Name: 付着性のセルのターゲット婚約を定量化するイメージングの高いコンテンツを使用してください。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-29T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 学ぶ高コンテンツイメージングを用いた細胞熱シフトアッセイによる薬物標的結合の定量化法。接着細胞を剥離せず空間的局在を可視化し、創薬研究における化学プローブの検証に応用できます。

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著者は、ライフ研究所、カロリンスカ研究所の科学からインフラストラクチャのサポートを認めます。著者には、入力、ミカエラ Vallin、マグダレナ Otrocka とトーマス ・ Lundbäck との協議も認めます。

1. 細胞の播種
注:ワークフローの一般的な概要については、図 1を参照してください。材料および試薬の詳細なリストはテーブルの材料で利用できます。
<ol><li>細胞の播種前に黒 384-well アッセイ プレート加熱ステップ中に後で皿の下敷きにされている空気の泡を避けるためにフレームに標準的なドリルで穴をあけます。このステップの間に井戸に入るプラスチック粒子を回避し、無菌状態を維持するために、粘着アルミ箔でプレートをシールまたはティッシュ文化フードの掘削前にプレートをカバーします。通常、各プレート (短辺) の側に 3.5 mm の直径の 3 つの穴で十分です。</li>
	<li>層流ベンチを準備するには、70% エタノールで洗浄します。以下の標準的な無菌培養技術、セル フラスコまたは皿からメディアを削除します。5-10 ml のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の細胞を洗浄し、フラスコに 2 mL のトリプシンを追加します。A-431 細胞を切り離すまでは、37 ° C でフラスコを孵化させなさい。Haemocytometer またはセルのカウンターを使用していずれかのセルをカウントします。50,000 セル/mL の培養液中の細胞懸濁液を準備します。</li>
	<li>バルク試薬ディスペンサーまたは実験の規模によって、マルチ チャンネル ピペットを使用してアッセイ プレートの各ウェルに細胞懸濁液 (ウェルあたり 2,000 セルの最終的な細胞密度を与える) の 40 μ L を分注します。簡単にプレートの底にセルを均等に分散する側からプレートを移動します。</li>
	<li>プレート エッジ効果を最小限に抑えるために層流フードの奥に室温で 20 分のアッセイ プレートの下部に解決するために細胞を許可します。次に、湿気のある大気を確保するため少し湿らせたペーパー タオルでプラスチック容器にプレートを置きます。使用前に 70% のエタノールでプラスチック容器を拭きます。</li>
	<li>従来の加湿インキュベーターで CO2を 37 ° C、5% で 2 〜 3 日のアッセイ プレートとボックスを孵化させなさい。光顕微鏡による目視検査により評価した 50-75% まで細胞の密度を監視します。</li>
</ol>2. 複合治療
<ol><li>実験の日、よくプレート ワッシャーを使用して各から媒体を吸引します。プレート洗濯機のプレートを置き、吸引プログラムを選択します。板ワッシャーが使用できない場合、切片屑トレーまたはシンクの上迅速な手ひねりプレートの反転によって液体を削除できます。液体の完全な除去は優れたパフォーマンスにとって不可欠です。余分な液体が紙タオルで軽くたたくことにより削除されます。</li>
	<li>細胞培養培地自動調剤を使用してまたは実験の規模によってマルチ チャンネル ピペットで充当の濃度に希釈して化合物の 30 μ L を追加します。各アッセイ プレート上のいくつかの井戸に負 (DMSO) と正 (知られている配位子) コントロールを追加することを確認します。これは熱シフト試金は、化合物の濃度が安定化タンパク質を観察する解離定数を超えている必要があります。したがって、化合物の濃度についての大まかな指針は 50-100 回 IC50が、ディスカッション セクションに化合物濃度のより詳細な説明があります。 注: セル行の DMSO を忍容性は、実験前にテスト必要があります。</li>
	<li>シール通気性のある板で化合物処理アッセイ プレート シールし、加湿のインキュベーターで CO2を 5% と 37 ° C で 30 分間インキュベートします。</li>
</ol>3. 熱チャレンジ
<ol><li>まず、風呂の水を所望の温度に設定します。アッセイ プレートのウェル内に達し最終的な温度水のバスで最終の温度とは異なることに注意してください。ダミー プレートと熱電対温度計とオフセットを事前調査します。通常、所望の温度で安定するお風呂に 30 分かかります。</li>
	<li>加熱ステップ中にアッセイ プレートの井戸に所望の温度が達されることを確認するためアッセイ プレートとして媒体の同じボリュームを含む封印されていないダミー プレートを準備します。</li>
	<li>インキュベーターからアッセイ プレートを削除します。通気性のあるシール離陸し、水浴の後の加熱時に、井戸に水が漏れないようにタイトな粘着アルミ箔複合処理細胞を含むアッセイ プレートを再シールします。プレート フレームの穴がアクセスできることを確認します。</li>
	<li>アッセイ プレートとダミー プレートを風呂の水でプレートの下から出て残りの空気を強制的に水面に向かって傾斜プレートの下部に配置します。</li>
	<li>熱電対温度計を使用して新しいダミー プレートの井戸の中の温度を監視します。</li>
	<li>熱で 3 分間湯せんアッセイ プレート。すぐに 5 分間クールダウン ルーム鍛えて水で別水槽にアッセイとダミー プレートを転送します。アッセイ プレートは、さらに処理の準備が整いました。</li>
</ol>4. 固定
