 μ L の滅菌プラスチック ピペットを入力します。</li>
	<li>プラスチック ピペットの先端を膣に投入します。</li>
	<li>優しくのフラッシュ液体 4 ~ 5 回、サンプルを採取します。</li>
	<li>ガラス スライド膣分泌液を含む最終的なフラッシュを配置します。</li>
	<li>光顕微鏡 20 × 対物で無染色の膣にフラッシュを観察します。 注:偽妊娠や他の原因のための定期的なサイクルを表示しない動物は、実験から除外する必要があります。周期を確認する少なくとも 3 つの連続したサイクルの膣分泌物毎日を実行することをお勧めします。</li>
</ol>2. オゾン暴露
<ol><li>アドリブ ワイヤー メッシュ蓋と水で 2 つの 1.2 L のガラス容器で最大 4 マウスを配置します。</li>
	<li>オゾン室と他のフィルターの空気暴露チャンバー内に 1 つのガラス容器を置きます。</li>
	<li>定期的にオゾン濃度が 2 ppm とモニターにオゾン濃度を調整します。 注:オゾン装置提供規制気流 (> 30 空気変更/h) と制御温度 (25 ° C) と湿度 (50%)。監視され、11を前述のように紫外線オゾン アナライザーと質量流量コント ローラーによって制御、放電オゾナイザによるオゾンが生成されます。</li>
	<li>大気暴露のオゾン/フィルターの 3 時間後ガラス容器を削除します。寝具、食糧および水のアドリブでケージに動物を返します。</li>
</ol>3. 肺コレクション
<ol><li>4 時間後、麻酔動物、ケタミン ・ キシラジン カクテル (90 mg/kg ケタミン ・ キシラジン 10 mg/kg) の腹腔内注入。 注:麻酔の適切なレベルを確認するには、チェック マウス ペダルの反射 (しっかりつま先ピンチ) は、必要に応じて麻酔薬を調整します。</li>
	<li>マウス皮膚の 70% エタノールを湿らせます。</li>
	<li>上大静脈を公開する動作のシザーと外科ピンセットを使用して 2 cm 正中切開を行います。</li>
	<li>下大静脈と大動脈の断裂によってマウスを犠牲に。必要な場合は、急激に血液を収集する腎静脈上大静脈に 21 G ゲージ針を挿入します。また、心臓穿刺次の標準プロトコルを介して血液を収集します。</li>
	<li>外科はさみを使用して、腹腔内を開いてカットし、肌/上筋、肋骨に向かって上に移動を削除します。</li>
	<li>横隔膜をパンクに手術用ハサミを使用します。 注:肺は横隔膜から崩壊します。</li>
	<li>手術用ハサミを使用して心臓と肺を公開する胸郭を切り取る。</li>
	<li>鉗子を使用して、1.5 mL 遠心チューブの RNase フリーを取るし、管を埋めるため液体窒素で水没します。 注:ゴーグル ・防護手袋を使用して液体窒素を処理します。</li>
	<li>肺を削除、スナップ凍結組織、液体窒素で満たされた、RNase フリー遠心 1.5 mL チューブにそれらを置くし、液体が蒸発するまで数秒待ってから。</li>
	<li>チューブのふたを閉じ、使用するまで-80 ° C で組織を保存します。</li>
</ol>4. RNA の準備
<ol><li>ステンレス鋼の組織の粉砕機を使用して全体の肺を粉砕します。 注:組織の粉砕機は、液体窒素中で使用前に配置する必要があります。RNAse ソリューションで各使用後きれいに粉砕。</li>
	<li>微粉の肺を分割し、2 つの 1.5 mL チューブ (半分肺) に配置します。</li>
	<li>500 μ L のサンプル チューブあたりためチオシアン酸イ オンを加え、混ぜます。 それぞれ 18 G、21 G、23 G 針を使用して各サンプルをホモジナイズしてください。 注:サンプルは 108小さな RNA スパイクでコントロール (種) から抽出する前に、部数 x 5.6 でスパイクします。</li>
	<li>各サンプルと 15 の渦にエタノール 500 μ L を追加 s。</li>
	<li>コレクション チューブ、12,000 × gで 1 分間遠心する [スピン] 列に混合物の負荷を流れを破棄します。</li>
	<li>
DNase の私治療 (内の列)。
	<ol>
<li>12,000 × gで 1 分で 400 μ L の RNA 洗浄バッファーと遠心分離機を追加します。</li>
		<li>RNase フリーのチューブでは、追加 5 μ L の DNase 私と 75 μ L の DNA 消化 × 1 バッファーし、ミックスします。列の行列に直接には、ミックスを追加します。</li>
		<li>15 分間室温でインキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>列と 1 分流れを破棄、12,000 × gで遠心分離する RNA prewash ソリューションの 400 μ L を追加し、この手順を繰り返します。</li>
