Name: RNA に基づく誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞のプログラムし直す (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: 学ぶ、修飾mRNAとマイクロRNAミミックを用いてヒト線維芽細胞をiPSCに効率的に再プログラミングする方法。フィーダー非依存性で高品質な多能性幹細胞を樹立し、疾患モデリングや再生医療への応用が可能です。

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健康の国民の協会 (T32AR007411-33) やコロラド大学皮膚疾患研究コアセンター (P30AR057212) からの支援を資金調達のために感謝しております。我々 も先天性表皮水疱症 (EB) 研究協力、EB 医療研究財団、治療 EB 慈善、筋ジストロフィー先天性表皮水疱症研究会 (デブラ) 国際、キング ボードウィン財団の Vlinderkindje 基金と感謝ゲートフロンティア基金。

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<li>Avci-Adali, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+synthesis+of+modified+mRNA+for+induction+of+protein+expression+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro synthesis of modified mRNA for induction of protein expression in human cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e51943(2014).</li>
</ol>

特許出願「メソッドと組成のリプログラミング細胞」、PCT 出願の権利で共同発明者は、g. b. I.K.PCT/US2016/063258。

このプロトコルでは、通常、疾患に関連するひと線維芽株の超高効率で Ips にプログラムし直すことができます、非統合、RNA に基づく臨床的に関連するメソッドについて説明します。までに、説明プロトコルの再設定を試みたすべてひと繊維芽細胞ライン下流用高品質 Ips の十分な数をもたらした。結果 Ips はすぐに転送し、フィーダー フリー培養条件で展開できます。
線維芽細胞リプログラミングの品質:
成功をプログラムし直す、線維芽細胞の開始の品質に大きく依存。理想的には、リプログラミングは最高の効率を達成するために利用可能な最も低い通路の芽を開始必要があります。2-4 の通路の線維芽細胞をリプログラミング効率お勧めします。リプログラミング扱うことができますまだ高通路 (通路 5-8)、線維芽細胞も老化、とはいえ効率が低下。時々 低通過線維芽細胞が利用できないまたは患者サンプル健全な成長を妨げる遺伝子の突然変異があります。この場合、めっき初期密度の最適化が必要。危険にさらされた線維芽株のリプログラミング、RNA transfections 中細胞死と通常関連付けられます。その結果、プログラムし直すも細胞は、リプログラミングの 10-14 日間で疎であると表示されます。よく表示を無細胞の大部分もされます。これは、場合は、リプログラミングのプロトコルは線維芽細胞の高い初期開始番号を再開始する必要があります。ほとんどの大人の線維芽細胞ラインのための一貫した動作形式 6 皿の井戸あたり 3,000 の入力セルをメッキします。ただし、5,000-10,000 (老齢線 50,000) にめっきの数を増やすことは、前文書8で報告されている疾患に関連するサンプルのリプログラミングを改善を助けるかもしれない。逆に、リプログラミングに耐性に細胞の密度にあまりにも早く到達できます。細胞 Rna をリプログラミングと transfections があまりにも急速に増殖かどうか (主な新生児線維芽細胞の場合は時々)、開始 6 ウェル フォーマット皿8ウェルあたり 500 線維芽細胞のリプログラミング。
遺伝子導入バッファーの処理:
遺伝子導入バッファー (8.2 pH に調整減少血清中) の pH は、このプロトコルをプログラムし直すために必要な最適なトランスフェクションの効率を達成するために重要です。このため、トランスフェクション バッファーの処理に関するいくつかの注意事項はお勧めします。遺伝子導入バッファーの大気への露出も短いバッファーの pH に影響を与えることが分かった.したがって、トランスフェクション バッファーは、最小限の空気スペース (5 または 15 mL スクリュー キャップ円錐管を使用) とスクリュー キャップの容器に検体する必要があります。さらに大気暴露を最小限に抑えるため、2 つの transfections の最大値の各遺伝子導入バッファー分注を使用します。最後に、温度影響 pH 以来トランスフェクション バッファーはトランスフェクションの複合体のアセンブリの RT に平衡するが重要です。暖かいは 37 ° c. にトランスフェクション バッファーをお勧め
Ips の通過。