<ol><li>バルク試薬ディスペンサーまたはマルチ チャンネル ピペットを使用してアッセイ プレートに直接 10 μ L 16% (w/v) パラホルムアルデヒド (PFA) を分配します。室温で 20 分間インキュベートします。 注: いくつかの定着剤は発がん性として分類され、機関の安全規則に従う必要があります。</li>
	<li>PFA ソリューションを吸引し、プレート ワッシャーを使用して 300 μ L の PBS のセルを洗ってください。プレート洗濯機のプレートを置き、吸引プログラムを選択します。 注: この手順は、プレートの洗濯機、液体は同時に分配され、削除のオーバーフロー プロトコルを使用して最適化されています。プレート洗浄機または同様の手順を使用できない場合洗浄のステップまたは手動で実行できます。</li>
	<li>
プロシージャを洗浄マニュアル:井戸から液体を削除するには、廃棄物トレイまたはシンクの上迅速な手ひねりプレートを反転します。液体の完全な除去は優れたパフォーマンスにとって不可欠です。マルチ チャンネル ピペットに 80 μ L の PBS を追加上記として再びプレートを反転、2 回洗濯の手順を繰り返します。最後の洗浄後、余分な液体を削除するきれいなペーパー タオルに対してプレートをしみ。</li>
</ol>5. 透過
<ol><li>0.1% (v/v) NP 40 マルチ チャンネル ピペットを使い、井戸の 20 μ L を追加し、10 分間室温でインキュベートします。(ステップ 4.2) 上記のように同じ手順を使用してセルを洗浄します。</li>
	<li>または、適切な場合、抗原検索のプロトコル、例えばに適用します。<ol>
<li>マルチ チャンネル ピペットを使い、井戸に 1 %sds の 20 μ L を追加します。室温で 5 分間インキュベートし、(手順 4.2) 上記同じ手順に従って洗ってください。</li>
		<li>Ph 7.2 10 mM グリシンの 80 μ L を追加し、室温で 10 分間インキュベートします。プレート ワッシャーに配置し、吸引プロトコルの選択によるプレート ワッシャー グリシン ソリューションを吸い出しなさい。プレートの洗濯機が使用できない場合は、2.1 と 4.2 のノートを参照してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6 ブロック
<ol><li>バルク試薬ディスペンサーまたはマルチ チャンネル ピペットを使用して井戸に PBS で 1% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA) の 15 μ L を追加します。1 時間室温でまたは夜通しアルミ プレート ホイルシールで 4 ° c のプレートを孵化させなさい。</li>
</ol>7. 一次抗体
<ol><li>プレート ワッシャーに配置し吸引プロトコルを選択するプレート ワッシャーを使用してブロッキング液を吸い出しなさい。プレートの洗濯機が使用できない場合は、2.1 と 4.2 のノートを参照してください。</li>
	<li>適宜希釈した一次抗体の 10 μ L を追加 1% (w/v) BSA PBS でマルチ チャンネル ピペットを使用して井戸へ。1 時間室温でまたは夜通しアルミ プレート ホイルシールで 4 ° c のプレートを孵化させなさい。</li>
</ol>8. 二次抗体
<ol><li>一次抗体溶液を吸引し、(手順 4.2) 上記のように、同じ手順に従って洗浄します。</li>
	<li>アレクサ 488 二次抗体のに応じて希薄化後の 10 μ L を追加 1% (w/v) BSA PBS で。室温で 1 時間インキュベートします。プレートは、光から保護するために粘着アルミ箔シールとシールします。 注: は、この中に光からプレートと後続の手順を保護します。</li>
</ol>9. 核染色と細胞マスク
<ol><li>マルチ チャンネル ピペットを使用して井戸に PBS で 0.05 mg/mL に希釈して核の色素の 10 μ L を追加します。室温でさらに 10 分間インキュベートします。</li>
	<li>二次抗体とヘキスト ソリューションを吸引し、洗浄 (ステップ 4.2) 上記のように、同じ手順を使用します。</li>
	<li>携帯マスク 200 ng/mL の PBS でマルチ チャンネル ピペットを使用して井戸に希薄化後の 10 μ L を追加します。室温で 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>細胞マスク液を吸引し、洗浄 (ステップ 4.2) 上記のように、同じ手順を使用します。</li>
	<li>プレート洗浄機、バルク試薬ディスペンサーまたはマルチ チャンネル ピペットを使用してすべてのウェルに 60 μ L の PBS を調剤し、粘着アルミ箔でプレートをシールします。</li>
</ol>10 画像集録および解析
<ol><li>3 蛍光チャネルを使用して高いコンテンツ撮像素子で画像をキャプチャ: DAPI (387/447)、GFP (472/520)、および TexasRed (562/624)。対物レンズ 10 倍を用いたあたり 4 枚の画像を取得します。オート フォーカス自動レーザーを使用し、集録時に合算 2 を適用します。メタデータと共に 16 ビット、グレー スケールの tiff ファイルとしてイメージを保存します。</li>
	<li>利用可能なソフトウェアを使用して画像を分析します。DAPI (核) と TexasRed (細胞質) セル スコアリング アルゴリズムを使用して、セルの境界を識別します。</li>
	<li>さらにデータ解析のためのすべての取得した波長の平均強度を抽出します。</li>
	<li>アッセイの堅牢性を確保するため Z 係数を計算します。</li>
	<li>計算する次の数式を使用して % 安定化: 100 * (1-(よく強度-平均よく強度ネガティブ コントロール) (平均強度肯定的な制御の平均強度ネガティブ コントロール)/)。ここで否定的な制御は DMSO と肯定的な制御の参照物質。各化合物の最大値と最小の安定強度を制御井戸の強度値の代わりに使用されることが化合物間の最大の安定化することができます異なります ITDRF 曲線の肯定的な制御より大きくなければ実際にので、.</li>
</ol>