	<li>列に 700 μ L の RNA 洗浄バッファーを追加し、12,000 × gで 1 分間遠心を流れを破棄します。</li>
	<li>残りのバッファーを削除する 2 分間 12,000 × gで遠心分離機します。RNase フリーのチューブに列を転送します。</li>
	<li>RNA を溶出するには、列マトリックスおよび 1.5 分、12,000 × gで遠心分離に直接水の DNase、RNase フリーの 35 μ L を追加します。</li>
	<li>総 RNA 濃度を測定 (260 nm) と純度分光光度計を使用しています。1.5 μ L サンプル分注で RNA 定量を実行する指示に従います。楽器が DNase、RNase フリー水溶出用ブランクです。 注:~2.0 の 260/280 の比率は、RNA の「純粋な」として一般に認められます。典型的な RNA 濃度通常 750 と 2,500 ng/μ L の間の範囲します。</li>
	<li>-80 ° C でストア</li>
</ol>5. miRNA プロファイリング
<ol><li>
レトロ-議事録使用 200 ng のトータル RNA の Rna。
	<ol>
<li>(反応あたり合計量は 20 μ L) 氷の上逆のトランスクリプション反作用の組合せを準備します。各反応バッファー、ヌクレオチド ミックス 10 x の 2 μ L、逆転写酵素の 2 μ L、RNase フリー水 2 μ L x 5 の 4 μ L を追加します。すべてのコンポーネントと 600 μ L RNAse フリー プラスチック チューブ (反応あたりミックスの 10 μ L) の因数をミックスします。 注:逆のトランスクリプションのマスターの組合せには、テンプレート RNA を除く最初繊維の cDNA の統合に必要なすべてのコンポーネントが含まれています。 注:マスター ミックスを準備するときは、余分なボリューム (10%) を計算します。</li>
		<li>テンプレート RNA を追加 (200 10 μ L で ng) 逆のトランスクリプションのマスターの組合せを含む各管に。ミックス 15 遠心 1,000 x gで s したちのドライ ブロックを配置するまで氷の上保存します。</li>
		<li>37 ° C で 60 分間インキュベートします。</li>
		<li>95 ° C で 5 分間インキュベートし、氷の上、管を配置します。</li>
		<li>各 20 μ L 逆転写反応に RNase フリーの水の 200 μ L を追加することによって Dna を希釈します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
マウス炎症反応や自己免疫の miRNA PCR アレイを用いたリアルタイム PCR を行います。
	<ol>
<li>反応混合物 (総量 1100 μ L) を準備: 各反作用のため 550 μ L 2 x PCR マスター ミックスの普遍的なプライマー ミックス x 10 の 110 μ L、RNase フリー水 340 μ および cDNA テンプレート (ステップ 5.1.5 から希釈反応) の 340 μ L を追加。</li>
		<li>プリインストールされた miRNA マルチ チャンネル pipettor を用いた PCR アレイの各ウェルに反応混合物の 10 μ L を追加します。</li>
		<li>MiRNA PCR 配列板光学接着フィルムをシールします。</li>
		<li>1,000 x g気泡を除去するために室温で 1 分のプレートを遠心します。</li>
		<li>プログラム リアルタイム サーマルサイクラー、PCR の初期活性化ステップ 95 ° C で 15 分間、15 の 3 ステップ サイクリング含む変性 94 ° c、30 の焼鈍 s 55 ° C、および 30 の拡張子 s 40 70 ° C で s サイクル数。 注:リアルタイムのサーマルサイクラーを設定する指示を条件に従って製造元のサイクリングします。リアルタイム サーマルサイクラー ソフトウェアに組み込まれた解離曲線のステップを実行します。</li>
		<li>データ解析を実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. データの分析
<ol><li>解析ソフトウェアに各サンプルのリアルタイム PCR ソフトウェアからの Ct 値を抽出します。 注:34 の Ct 値は、カットオフとして考慮されます。サンプルには、スパイクの制御 (例:, cel-ミール-39) が含まれている場合、は、各サンプルのコントロールのスパイクに Ct 値を正規化します。しきい値の値は、手動で設定する必要があります。基準値は自動的に設定されます。</li>