多くの以前発行プロトコルをお勧めしますリプログラミングの終わりに個々 の iPSC コロニーを拾う、これはリプログラミング効率が非常に高い、または植民地を一緒に、クラスターのケースはよくある場合を達成するために難しいかもしれません、プロトコル。IPSC の植民地が互いに近くにある場合は、まず手動でコロニーを拾う前にプログラムし直された Ips を広げて細胞を継を推奨します。この初期の通路のステップを実行するいくつかの利点があります。植民地に広がるそれらを与える成長するより多くの部屋オリジナルよく達成される可能性がそれ以外の場合よりもはるかに大きいコロニー ピッキングの降伏。選択されたクローンから iPSC ラインを確立することで成功率が大幅に向上します。また、希釈比率ではある線維芽細胞, と追加の培養時間は選んだ iPSC の植民地の平均的な質を改善するために表示を見つけます。不完全なプログラムし直された線維芽細胞フィーダー フリー培養条件への直接移行を和らげるし、Ips を確立するために継続支援のパラクライン因子があります。線維芽細胞は偶然 Ips mTeSR1 で培養した場合と比較して選択成長欠点を持っています。したがって、汚染の線維芽細胞細胞集団はすぐに 3-4 の通路内で取るに足りない量を薄くなります。
Y-27632 など ROCK 阻害薬人間 Ips の日常文化によく使用されます。我々 は、いくつかの iPSC 行 Y-27632 の頻繁におよび/または拡張の文化が全体的な品質に有害な影響を持つことができますを発見しました。メソッドを継塊を使用する場合など、edta、Y-27632 必要はありません分割後 iPSC の生存を維持するために。我々 は完全に iPSC 分離や拡張、ルーチン文化 Y-27632 を補間メディアを排除しています。
プロトコルの制限事項:
説明 RNA に基づくリプログラミング アプローチの 1 つの制限は、初期費用とリプログラミング試薬の調製に伴う複雑さです。試薬すべてのルーチンは、以前されている mRNA を生成する準備手順説明 (PCRの in vitro転写、DNase 処理、キャッピング、脱燐酸化反応、精製)、累積的 mRNA 試薬の生産は比較的長いと非自明なプロセス。この議定書の他の主要な課題は transfect 細胞リプログラミングのプロトコルの労働強度の増加ごとの 48 h に必要です。これらの考慮事項は、のみいくつかの忍耐強いサンプルの書き換えが必要な場合は禁則であるかもしれないです。ただし、主な考慮事項は、臨床的に関連性の高い Ips または非常に高いリプログラミング効率を達成するための世代で説明 RNA 基づか初期化アプローチが理想的です。
要約すると、説明高効率 RNA 基づか初期化メソッドは、私たち以前の文書8に示す再プログラムする体細胞型の最適化されたトランスフェクション効率にかかっています。本研究で提示された RNA のトランスフェクション プロトコル主線維芽細胞のチューニングですが、様々 な体細胞のリプログラミング効率を改善する他の細胞型に合わせて調整することができます潜在的。

誘導多能性幹細胞 (Ips) に体細胞をリプログラミング多能性1,2を維持する上で重要な転写因子のコア セットの拡張表現が必要です。Ips 臨床応用のための生産、処理中に入力セル内変異の負担を最小限に抑える iPSC 生成の効率が比較的高いレベルで患者サンプルの間で維持されることが必要です。ただし、これらのどの限界の臨床的有用性アプローチ3非常に低のリプログラミング効率苦しんでいる無料の統合のプロトコルを含む、メソッドをリプログラミングの大半。リプログラミング効率も選択結果 Ips の変異導入による負担の増加、既存の突然変異を運ぶ細胞のリプログラミングを促進するかもしれません。さらに、すべて DNA に基づくリプログラミング手法、レンチ ウイルスと episomal-ベースのアプローチなどに苦しむ DNA がランダムにゲノムに統合し、有害な挿入変異と不要な (のための機会を作成することの安全性の懸念下流組織誘導体4多能性遺伝子の潜在的発癌性) の式です。
多能性細胞の効率的な誘導を達成し、結果 Ips の変異導入による負担を軽減する有望なアプローチは頂いたメッセンジャー Rna 合成を使用するを含む5をプログラムし直すための核酸塩基 (変更された Mrna) を変更します。変更された mRNA ベースのリプログラミング手法の効率は胚性幹細胞 (ESC) を追加することによりさらに高めることが-特定のマイクロ Rna (Mirna)-367/3023, と体細胞をプログラムし直すために示されている増加効率6 ,7。ただし、miRNAs-367/302 も併用変更リプログラミング mRNA ベースのアプローチはしばしば新鮮単離の患者細胞3アプリケーションで失敗します。この変更された mRNA ベースのアプローチのアドレスの矛盾に我々 は最近報告された高い成功率を持つ人間の一次繊維芽細胞に多能性を誘導する、両方の変更された Mrna のエンコーディングを利用して最適化された、無料の統合戦略リプログラミング因子と成熟 miRNA 367/3028を模倣します。本手法には, カクテル リプログラミングの変更された mRNA には OCT4 MyoD の転写活性化ドメイン (M3O と呼ばれる)9と 5 の他の初期化因子 (SOX2、KLF4、cMYC、LIN28A、NANOG) との融合の修正バージョンが含まれています。Mimics は、miRNA と多能性要因をエンコード変更された mRNA を結合このプロトコルの効率をリプログラミングの相乗効果が登場。RNA 遺伝子導入療法の最適化が追加細胞播種、培養条件と超高レベル8へのアプローチのリプログラミング効率化に必要です。
他の多くのプロトコルとは異なりプログラムし直す取り組み通常のみ数千入力線維芽細胞が必要です。さらに、多く一般的な非統合戦略 episomal プラスミドを用いた、センダイ ウイルス、または RNA の自己複製を含む生成された Ips でリプログラミングのベクトルを希釈する広範な継します。逆に、変更された mRNA と成熟 miRNA mimics 短い半減期を持ってし、細胞から急速に排除されます。一緒に取られて、患者サンプルと使用可能な Ips の世代の収集間累積的な細胞培養時間の量は、このアプローチ、効果的に結果の Ips で突然変異の蓄積を制限し、費用対効果では最小です。
