全取り付ける染色を用いた 3 D 白色脂肪組織構造の可視化
November 17th, 2018
現在の研究の焦点は、脂肪組織のアーキテクチャと細胞成分の 3 D イメージングのための理想的な方法として全取り付ける染色と可視化手法を示すことです。
この方法は、断食や肥満などの異なる代謝条件で細胞間相互作用と脂肪組織生理学がどのように変化するかなど、脂肪生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、元の脂肪3D構造を最適に保存し、通常、従来の免疫組織化学に必要な長い処理ステップを回避することです。この方法は脂肪組織の構造に関する洞察を提供することができるが、脳全体のマウント染色によって神経系などの他の器官系にも適用することができる。
一般的に、この方法に新しい個人は、特性組織部位を得ること、適切な固定期間を見つける、および最適な抗体濃度を見つけるのが困難のために苦労します。解剖が完了した後、1%パラホルムアルデヒド中の組織サンプルを含む皿を氷から室温に1時間移す。次に、組織を12または24ウェルの細胞培養プレートに移し、より迅速に洗浄します。
マウント全体の染色手順は、解剖直後に開始する必要があり、各ステップ間に一時停止ポイントがないことを覚えておくことが重要です。PBS-0.3Tで組織を22度傾けたシェーカーで、室温で毎分20〜25回の傾きで5分間洗浄します。この洗浄を2回繰り返します。
この後、5%動物血清を含むブロッキングバッファーの約0.5を1ミリリットルに加えます。前の条件を使用してシェーカーのプレートを1時間インキュベートします。ブロッキング溶液を吸引し、PBS-0.3Tで希釈した一次抗体を1%動物血清ずつ1%の一次抗体を各ウェルに加える。
22度の傾きと毎分20〜25の傾きの4°Cのシェーカーに一晩プレートをインキュベートします。翌日、PBS-0.3Tを使用して、室温で5分間洗浄します。この洗浄を2回繰り返します。
次いで、適切な希釈二次抗体溶液をそれぞれウェルに0.5ミリリットルから1ミリリットルの間に加えます。プレートをアルミホイルで包み、室温でシェーカーに1時間インキュベートします。この後、PBS-0.3Tを室温で2回洗浄して、1回5分間洗浄します。
中性脂質染色時に液滴の可視化が必要な場合は、1回の洗浄で1回PBSで2回洗浄し、5分間持続します。PBSで希釈した中性脂質染色を加え、室温で30分間インキュベートする。イメージングを開始するには、鉗子を使用して、24 x 60ミリメートルのガラスカバースリップに組織を平らに置きます。
DAPIによる核染色が望ましい場合は、DAPIを含む取り付け培地を1~2滴加えて組織を完全に水没させ、乾燥を防ぎます。次に、反転した共焦点レーザー顕微鏡システム上にスライドを置きます。複数の焦点面で全マウント染色された組織の画像を取得するには、所望の倍率で4〜6マイクロメートルのステップサイズで深さ100〜150マイクロメートルのZスタックを実行します。
本研究では、脂肪組織アーキテクチャを維持するために、全マウント染色が使用される。脂肪組織形態の変形につながる複数の処理ステップおよび断面を伴う方法とは異なり、全マウント染色法は脂肪細胞の形態を保存することができ、結果を解釈する際の精度を確保する。脂肪組織の過固定は固定性誘発蛍光を導き、これはチロシンヒドロキシラーゼおよびPECAM-1シグナルのような同一の領域を重ねることによって示すことができる。
しかし、適切に固定された全マウント染色サンプルは、個別の異なる信号を示し、これらの信号が自己蛍光ではないことを示す。全マウント染色された脂肪組織をイメージングすると、異なる実験条件下で形態変化を定量化することができます。特に脂肪組織は、エネルギーレベルの急激な変化時に代謝性恒常性を媒介する上で重要である、高血管化される。
例えば、C57黒6Jマウスは、24時間の断食を受けるが、脂肪分解を示す有意に小さい脂肪細胞サイズを示し、連続的に供給されたマウスと比較して血管密度の上昇傾向を示す。iDISCO+で脂肪組織をクリアすると、脂肪組織が光学的に透明になります。組織クリアを経た脂肪組織の免疫標識は、同じ倍率で組織をクリアすることなく、全体のマウント染色で観察されたものと比較して、はるかに密度の高い神経耕動を示す。
この手順を試みる間、PFAの室温で1時間以上サンプルをオーバーフィックスしないように注意することが重要です。しかし、サンプルが摂氏4度に固定されている場合、この固定期間は長引く可能性があります。この手順に従って、ImageJを用いた定量のような他の方法は、細胞構造、例えば、血液血管密度、様々な生理学的条件に応じて変化する方法のような追加の質問に答えるために行うことができる。
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概要
この研究は、脂肪組織の構造と細胞成分の3Dイメージングに理想的な全マウント免疫染色技術を実証します。この方法は、特に空腹時や肥満などの代謝条件下で細胞間相互作用と組織生理学がどのように変化するかについて、脂肪生物学の主要な問題に取り組むのに役立ちます。
主要な研究要素
研究分野
- 脂肪組織の構造
- 代謝条件下での細胞間相互作用
- 免疫染色技術
背景
- 脂肪組織形態を保存することの重要性
- 従来の免疫組織化学の限界
- 他の器官系における潜在的な応用
使用された方法
- 全マウント免疫染色
- 脂肪組織と他の器官系
- イメージングのための共焦点レーザー顕微鏡
主要な結果
- 全マウント染色は脂肪細胞の形態を保存し、結果の正確な解釈を可能にします
- 空腹時に脂肪細胞のサイズと血管密度の顕著な変化が観察されました
- 組織クリアリング後の神経構造の可視性が向上することを示します
結論
- この技術は脂肪組織の3D構造を効果的に保持し、代謝反応の研究を促進します
- 代謝研究に関連する脂肪組織の細胞構造と機能性に関する洞察を提供します
よくある質問
Executive Industry Relevance
Preserving native 3D adipose tissue architecture enables accurate assessment of metabolic responses and intercellular interactions under physiological stress. This approach supports target validation by maintaining morphological fidelity, reducing artifacts that confound mechanistic interpretation in obesity and diabetes research. Whole-mount staining provides a scalable, reproducible platform for phenotypic screening of adipose remodeling in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of adipocyte morphology and vascular density changes under metabolic conditions like fasting.