	<li>六つの miRNA ハウスキーピング コントロールの平均 Ct の Ct 値を正規化: SNORD61、SNORD68、SNORD72、SNORD95、SNORD96A、RNU6 2、次の式を使用します。 ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping)</li>
	<li>倍の計算を変更、相対式方程式12を使用して、コントロールとして特定のサンプルを使用して、ΔΔCt 値を計算します。 miRNA の相対的な表現: 2-∆∆Ct、ここで-∆∆Ct =-[∆Ct テスト - ∆Ct コントロール] 注:200 のフォールドの変更は、カットオフとして考慮されます。</li>
	<li>輸出倍 Bioconductor8のlimmaパッケージを使用して R の統計分析を実行する式の値を変更します。</li>
	<li>Benjamini ホフベルク方法13を使用して複数の比較を修正します。 注: R スクリプトのコピーがで利用できる: <a href="http://psilveyra.github.io/silveyralab/">http://psilveyra.github.io/silveyralab/</a>。データセットと解析データ番号 GSE111667 の下で遺伝子発現のオムニバスでも https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667。</li>
</ol>7. データ解析: 解析ソフトウェア
<ol><li>データセットを配置します。それぞれ式ログ比と p 値の Mirna が含まれます。特定のデータセットのフォーマットのテーブル 1を参照してください。</li>
	<li>オープン機能解析ソフトウェア (バージョン 01-10)。</li>
	<li>次の形式を使用してデータセットをアップロード: ファイル形式:「柔軟なフォーマット」が含まれている列見出し:「はい」識別子種類を選択:「miRBase (成熟)」、実験用アレイ プラットフォーム: 配列プラットフォームを選択。 注:ファイル形式が .txt を受け入れ (タブ区切りテキスト ファイル)、.xls (excel ファイル)、および .diff (cuffdiff ファイル)。</li>
	<li>「推測の意見」を選択し、、実験グループ ラベルが正しいことを確認します。</li>
	<li>マップとマップされていない Mirna の合計金額を修正する「データセットの概要」に進みます。</li>
	<li>
上部の「新規」ボタンをクリックしてプログラムの左。「新しいマイクロ Rna ターゲット フィルター」を選択し、、マイクロ Rna データセットをアップロードします。
	<ol>
<li>ソースに設定: TarBase、創意工夫、専門家の調査結果 miRecords。</li>
		<li>信頼を設定: 実験的観察および高 (予想)。</li>
		<li>生物学的種、疾患、組織、経路などのターゲットについての様々 なを含めるの「列の追加」を選択します。</li>
		<li>実験式は変わったターゲットに焦点を当てる、するを選択"追加/mRNA データセットを交換する」。「ペアリング」の式を使用して、同じまたは別の発現レベルとマイクロ Rna を探します。 注:フィルター分析はマイクロ Rna の名前と記号、mRNA ターゲット、ターゲット リレーションシップおよび予測関係 (図 2) の信頼区間を示すソースを提供します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>経路キャンバスにフィルター処理されたデータセットを送信しより多くの生物学的関係を調べる「マイ経路を追加する」をクリックします。</li>
	<li>パス デザイナーを使用すると、マイクロ Rna 効果の出版品質モデルを作成します。</li>
	<li>
別のオプションは、コア解析を作成します。
	<ol>
<li>コア分析型「発現解析」を選択します。</li>
		<li>計測タイプの「Expr ログ比」を選択します。</li>
		<li>分析フィルターの概要: 分子および関係のみを考慮する、: (種 = マウス) と (自信 = 実験で観測) と (データ ソース =「創意工夫の専門家調査結果」、「創意工夫 ExpertAssist 調査結果」、"miRecords"、"TarBase"、または"TargetScan 人間」)。</li>
		<li>P 値のカットオフを選択 = 0.05。</li>
		<li>分析を実行します。 注:レポートに含まれます: 正規の経路、上流レギュレータ解析、疾患や機能、レギュレータの効果、ネットワーク、分子。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者は、彼らは競争の興味があることを宣言します。