8組合せ変更された mRNA/miRNA ベースのアプローチを使用して Ips に大人のひと線維芽細胞のプログラムし直す高効率を達成するために詳細な手順プロトコルを紹介します。この RNA 基づか初期化プロトコル統合無料 Ips 研究、潜在的な臨床応用を生成するための簡単で低コスト、かつ堅牢なメソッドを提供します。さらに、さまざまな困難な-に-再設定、疾患関連を含む線維芽、老化と老化線維芽細胞のリプログラミングに適用されます。線維芽細胞をプログラムし直すためのプロトコルの概略は図 1に示します。プロトコルは特に形式 6 ウェル プレートでの大人主線維芽細胞の 3 つの井戸をプログラムし直すための方法を説明します。2 つの井戸は通常高品質 iPSC コロニーの十分な数をもたらします。多くの場合も 1 つだけが必要です, と 3 番目もリプログラミング効率の解析に使えます。必要な場合、井戸の数をスケール アップすることができます。

<table><tbody><tr><td>PCR用プラスミドテンプレート</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.3_KLF4</td><td>Addgene</td><td>26815</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.3_SOX2</td><td>Addgene</td><td>26817</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.3_c-MYC</td><td>Addgene</td><td>26818</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.3_LIN28A</td><td>Addgene</td><td>26819</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt_hM3O</td><td>Addgene</td><td>の112638</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt_hNANOG</td><td>Addgene</td><td>112639</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt_mWasabi</td><td>Addgene</td><td>112640</td><td></td></tr><tr><td>Modified mRNA in vitro transcription and miRNA mimics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forward Primer</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>TTGGACCCTCGTACAGAAGC TAATACG</td><td></td></tr><tr><td>リバースプライマー (ウルトラマー、4nmol スケール)</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td>TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT CTTCCTACTCAGGCTTTATTCA AAGACCA</td><td></td></tr><tr><td>(ARCA Cap) 3&acute;-0-Me-m7G(5')ppp(5')G&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>S1411S</td><td></td></tr><tr><td>PFUウルトラIIホットスタート2xマスターミックス</td><td>アジレント</td><td>600850-51</td><td></td></tr><tr><td>5-メチルシチジン-5'-三リン酸</td><td>Trilink</td><td>バイオテクノロジーN-1014</td><td></td></tr><tr><td>南極ホスファターゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0289L</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>NEB</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>MEGAscript T7転写キット</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>シュードウリジン-5'-三リン酸</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>N-1019</td><td></td></tr><tr><td>Riboguard RNase Inhibitor</td><td>Lucigen</td><td>RG90910K</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean &コンセントレータ</td><td>ZymoResearch</td><td>R1019</td><td></td></tr><tr><td>Syn-has-miR-302a-3p