<ol><li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+a+five-dimensional+framework+on+R%26D+productivity+at+AstraZeneca%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Impact of a five-dimensional framework on R&D productivity at AstraZeneca.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (3), 167-181 (2018).</li>
<li>Freedman, L. P., Cockburn, I. M., Simcoe, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Economics+of+Reproducibility+in+Preclinical+Research%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">The Economics of Reproducibility in Preclinical Research.</a> PLOS Biology. 13 (6), e1002165(2015).</li>
<li>Waring, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analysis+of+the+attrition+of+drug+candidates+from+four+major+pharmaceutical+companies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).</li>
<li>Morgan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+the+flow+of+medicines+be+improved%3F+Fundamental+pharmacokinetic+and+pharmacological+principles+toward+improving+Phase+II+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">Can the flow of medicines be improved? Fundamental pharmacokinetic and pharmacological principles toward improving Phase II survival.</a> Drug Discovery Today. 17 (9), 419-424 (2012).</li>
<li>Bunnage, M. E., Chekler, E. L. P., Jones, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+validation+using+chemical+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Target validation using chemical probes.</a> Nature Chemical Biology. 9 (4), 195-199 (2013).</li>
<li>Schürmann, M., Janning, P., Ziegler, S., Waldmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-Molecule+Target+Engagement+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-Molecule Target Engagement in Cells.</a> Cell Chemical Biology. 23 (4), 435-441 (2016).</li>
<li>Robers, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+engagement+and+drug+residence+time+can+be+observed+in+living+cells+with+BRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Target engagement and drug residence time can be observed in living cells with BRET.</a> Nature Communications. 6, 10091(2015).</li>
<li>Martinez Molina, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+drug+target+engagement+in+cells+and+tissues+using+the+cellular+thermal+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring drug target engagement in cells and tissues using the cellular thermal shift assay.</a> Science. 341 (6141), 84-87 (2013).</li>
<li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cellular+Thermal+Shift+Assay%3A+A+Novel+Biophysical+Assay+for+In+situ+Drug+Target+Engagement+and+Mechanistic+Biomarker+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The Cellular Thermal Shift Assay: A Novel Biophysical Assay for In situ Drug Target Engagement and Mechanistic Biomarker Studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li>
<li>Jafari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+thermal+shift+assay+for+evaluating+drug+target+interactions+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2100-2122 (2014).</li>
<li>Almqvist, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CETSA+screening+identifies+known+and+novel+thymidylate+synthase+inhibitors+and+slow+intracellular+activation+of+5-fluorouracil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">CETSA screening identifies known and novel thymidylate synthase inhibitors and slow intracellular activation of 5-fluorouracil.</a> Nature Communications. 7, 11040(2016).</li>
<li>Axelsson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+Target+Engagement+Studies+in+Adherent+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">In situ Target Engagement Studies in Adherent Cells.</a> ACS Chemical Biology. 13 (4), 942-950 (2018).</li>
<li>Seashore-Ludlow, B., Perspective Lundbäck, T. E. arly <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplate+Application+of+the+Cellular+Thermal+Shift+Assay+%28CETSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+Screening%22%5BJournal%5D)">Microplate Application of the Cellular Thermal Shift Assay (CETSA).</a> Journal of Biomolecular Screening. 21 (10), 1019-1033 (2016).</li>
<li>Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B., Lundback, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAxelsson%2C+H+%22Assay+Guidance+Manual+%5BInternet%5D%22">Assay Guidance Manual [Internet]</a>. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2016).</li>
<li>Mateus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+intracellular+exposure+bridges+the+gap+between+target-+and+cell-based+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Prediction of intracellular exposure bridges the gap between target- and cell-based drug discovery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (30), E6231-E6239 (2017).</li>
</ol>