マイクロ Rna プロファイリングは、病気の診断と機構の研究のための有利な方法です。この原稿では、発情サイクルの異なる段階でオゾンにさらされた雌マウスの肺に炎症性の遺伝子を調節すると予測されている Mirna の式を評価するためのプロトコルを定義します。視覚的検出法などの発情周期の定量方法は、記述されている16をされています。しかし、これらは 1 回の測定に依存、従って信頼性の高いではないです。サイクルが定期的に女性のすべての発情周期のステージを正確に特定するには、ここで説明したメソッドの使用をお勧めします。さらに、この単純なプロトコルはマウスで毎日ホルモンの変動を直接推定するも使用できます。毎日一度だけ実行する必要がありますをサンプリング、膣の刺激により不要な炎症反応の活性化を避けるために。サイクルの長さの影響を住宅の可変性のため 2、3 サイクルの段階を考慮した実験動物を使用する前に完全なサイクルのプロトコルを実行することが重要です。
肺組織からの RNA が正常に展開するため、正確な手順が重要です。このプロトコルでは、質の高い ...

マイクロ Rna (Mirna) は短い (19 に 25 のヌクレオチド)、自然発生する、非コーディングの RNA 分子。Mirna のシーケンスは、miRNAs 生理機能1を調整することの重要性を示唆している種類を渡って節約進化。マイクロ Rna 発現プロファイルは、miRNAs の免疫反応、細胞の分化、発達プロセス、およびアポトーシス2を含め、プロセスの様々 な規制に重要な識別するために有用であると実証されています。最近では、miRNAs は病診断と治療の潜在的な使用のために認識されています。研究者は遺伝子制御のメカニズムを勉強して、miRNA 発現を測定照らすことができます規制プロセスのシステム レベル モデル miRNA 情報は mRNA プロファイリングと他のゲノム スケール データ3を結合したときに特に。その一方で、miRNAs は試料の種類の範囲における Mrna よりも安定にも示されている、蛋白質4に比べ高い感度で測定可能なも。これは肺疾患を含む、多様な分子診断アプリケーションのバイオ マーカーとしての miRNAs の開発に大きな関心につながっています。
肺の miRNAs は発達プロセスと恒常性の維持に重要な役割を再生します。また、その異常発現は開発と様々 な肺疾患5の進行に関連付けられています。大きいの重症度と予後を示すホルモンと発情周期が環境課題への対応における肺生得免疫と miRNA 発現を調節することが女性の大気汚染による炎症性肺疾患を示しています。6。 このプロトコルでは適応免疫の留守中に発生する雌ネズミの肺の炎症の形態を誘導するために大気汚染の主要な成分であるオゾン露出を使用します。オゾンを使用することにより、我々 は気道過敏性の亢進、気道上皮細胞の損傷および好中球の増加や近位気道7中の炎症メディエーターに関連付けられて開発に誘引すること。現在、特性評価、オゾン暴露マウスの発情周期にわたって Mirna の解析によく記述されていたプロトコルはないです。
以下は、発情周期の段階および miRNA 発現オゾンにさらされた雌マウスの肺組織を識別する簡単な方法をについて説明します。また計算生物学に重点を置いて、miRNA 検出とターゲット識別に効果的なバイオインフォマティクスのアプローチに取り組みます。我々 は、 limma、遺伝子発現実験8からのデータを分析するための統合ソリューションを提供する R/Bioconductor ソフトウェアを用いたマイクロ アレイ データを分析します。Limmaから PCR 配列データの解析アレイ/サンプルの数が少ないを使用して、式を比較するとき t 検定の手続き上力の面で利点があります。MiRNA の式の結果の生物学的文脈を理解するには、私たちは、機能解析ソフトウェアを使用されます。転写の変更を調節するメカニズムを理解するために、可能性が高い結果を予測する、ソフトウェアは miRNA 発現データセットと文献9から知識を兼ね備えています。これは、miRNAs のセットを重複で統計の濃縮を探してソフトウェアと比較した場合の利点です。