miScript miRNA Mimic</td><td>Qiagen</td><td>MSY0000684</td><td></td></tr><tr><td>Syn-has-miR-302b-3p miScript miRNA Mimic</td><td>Qiagen</td><td>MSY0000715</td><td></td></tr><tr><td>Syn-has-miR-302c-3p miScript miRNA Mimic</td><td>Qiagen</td><td>MSY0000717</td><td></td></tr><tr><td>Syn-has-miR-302d-3p miScript miRNA Mimic</td><td>Qiagen</td><td>MSY0000718</td><td></td></tr><tr><td>Syn-has-miR-367-3p miScript miRNA Mimic</td><td>Qiagen</td><td>MSY0000719</td><td></td></tr><tr><td>Water (Nuclease free, Not DEPC-treated)</td><td>Fisher</td><td>AM9937</td> H2</O StemCell technologies#07903 <td>で修飾された mRNA および miRNA mimics</td></tr><tr><td>Fibroblast culture and reprogramming</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.1% Gelatin in Hsub2/></td>O <td>StemCell technologies</td><td>#07903</td><td></td> を希釈するために使用</tr><tr><td>Stericup-GV 滅菌真空ろ過システム</td><td>EMD ミリポア</td><td>SCGVU05RE</td> DPBS 2-メルカプトエタノール ThermoFisher Scientific 21985023 <td>6 ウェルプレート中のトランスフェクションバッファーと 0.5 mM EDTA の滅菌に使用します</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> (組織培養処理済み) Corning 3516 DMEM/F12 ThermoFisher Scientific 11320033 Fetal Bovine <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serum</td><td>Fisher</td><td>26-140-079</td><td></td></tr><tr><td>FGF Basic</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>phg0263</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax Supplement</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Glutamine supplement used for the prepration of media</td></tr><tr><td>Heat 不活化 FBS</td><td>Gibco Technologies</td><td>10438026</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト 血清交換</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10828010</td><td></td></tr><tr><td>リポフェクタミンRNAiMAXトランスフェクション試薬</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13778500</td><td>このプロトコルは、リポフェクタミンRNAiMAXトランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>MEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Scientific 11095080</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸</td><td>ThermoFisher Scientific Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>低血清培地、pHを8.2に調整してトランスフェクションバッファーを作るために使用、 500 mL</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 還元血清培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>31985062</td><td>還元血清培地、pHを8.2に調整してトランスフェクションバッファーを作るために使用 100</td></tr><tr><td>mL 10 M NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>ヌクレアーゼフリー水で希釈して1 M溶液を作り、pH調整</td></tr><tr><td>に使用します水(ヌクレアーゼフリー、DEPC処理なし)</td><td>フィ</td><td>ッシャーAM9932&nbsp;</td><td>NaOHを希釈し、pHメーターを洗浄するために使用します</td></tr><tr><td>Pen/Strep/Fungizone</td><td>GE Healthcare</td><td>SV30079.01</td><td></td></tr><tr><td>rhLaminin-521</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A29248</td><td>100 & microの濃度で供給されます。