著者があるレポートへの開示。

結果のセクションで説明したように、方法は、いくつかのキー手順があります。まず、質の高い親和性の試薬を識別するために重要です。各ターゲットのための抗体の小さなライブラリをスクリーニングをお勧めします。一次抗体を選択すると、また適切な蛋白質ターゲットの異なる結合部位数のシステムを検証することが重要です。カウンター熱チャレンジを省略することによって図 2に示すように測定信号を妨害する化合物スクリーニング推奨されています。配位子の存在の減らされた信号を観測すると、抗原検索のプロトコル手順 5.2 で説明をテストできます。プレートの加熱ムラは、観測データの変動やプレートに変化を引き起こす可能性が。プレートが非定常熱チャレンジ (ステップ 3.4) 中に水浴中で部分的水中に沈むのでプレートの外側の井戸はお湯だけでなく、井戸の外側の壁からでも下部に公開されます。同じ水没時にエッジ効果をその後のプレートとプレートのウェルに高い温度があります。そのため、プレートのウェルを回避することをお勧めします。お湯と井戸の底の間の十分な接触を防止する加熱ステップ中にプレートの下の空気の泡が閉じ込められている...

開発新薬や化学プローブ ターゲット占有または生きているセル1,2,3への関与の測定と観察された薬理効果や機能的な読み出しをカップルが不可欠です。これらのデータが小分子実際に目的のターゲットに達することを確認して蛋白質ターゲット選択4、5の背後にある生物学的仮説を検証するために必要です。さらに、医薬品開発の間には複雑化のモデル システムは選択し、臨床試験の前に化合物鉛を裏付けるにされます。これらの前臨床システムの生物学の翻訳を確認するための創薬ターゲットの関与をトレースと付随するこの開発プロセス全体を通じて生物学の方法が重要です。
創薬ターゲット婚約伝統的 unfunctionalized 小分子や蛋白質、特に空間分解能6、7の単一細胞レベルで生きた細胞を監視するために挑戦されています。間の相互作用を観察する 1 つの最近の方法は、薬をそのまま、生きた細胞中のタンパク質は熱チャレンジへの応答でネイティブ蛋白質のリガンド誘導性の安定化、定量化された8、携帯電話熱シフト試金 (CETSA) 9,10。これが熱の挑戦への暴露後残りの可溶性タンパク質を定量化することでできます。CETSA の最初の開示、西部のしみの検出のため使用されました。早期発見キャンペーンを有効にし、大きい化合物コレクションのトリアージをヒット、CETSA 実験のスループットを増やすためにいくつか同種のマイクロ プレート ベースのアッセイ10,11の開発をリードしています。ただし、これらのメソッド 1 つの制限は、細胞懸濁液における化合物の治療に適しています現在最高検出セル換散、空間情報の損失につながるが必要です。CETSA がすることができます小さな分子の単一濃度または単一温度で蛋白質を安定させるために必要なリガンド濃度で実験加熱凝集温度 (Tagg) の配位子誘起シフトのいずれかとして適用します。後者は、等温線量応答指紋これら測定は特定の実験条件に依存性を示すために (ITDRF) と呼ばれます。
このプロトコルの目標は、付着細胞で CETSA を用いた高コンテンツ顕微鏡12蛍光 (IF) 抗体の検出のターゲットの関与を測定することです。この手順は、内局の保全とターゲットの関与の単一セルの定量化を可能にするのには、元の CETSA プラットフォームを拡張します。特に、多くの以前のレポートとは異なりこの手順では複合治療で実行されますライブの付着性のセル表面剥離有無により13の測定を目指して設立された結合平衡を保持熱挑戦前に洗濯。現在、メソッドは 1 つのターゲット蛋白質 p38α の検証 (MAPK14) のいくつかの細胞株、およびことこの手順を共有することによってテクニック広範に適用できる溶融プロテオームを越えてほしい。我々 は、このプロトコルはスクリーニングから医薬品開発パイプライン全体で合わせることができる、ターゲット婚約生体内での監視を通じてトリアージを見込んでいます。

<table><tbody><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>メディカゴ</td><td>09-9400-100</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604013</td><td>for detaching cells and subculturing</td></tr><tr><td>16% paraformaldehyde (PFA)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28908</td><td>fixative</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11008</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>HCS CellMask 赤色染色</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>H32712</td><td>細胞質染色</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56741</td><td>透過化用</td></tr><tr><td>Hoechst 染色 33342</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2261</td><td>核染色</td></tr><tr><td>Dulbecco'修正されたイーグル」s 培地 (DMEM) - 高グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6429</td><td>細胞培養培地成分</td></tr><tr><td>熱不活性化ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td>細胞培養培地成分</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>細胞培養培地成分</td></tr><tr><td>コーニング、通気性プレートシール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3345</td><td>コパウンドインキュベーションステップ</td></tr><tr><td>ウサギ抗p38抗体 [E229]</td><td>Abcam</td><td>ab170099</td><td>一次抗体, LOT:GR305364-16</td></tr><tr><td>Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates</td><td>VWR</td><td>736-2044</td><td>imaging plates</td></tr><tr><td>Greiner, 384-well low volume polypropylene plates</td><td>VWR</td><td>784201</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive aluminum foil</td><td>VWR</td><td>30127790</td><td></td></tr><tr><td>Peelable aluminum seal</td><td>Agilent</td><td>24210-001</td><td>(PlateLoc</td></tr><tr><td>LY2228820</td><td>Selleckchem</td><td>S1494</td><td>p38&alpha 用)</td></tr><tr><td></td><td>Selleckchem</td><td>PH797804</td><td>p38 PH797804 阻害剤 BIRB796</td></tr><tr><td></td><td>Selleckchem</td><td>S1574</td><td>p38 &alpha 阻害剤</td></tr><tr><td>SB203580</td><td>Tocris</td><td>1202</td><td>p38 & alpha AMG</td></tr><tr><td>548</td><td>Tocris</td><td>3920</td><td>p38&alpha;阻害剤</td></tr><tr><td>RWJ 67657</td><td>Tocris</td><td>2999</td><td>p38&alpha;阻害剤</td></tr><tr><td>L-Skepinone</td><td>CBCS化合物コレクション</td><td></td><td>p38&α;阻害剤</td></tr>ウ<tr><td>シ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030</td><td>遮断剤</td></tr><tr><td>SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)</td><td>BDH</td><td>44244</td>抗原<td>賦活化に使用</td></tr><tr><td>抗原賦活化に使用</td> <td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8898</td></tr><tr><td>A-431細胞</td><td>ATCC</td><td>ATC-CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Echo 550</td><td>Labcyte</td><td></td><td>コンパウンドプレートの調製</td></tr><tr><td>用 プレートシーラー</td><td>Agilent</td><td></td><td>PlateLoc</td></tr><tr><td>バルク試薬ディスペンサー</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td>Multidrop Combi</td></tr><tr><td>自動液体ハンドリング</td><td>Agilent</td><td></td><td>Bravo リキッドハンドリングプラットフォーム; コンパウンドプレートの準備に使用</td></tr><tr><td>プレートワッシャー</td><td>Tecan</td><td></td><td>Hydrospeed</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>Julabo</td><td>TW12</td><td></td></tr><tr><td>熱電対</td><td>VWR</td><td></td><td>トレーサブルラボ温度計</td></tr><tr><td>ハイコンテントイメージャー</td><td>モレキュラーデバイス</td><td></td><td>ImageXpress Micro XLS ワイドフィールド ハイコンテント解析システム</td></tr></tbody></table>