- Operational Value: Preserves intact tissue structure without sectioning artifacts, improving data reliability for target hypothesis testing.
- Predictive Value: Supports functional assessment of adipose tissue plasticity, aiding in de-risking targets involved in lipid metabolism and energy homeostasis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Compatible with lineage tracing and neutral lipid staining to quantify cellular fate and lipid storage dynamics.
- Operational Value: Standardized washing and blocking steps using PBS-0.3T and animal serum ensure reproducibility across samples.
- Scalability: Compatible with 12- or 24-well plate formats, facilitating medium-throughput imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables longitudinal assessment of adipocyte size and vascular remodeling in disease models.
- Operational Value: When combined with tissue clearing (e.g., iDISCO+), allows whole-organ neural mapping in adipose tissue.
- Translational Continuity: Supports correlation of structural changes with functional metabolic readouts like lipolysis and glucose homeostasis.
Pipeline & Workflow Integration
Whole-mount staining fits within the discovery continuum from target validation through phenotypic screening to preclinical assessment of metabolic tissue responses.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on how nutrient status alters adipose tissue architecture and cellular interactions.
- Screening: Enables standardized, quantitative imaging of adipocyte morphology and vascular density across experimental conditions.
- Analytics: Facilitates Z-stack confocal imaging and ImageJ-based morphometric analysis for objective comparison of structural phenotypes.
- Translational Research: Links structural observations (e.g., adipocyte shrinkage, vascular density) to physiological states like fasting-induced lipolysis.
- Enterprise Reuse: Adaptable to other organ systems (e.g., nervous system), increasing platform utility across discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by preserving native 3D tissue architecture for accurate phenotype interpretation.
- Operational Value: Minimizes processing steps and fixation variability, enhancing reproducibility across laboratories.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable structural data on target engagement in metabolic tissues.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on adipose tissue remodeling profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, fixation timing, and antibody optimization to avoid overfixation artifacts.
- Dependent on confocal microscopy infrastructure capable of Z-stack acquisition at 4–6 μm step sizes.
- Necessitates standardization of washing conditions (PBS-0.3T, 20–25 tilts/min, 22° tilt) for consistent staining.
- Adaptation to clearing protocols (e.g., iDISCO+) may be required for deep-tissue neural visualization.
- Limited by light scattering in uncleared tissues, restricting depth of accurate signal detection without clearing.
![[18F]FDGマイクロPET/MRイメージングを用いたマウスの褐色およびベージュ色の脂肪組織の可視化と定量化](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F62460.jpg%3Fv%3D2026-07-08T02%253A25%253A48.878Z&w=384&q=75)