g/mL、リプログラミング手順のマトリックスとして使用</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)</td><td>Life Technologies</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0.25% Phenol Red</td><td>Life Technologies</td><td>2520056</td><td></td></tr><tr><td>Vaccinia Virus B18R (CF)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34-8185-86</td><td></td></tr><tr><td>iPSC culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>iPSCs EDTA培養用細胞外マトリックス(ECM)、</td></tr><tr><td>0.5 Mストック溶液</td><td>K&Dメディカル&nbsp;</td><td>RGF-3130</td><td>DPBSで0.5 mMに希釈し、フィルター滅菌し、iPS細胞継代</td></tr><tr><td>に使用する mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>85850</td><td>多能性幹細胞(PSC)培地は、線維芽細胞よりもiPS細胞に成長の利点を提供します</td></tr><tr><td>抗体および検出</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti Mouse (HRP conjugated)</td><td>Abcam</td><td>ab97046</td><td></td></tr><tr><td>Tra-1-60 (マウス抗ヒト)</td><td>Stemgent</td><td>09-0010</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素 (30%)</td><td>LabChem</td><td>LC154301</td> PBS ウシ血清アルブミン (BSA)<td>で 3% に希釈します</td></tr><tr><td>フィ</td><td>ッシャー</td><td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝サリン (PBS)&nbsp;</td><td>Hyclone</td><td>SH30258.02</td><td>10xとして供給され、1x</td></tr><tr><td>VECTOR NovaREDペルオキシダーゼ基質キット</td>に希釈します <td>Vector Laboratories</td><td>SK-4800</td><td></td></tr><tr><td>Special Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Description</td><td></td><td></td><td>Notes</strong</td></tr><tr><td>>Biological安全キャビネット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>定期的な加湿組織培養インキュベーター</td><td></td><td></td><td>デジタルメーター、ファイライト、または同等のものを使用して、CO2 を校正します。インキュベーターを5%CO2、37°Cに平衡化します。</td></tr><tr><td>トライガス加湿組織培養インキュベーター</td><td></td><td></td><td>デジタルメーター、ファイライト、または同等のものを使用して、CO2 を校正します。インキュベーターを5% CO2、5% O2、37°Cに平衡化します。</td></tr><tr><td>pHメーター</td><td></td><td></td><td>小数点以下2桁までの分解能が必要です。可能であればRNAワークに指定してください。</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td></td><td></td><td>トランスフェクション効率を監視するためにEGFPを可視化するように構成された顕微鏡。</td></tr></tbody></table>

rna に基づく誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞のプログラムし直す

RNA-based Reprogramming of Human Primary Fibroblasts into Induced Pluripotent Stem Cells