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J</td>マウス <td>ジャクソン研究所</td><td>000664</td><td>8週齢</td></tr><tr><td>超純水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10813012</td><td></td></tr><tr><td>滅菌プラスチックピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-711-25</td><td>容量:1.7 mL</td></tr><tr><td>つや消し顕微鏡スライド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>2951TS</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td>顕微鏡ワールド</td><td>MW3-H5</td><td>10x および 20x 対物レンズ</td></tr><tr><td>Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>55853</td><td>90 mg/kg.規制薬物。</td></tr><tr><td>キシラジン滅菌溶液</td><td>ロイド研究所</td><td>139-236</td><td>10 mg / kg。規制薬物。</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>BP2818100</td><td>エタノールを水で70%に希釈します。</td></tr><tr><td>21 G ゲージ針</td><td>BD Biosciences</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>329654</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>手術用はさみ</td><td>ワールド プレシジョン インスツルメンツ</td><td>501221、504613</td><td>14 cm、シャープ/ブラント、カーブ & 9 cm、ストレート、ファイン シャープ チップ</td></tr><tr><td>ピンセット</td> ワールド <td>プレシジョン インスツ</td><td></td> 504616 <td></td></tr><tr><td>スペクトラム&nbsp;ベスマン組織粉砕機</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-418-1</td><td>容量:10 〜 50 mg</td></tr><tr><td>RNase-free マイクロフュージチューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM12400</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>トリゾール試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>ダイレクトゾールRNA MiniPrep Plus</td><td>ザイモリサーチ</td><td>R2071</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>miScript II RTキット</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>マウス炎症反応&自己免疫 miRNA PCR アレイ</td><td>Qiagen</td><td>MIMM-105Z</td><td></td></tr><tr><td>薄肉、DNaseフリー、RNaseフリー PCR チューブ</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM12225</td><td>20 μ;L 反応</td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td><td>Qiagen</td><td>219610</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td>https://office.microsoft.com/excel/</td></tr> <tr><td>Ingenuity Pathway Analysis</td><td>Qiagen</td><td></td><td>https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/</td></tr> <tr><td>R Software</td><td>The R Foundation</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>サーマルサイクラーまたは冷却/加熱ブロック</td><td>ゼネラルラボサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機</td><td>ジェネラルラボサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リアルタイムPCRサイクラー</td><td>ゼネラルラボサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペッター</td><td>ゼネラルラボサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA洗浄バッファー</td><td>Zymo Research</td><td>R1003-3-48</td><td>48mL</td></tr><tr><td>DNA消化バッファー</td><td>Zymo Research</td><td>E1010-1-4</td><td>4 mL</td></tr><tr><td>RNAプレウォッシュバッファー</td><td>Zymo Research</td><td>R1020-2-25</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>紫外線オゾン分析装置</td><td>Teledyne API</td><td>Model T400</td><td>http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400</td></tr><tr><td>Mass Flow controllers</td><td>Sierra Instruments Inc</td><td>Flobox 951/954</td><td>http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html</td></tr></tbody></table>