付着性のセルのターゲット婚約を定量化するイメージングの高いコンテンツを使用してください。

Using High Content Imaging to Quantify Target Engagement in Adherent Cells

目的の蛋白質ターゲットと小分子の相互作用を量的に表わす創、ターゲットの検証および化学プローブ検証にとって重要です。蛋白質ターゲットまたは小さい分子のままこの現象の測定方法は、技術的には難しいと思う特に貴重です。細胞熱シフト試金 (CETSA) は、細胞内のターゲットの関与を監視する技術のひとつです。ここでは、単一細胞レベルでの細胞内局在化を維持しながら高いスループット測定できますオリジナルの CETSA プロトコルの適応について述べる。このプロトコルは CETSA の化合物ターゲット相互作用、特に細胞の異種個体集団の詳細な特性評価申請に重要な進歩を提供するいますと考えています。

図 1で説明したプロトコルでは、残りの可溶性タンパク質の検出と付着性のセルで高いコンテンツ イメージングによる CETSA 試金を実行するための基本的なワークフローについて説明します。このワークフローは、化合物や試薬14プレート レイアウトを変更することによりアッセイ開発のすべての段階に容易に適応することができます。我々 はいくつかの予想は以下の場合を使用して期待どおりの結果を詳しく説明します。
抗体の同定と分析法の開発。成功した結果を得るのための前提条件は一次抗体または熱時に形成された集計と沈殿した蛋白の存在下で蛋白質のネイティブ形式を選択的に認識するその他の適切な親和性の試薬の同定手順 3 で挑戦します。ここで説明した CETSA イメージング測定を確立するには、52 ° C、正と負のコントロールとの間の信号のウィンドウで ...

薬のターゲットの関与の測定、効果的な薬の開発と妥当性化学プローブの中心。ここでは、我々 は携帯電話熱シフト試金 (CETSA) のマイクロ プレート互換適応高コンテンツ イメージングを用いた創薬ターゲット婚約を測定するためのプロトコルを詳しく説明します。

Quantitating the interaction of small molecules with their intended protein target is critical for drug development, target validation and chemical probe ...