誘導多能性幹細胞 (Ips) は、発達や病気を研究する貴重なツールであると証明しました。さらに Ips、再生として治療を進める安全、堅牢なと方便のリプログラミング プロトコルが必要です。非統合アプローチを使用して Ips にひと真皮線維芽細胞のリプログラミング非常に高効率のための臨床的に関連性の高い、ステップバイ ステップ プロトコルを紹介します。プロトコルのコアは多能性の要因を表現する、(SOX2、KLF4、cMYC LIN28A、NANOG、OCT4 MyoD 融合)の in vitro転写メッセンジャー Rna 合成からヌクレオチド (変更された Mrna) を変更します。トランスフェクション リプログラミング変更された Mrna は、2 週間の主線維芽細胞成熟胚性幹細胞特異マイクロ Rna-367/302 mimics と共にすべての 48 h に。結果 iPSC 植民地が分離するし、フィーダー無料条件で直接展開できます。RNA のトランスフェクション養生法を含む各種のパラメーターを最適化する線維芽細胞標本全体効率とリプログラミング プロトコルの一貫性を最大化、transfections、培養条件および播種密度のタイミング。重要なは、私たちのメソッドはプログラムし直すことは困難高齢者、病気や老齢のサンプルを含む、ほとんどの線維芽細胞ソースから高品質の Ips を生成します。

通常、線維芽細胞リプログラミング Ips (図 1) の最初のバイアルの凍結開始から約 5-6 週間かかります。リプログラミングのプロトコルは、一般的に 2 つのフェーズに分類できます。フェーズ 1 では、線維芽細胞培養と分離、拡張、および iPSC の植民地の特性 7 transfections カクテル リプログラミングの RNA をすべての 48 の h. フェーズ 2 の実行が含まれます。
プロトコルを開始する、前に再プログラムする線維芽細胞が良い品質のものを確保されなければなりません。健康な線維芽細胞は紡錘形、バイポーラ、出現して倍加時間は約 24 時間で屈折します。0 日で日-2 10 cm 皿にメッキ 250,000 の細胞は 40-60% の confluency (図 10 日目) に成長し、約 6-10 x 10 の5セルを生成する必要があります。遅い速度で増殖細胞日-2、リプログラミングの 0 日目に高い密度でのめっきによって補正できます。
線維芽細胞リプログラミングの 6 ウェル フォーマット皿のウェルに非常に疎次めっきが現れます (図 2は、1 日目)。二十四時間の最初のトランスフェクションに続いて線維芽細胞は紡錘形を失い、リプログラミングの残りの部分を介して維持されるより丸みを帯びた形態 (図 22 日目) を採用します。MWasabi から緑色蛍光 mRNA 最小観察 2 日目、4 日目ではっきり見えるように明るさで着実に増加します。MWasabi 蛍光を検出する機能できますスコープの感度とセットアップによって異なります。細胞密度徐々 にかつ一貫して中に拡大する (日 1-6) の最初の 3 つの transfections 日 7 と 8 の間に発生する増殖の明白なバースト。セルは、(図 210 日目) 10 日で主合流になります。最初の iPSC 植民地することができます (図 211 日目) 11 日目には早く表示されます。しかし、植民地は 18 日として遅くまで観測可能なオブジェクトをできません。通常、日 15-18 がある大規模な明白な iPSC コロニー周辺、不完全なプログラムし直された線維芽細胞から明確に区別できる (図 215 日目、図 317 日)。トラ 1 60 多能性マーカーの免疫染色は、(図 317、トラ 1 60 日) リプログラミング効率を評価するために実行できます。私たちの経験ではほとんど線維芽収量当たりの植民地の何百もよく再プログラム (図 3、インセット B)。
準最適めっき密度プロトコル リプログラミングの減らされた効率のための最も一般的な理由し、病気、老化、または高通路線維芽細胞に頻繁に関連付けられています。播種密度が低すぎる場合 (図 4) をリプログラミングの終わりに大規模な無細胞不毛のパッチがあるし、iPSC コロニーがあります (図 4) を形成しません。プログラムし直された細胞は 14 日までに非常に合流する必要があります (図 4 aと4 bを図 2に比較 14 日目)。同様に、セルも密集をめっきまたは余りにすぐに増殖、リプログラミング効率が劇的に減少します。
患者由来の Ips の均質性を維持するために単一コロニーから細胞ラインを拡大することが重要です。リプログラミング効率は私達のプロトコルが非常に高く、近隣の iPSC コロニー近くに形成可能性があり、各別 (図 3、日 15-17) に成長します。クローン性増殖の単一コロニーを機械的に分離するが難しくもなります。我々 は、最初の通路をプログラムし直されたもし、大きな文化圏の間でそれを希釈に便利だ発見しました。良い通過率均等に分割プログラムし直された 6 よく形式プレートも全体の 6 ウェル プレートで構成されます。