肺のマイクロ rna 発情周期にわたってプロファイリングのオゾン暴露マウスの

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

生物学や医学のさまざまな分野で働く研究者の関心マイクロ Rna (miRNA) プロファイリングとなっています。有望な診断で、肺疾患ケア miRNAs の使用の将来を現在研究に表示されます。ここでは、我々 はマイクロ Rna プロファイリング miRNAs のオゾンによる気道炎症のマウス モデルから肺組織の炎症性遺伝子を調整する予測のグループの相対的な豊かさを測定するためのプロトコルを定義します。このメソッドの目的は発情周期を考慮した雌のマウス プロトコルをプロファイリング炎症 miRNA を記述するので血中性ホルモン濃度が女性の肺の免疫の調節に影響を与えることが示されている、オゾン暴露の時にそれぞれの動物の段階です。LimmaR/Bioconductor ソフトウェアを用いた miRNA 検出とターゲット識別の方法に該当するバイオインフォマティクス アプローチに取り組むも、生物学的文脈と経路を理解する機能解析ソフトウェアを関連付け差分の miRNA の表現。

塗抹標本にみられる異なった細胞のタイプは、マウスの発情期 (図 1) を識別するために使用されます。これらは細胞の形態によって識別されます。Proestrus の間に細胞はほとんど専ら丸い形、整形式の有核細胞 (図 1 a) のクラスターです。マウスが発情期にある細胞、角化扁平上皮細胞、高密度クラスター (図 1 b) に存在。Metestrus、中に角化上皮細胞と好中球が見られる (図 1)。白血球 (小さな細胞) は、発情、一般的に多く普及している (図 1)。
我々 は、前述のプロトコルに従う 4 つのマウス肺から RNA を抽出しました。核酸濃度 (...

ここで肺式を評価する方法について述べる予測される miRNAs の炎症性遺伝子を調整するマウスを用いたオゾンにさらされるまたは発情周期の異なった段階で空気をフィルター処理します。

肺のマイクロ Rna 発情周期にわたってプロファイリングのオゾン暴露マウスの

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

この方法は、肺内の炎症性遺伝子を調節すると予測されるマイクロRNAの発現を評価する方法に関する肺免疫分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術は、肺マイクロRNA発現に対する循環ホルモンの寄与を特定するための簡単な方法を提供する。エストルースサイクルステージを評価するには、8〜9週齢の雌マウスを手動で拘束し、超純水で満たされたプラスチック10マイクロリットルピペットの先端を膣に導入する。サンプルを収集するために4〜5回静かに洗い流し、膣液の最終的なフラッシュをガラススライドに堆積させます。その後、20倍の倍率で、未染色膣フラッシュを光顕微鏡で観察します。オゾンおよび濾過空気露出の場合、最大4匹のマウスを、金網の蓋付きの2つの個々の1.2リットルガラス容器の1つに入れます。オゾンチャンバーに1つのガラス容器を入れ、1つはろ過空気暴露室に入れます。その後、オゾン濃度を100万分の2に調整し、3時間後に容器を取り除きます。暴露の4時間後、第1実験マウスの露出した皮膚表面を70%エタノールで消毒し、肋骨ケージを切り取って心臓と肺を露出させる。鉗子を使用して、液体窒素に1.5ミリリットルRNaseフリーのマイクロ遠心分離チューブを浸水させ、収穫された肺を液体窒素中で凍結させます。次に、ステンレス鋼の組織粉砕機を使用して肺全体をマスチメントし、粉砕された組織を2つの1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管の間で分割します。この同じ方法ですべての動物から肺を採取して粉砕した後、各サンプルに500マイクロリットルのグアニジニウム・チオシアネートを加え、各組織を18、21、および23ゲージの針で順次均質化する。最後の均質化の後、15秒間渦を出す前に、各サンプルに500マイクロリットルのエタノールを加えます。遠心分離のために個々のコレクションチューブの個々のスピン列に混合物をロードし、フロースルーを廃棄します。DNase 1処理の場合は、各カラムに400マイクロリットルのRNA洗浄バッファーを追加して別の遠心分離を行い、RNaseフリーチューブのサンプルあたり5マイクロリットルのDNase 1と75マイクロリットルのDNA消化バッファーを混合します。室温で15分間のインキュベーションのためにカラムマトリックスに直接ミックスを加え、続いて2つの400マイクロリットルRNAプリウォッシュ溶液を遠心分離によって洗浄します。RNAを溶出するには、DNase RNaseフリー水を35マイクロリットルのDNaseフリー水を各カラムマトリックスに直接加え、最終的な遠心分離を行い、分光光度計上の各サンプルの全RNA濃度と純度を測定します。その後、RNAをマイナス80°Cで保存します。小さなRNaseの転写の場合、1サンプルあたり逆転写反応ミックスの1つのチューブに10マイクロウォッシュ溶液

lung-microrna-profiling-across-the-estrous-cycle-in-ozone-exposed-mice

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

ここでは、単純な、非侵襲的なコレクションと膣の塗抹標本の細胞学的評価によるマウス生殖（発情前期、発情期、発情後期、もしくは発情間期）の段階を識別する方法について説明します。我々はさらに膣細胞診は、ネズミ生殖サイクルを通じての移行の基礎となるホルモンの循環レベルを反映する方法を説明します。...