この方法は、化学生物学と創薬における重要な質問に答えるのに役立ちます。例えば、あなたの化合物は標的タンパク質に結合しますか?この手法の主な利点は、接着細胞の剥離の要件が無いということです。空間的な局在化はイメージングによって決定することができる。この方法は細胞株で適用しましたが、この方法を主要な培養物やコカルチャーなどの他の細胞系にも適用することも可能です。細胞を播種する前に、黒い384ウェルイメージングアッセイプレートを組織培養フードに入れ、標準ドリルを使用して各プレートの両端に3.5ミリメートルの直径の穴を作る前に、アルミニウム箔でプレートを覆います。プレートの準備ができたら、無菌技術を使用して、5〜10ミリリットルのPBSでA-431細胞培養を洗浄します。そして、細胞が剥離するまで摂氏37度でトリプシンの2ミリリットルで細胞をインキュベートします。計数後、培養培地で1ミリリットル当たり4番目の細胞に5倍10~4番目の細胞を希釈し、各アッセイプレートの各ウェルに40マイクロリットルの細胞をシードする。播種後の各プレートを左右に軽く振り、ウェルボトム全体の細胞の均質な分布を確保します。プレートエッジの効果を最小限に抑えるために、細胞が積層流フードの後ろの室温で20分間アッセイプレートの底に落ち着くようにしてから、プレートを摂氏37度と5%の二酸化炭素で2〜3日間カスタム加湿チャンバーに入れます。実験当日は、プレートワッシャーを使用して各ウェルから培地を吸引します。そして、適切な実験井戸に適切な実験濃度で目的の化合物の30マイクロリットルを加える。合成処理アッセイプレートを通気性のあるプレートシールで密封します。そして、30分間細胞培養インキュベーターにプレートを戻す。熱に挑戦する細胞を公開するには、まず、適切な実験温度に水浴を設定し、ウェル内の温度を監視するための温度温度計と一緒に、測定プレートと同様に同じ量の媒体を含む未密封のダミープレートを浴に入れます。適切な実験温度に達したら、各アッセイプレートから通気性シールを取り除き、密着した接着型アルミニウム箔でプレートを再密封して、その後の水浴の加熱中に井戸に水が漏れないようにします。プレートフレーム内のドリル穴をアクセス可能に保ちます。プレートの底を水面に向けて傾けて、プレートの下から残りの空気を強制的に押し付け、新しいダミープレートの温度の監視を開始して、アッセイプレートと新しいダミープレートを水浴に入れます。プレートの加熱もアッセイの性能にとって重要です。下に閉じ込められた気泡がなさそうな水浴にプレートを置くように注意してください。3分後、すぐに分析の前に5分間室温水の第二の水浴でプレートを冷却します。細胞を画像化するには、まず16%パラホルムアルデヒドの10マイクロリットルをアッセイプレートに直接加え、室温で20分間インキュベーションします。固定期間の終わりに、プレートウォッシャーに300マイクロリットルのPBSで細胞を洗浄し、室温で10分間インキュベーションするために0.1%NP40の20マイクロリットルを加えます。インキュベーションの終わりに、実例のように細胞を洗浄する。そして、1%ウシ血清アルブミン、またはBSAの15マイクロリットルの細胞を室温で1時間ブロックします。次に、プレートワッシャーを使用してブロッキング血清を吸引し、目的の一次抗体の10マイクロリットルを適切なウェルに加え、室温で1時間のインキュベーションを行います。インキュベーションの最後に、300マイクロリットルのPBSで各ウェルをよく洗い、適切な二次抗体の10マイクロリットルを光から保護した室温で1時間ラベル付けします。細胞の核染色の場合は、適切な核染料10マイクロリットルを室温で10分間各ウェルに加えます。そして、実証したようにPBSで細胞を洗浄する。セルに1ウェルあたり10マイクロリットルのセルマスクを室温で30分間ラベル付けします。続いてPBSで最後の洗浄が行われた。その後、各ウェルに新鮮なPBSの60マイクロリットルを分配し、イメージングまでアルミニウム箔でプレートを密封します。細胞を画像化するには、自動レーザーオートフォーカスを使用して10倍の目的で適切な蛍光チャネルを使用して高含有量イメージャー上のウェルあたり4つの画像をキャプチャし、取得中にビニングを適用します。次に、画像をメタデータと共に 16 ビットのグレースケールのドット tiff ファイルとして保存します。リガンド結合によって誘導され得る標的タンパク質の立体構造変化によって抗体認識が破壊されてはならない。例えば、BIRB796は、長いオフレートを有し、かつ、抗原検索ステップを適用することによってのみ、標的関与の定量が可能である。陽性および陰性対照化合物で処理された細胞に対する本代表熱凝集曲線実験は、種々の温度での化合物での細胞の処理後の典型的なタンパク質安定化範囲を例示する。ここで典型的な等温線量応答指紋実験は、実験化合物の異なる用量に応答してタンパク質安定化の代表的な範囲を示すことを示す。化合物スクリーニングのための等温熱課題を適用して、標的タンパク質の新規結合剤を同定することで、ヒットの等温線量応答フィンガープリントの前に、一度に1つの濃度で多数の化合物を分析し、標的タンパク質安定化を確認することができます。この手順を試みる間、熱の長さや温度などの正確な実験条件が化合物の観察力に影響を与えることを覚えておくことが重要です。パラホルムアルデヒドを使用すると非常に危険なことができますことを忘れないでください。また、制度上の安全ガイドラインに従うなどの予防措置は、この手順を実行する際に必ず講じる必要があります。

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