次の希釈通路 Ips コロニーとして成長し、線維芽細胞 (図 518 日目) から簡単に区別できます。当初、iPSC のコロニーによって緩く詰まるかもしれない、および個々 のセルがある比較的大きな細胞質領域。4-7 日間にわたって、Ips は増殖し、定義されたエッジを持つ特徴的な密集コロニーを形成します。植民地内の個々 のセルは、小体 (図 522 日目) に大規模な原子力割合を持っています。各井戸を形成する多くの植民地があるはずし、iPSC の古典的な形態でのみ、拡大のため選ばれるべき。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58687/58687fig1.jpg"> 図 1: ひと繊維芽細胞へのリプログラミング誘導多能性幹細胞 (Ips).線維芽細胞のリプログラミングのスケマティック プロトコルが表示されます。線維芽細胞は、最初 6 ウェル フォーマット皿、48 h 間隔で 7 つの transfections に続いてのウェルに低密度で継代します。媒体ごとのトランスフェクション後交換 16-20 h は。プログラムし直された Ips が約一日 18、およびクローンのコロニーで継代最初の日 26 によって選択されます。通常、長期保管の場合、38 日目で iPSC の線維芽細胞由来線を固定できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58687/58687fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58687/58687fig2.jpg"> 図 2: リプログラミングのそれぞれの日中に代表的な毎日イメージ。線維芽細胞のリプログラミングを開始する通路の時に約 40-60% の合流をする必要があります (日 0、10 cm 皿にメッキパーツを多数細胞)。1 日目で最初のトランスフェクション (T1) が発生して、細胞に非常に疎なが表示されますこの時点で。次の日 (2 日目) より丸みを帯びた形態は明らかになるはずです。セルは、iPSC クラスター (赤丸部分) 11 日目には早くも見えはじめたプロトコル全体密度で増加していきます。15 日までに、iPSC のコロニーは控えめな境界と大きくなります。スケール バー = 200 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58687/58687fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58687/58687fig3.jpg"> 図 3: 次のリプログラミングと transfections コロニー形成変更 Mrna および miRNA を模倣します。低倍率撮影を行った日 15-17 リプログラミング代表。次の最終的なトランスフェクション プログラムし直された Ips 定義された境界のサイズが拡大し、不完全なプログラムし直された周囲線維芽細胞から明確に区別になることを凝縮と明確な植民地が形成されます。トラ 1 60 多能性マーカーの免疫染色は Ips (差込み A) の存在を示す、単一の井戸 (緑線で囲んで可算コロニーの差込み B、例) 内のすべてのコロニーをカウントすることによって効率をリプログラミングの計算に使用することができます。スケール バー = 1 mm.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58687/58687fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58687/58687fig4.jpg"> 図 4: リプログラミングのサブ最適なめっき密度の代表的なイメージです。(A, B)リプログラミングの 14 日目であまりにもスパースでは線維芽細胞の例 (図 2と比較して 14 日目)。大規模な不毛のパッチでリプログラミングの 17 日 (C) 低倍率のイメージは、赤で囲まれて。(D) 同じ井戸は修正され、トラ-1-60 全体的な貧困層を確認するために染色細胞密度が低いため効率をプログラムし直します。スケール バー = 200 μ m (a, B)、そして 1 mm (C, D)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58687/58687fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58687/58687fig5.jpg"> 図 5: 初期通過後 Ips の代表的なイメージです。変更された Mrna および miRNA を模倣、プログラムし直された細胞をリプログラミングと transfections を完了した後、日 17-20 で継代します。Ips は PSC 媒体の成長の利点があるし、不完全なプログラムし直され、繊維芽細胞を急速にオーバー テイクします。当初は、Ips は緩い定義が不十分な線で表示されるコロニーを形成します。数日以内、細胞は急速に増殖し、境界は明瞭に植民地にしっかりとクラスタ リング高核・細胞質比の堅く詰められた細胞の特徴的な形態を取る。スケール バー = 200 μ m.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58687/58687fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

ここで初期化因子をエンコード変更された Mrna を用いた誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞をプログラムし直すための臨床的に関連性の高い、高効率、フィーダー フリー法について述べるし、成熟したマイクロ Rna 367/302 を模倣しています。リプログラミング効率を評価する手法クローン iPSC のコロニーを拡大し、トラ 1 60 多能性マーカーの発現の確認も含まれます。

RNA に基づく誘導多能性幹細胞に主線維芽細胞のプログラムし直す

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) have proven to be a valuable tool to study human development and disease. Further advancing iPSCs as a regenerative ...