膣洗浄、クリスタルバイオレット染色、およびマウス発情周期ステージング識別のための膣細胞学的評価を行う

二つの運動パラダイムは、運動能力や運動に対する心臓の適応上の閉経の影響を調べるために新たに開発された化学的に誘発された更年期マウスモデルで試験した。...

マウスにおける運動耐容能および心臓適応に関する化学的に誘発卵巣障害の影響を研究するための方法

本研究では、オゾンの高濃度にマウスを繰り返しさらすことによって新しい慢性閉塞性肺疾患 (COPD)...

繰り返しオゾン暴露によるマウスの慢性閉塞性肺疾患モデルの生成

この原稿は、大気汚染物質であるオゾンへの曝露が生体内の肺胞マクロファージエフェロサイト症を損なうかどうかを決定するためのプロトコルを記述する。このプロトコルは、一般的に使用される試薬および技術を利用し、肺胞マクロファージエフェロサイトシスへの影響を決定するために肺損傷の複数のモデルに適応することができる。...

オゾン暴露後の肺胞マクロファージエフェロサイトーシスの生体内評価

オゾンと細菌性内毒素を組み合わせたマウスは、好中球を含む広域細胞死を示す。細胞骨格ラメリポディアの破壊、気管支-肺胞洗浄における複雑なV...

オゾンとLPS誘発マウス急性肺損傷時の肺細胞適応の可視化

RNA完全性を維持しながら個々のセグメントの収集を可能にするマウス卵管の微小解剖のための方法が提示される。加えて、非酵素的卵管細胞解離手順が記載されている。この方法は、機能的に異なる卵管セグメントおよび解離した卵管細胞のその後の遺伝子およびタンパク質分析に適している。...

マウス卵管の微小解剖と解離:個体セグメントの同定と単一細胞単離

このプロトコルでは、翻訳リボソームアフィニティー精製(TRAP)法と特定の細胞タイプでタグ付けされた核の単離(INTACT)法が、Cyp17a1-Creマウス系統に交配されたNuTRAPマウスモデルを使用して、細胞特異的卵巣トランスクリプトームとエピゲノムのペアインプロゲーション用に最適化されました。...

マウス卵巣エピゲノムとトランスクリプトームの細胞特異的ペアインプロゲーション

さまざまな性腺外組織および臓器における卵胞刺激ホルモン(FSH)は、複数の疾患の病因と関連しています。卵巣摘出術およびFSH処理マウスモデル(OVF)を使用して、FSHの性腺外作用を調べることができます。...

マウスモデルにおける卵胞刺激ホルモンの in vivo での独立効果の探索

この論文では、マウスの吸入環境汚染物質曝露が嗅覚機能に及ぼす影響を評価するための、埋没食品試験と社会的臭識別実験について詳しく説明しています。...

マウスの嗅覚機能に及ぼす吸入環境汚染物質の影響の研究

ここでは、新生児マウスをさまざまな酸素濃度の制御された環境で送達することにより、低酸素症を誘発するプロトコルを紹介します。出生時に酸素変動を受けたマウスモデルは、自閉症などの行動表現型変化の誘導に関与するmiRNAの発現を永続的に変化させています。...

低酸素症は、マウスの自閉症スペクトラム障害の非メンデル遺伝に関与するmiRNAレベルを変化させます

学ぼうマウスの肺マイクロRNAプロファイリング法。発情周期の段階を評価し、オゾン暴露による炎症遺伝子制御への影響を調査する技術です。肺免疫学の研究に応用可能です。

肺のマイクロ Rna 発情周期にわたってプロファイリングのオゾン暴露マウスの

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