高効率のため、この方法は、ヒト疾患を研究し、新しい幹細胞療法を開発するためのツールとして、誘導多能性幹細胞、またはIPSCをさらに進めることができます。このプロトコルの主な利点は、再プログラムが困難、疾患関連、老化、老化線維芽細胞を含む原発性ヒト線維芽細胞から高品質の統合フリーIPSCを生成する能力である。この方法の成功は、線維芽細胞の最適なRNAトランスフェクション効率に依存する。トランスフェクションバッファーの pH を調整することは、これを達成するための重要な手順です。開始するには、500ミリリットルと100ミリリットルの室温で新鮮な減らされた血清培地のボトルを事前に温め、トランスフェクションバッファーを調製します。バッファーにpHメーターのガラス電極を挿入することにより、500ミリリットルのボトルで媒体のベースpHを測定し、pHを読み取る前に1分まで待ちます。pHを調整するには、水酸化ナトリウム1モル3~4ミリリットルを500ミリリットルのボトルに加えます。ボトルを閉じてよく混ぜます。5分間待った後、ボトルを開け、pHメーターの電極をバッファーに挿入します。pHメーターの読み取り値が安定するまで待ちます。pHが8.15〜8.17に達するまで、1モル水酸化ナトリウムの少量を追加し続け、プロセス中にpHメーターを数回較正することを確認します。トランスフェクションバッファーをフィルター処理するには、0.22 マイクロメートル真空ろ過システムを使用します。最小の空域で5ミリリットルの管に殺菌された緩衝液をアリコート。再プログラムされる線維芽細胞が40%〜60%の合流性であることを確認してください。4ミリリットルのDPBSを15ミリリットルの円錐状チューブに移し、100マイクロリットルの組換えヒトラミニン521を加える。上下にピペットを入れ、十分に混ぜます。希釈された組み換えヒトラミニン521の井戸当たり1ミリリットルを6つのウェルプレートの3つの井戸に加えます。このコーティングされたプレートを摂氏37度で2時間インキュベートします。このインキュベーションの間、6ミリリットルの線維芽細胞拡張培地と4ミリリットルのめっき培地を摂氏37度に温める。1ミリリットル当たり100ナノグラムの最終濃度で基本FGFとメッキ媒体を補い、1ミリリットル当たり200ナノグラムの最終濃度でB18Rを。40~60%合流の線維芽細胞から使用済み培地を慎重に吸引する。5ミリリットルのDPBSで細胞をすすいでください。3ミリリットルのトリプシンEDTAを加え、プレートをそっと揺らし、トリプシンEDTAで細胞を覆います。余分な液体を吸引し、約500マイクロリットルのトリプシンを残し、繊維芽細胞を摂氏37度で3分間インキュベートする。インキュベーターからプレートを取り外した後、しっかりと、しかし慎重に細胞を外すためにプレートの側面をタップします。顕微鏡下の細胞を見て、それらが取り外されたかどうかを確認します。切り離された細胞に5ミリリットルの線維芽細胞拡張培地を加えて、トリプシンEDTAを中和する。15ミリリットル円錐形のチューブに細胞を収集し、よくそれらを混合します。ヘモサイトータを用いて細胞を数え、次いでピペット12,000細胞を事前に調製した事前に温めためっき培地の4ミリリットルに入れた。インキュベーターから被覆されたプレートを取り除いた後、ウェルからラミニン521を吸引し希釈し、ウェルの表面が乾燥しないことを確認する。めっき培地中の細胞を穏やかに再懸濁し、コーティングされた各ウェルに1ミリリットルの細胞懸濁液を加えます。低酸素または酸素を5%に設定した三ガス組織培養インキュベーターにメッキされた細胞を入れ、下下、左右の動きの間で交互に細胞を穏やかに完全に分散させ、さらに2回動きを繰り返し、プレートを渦巻かないようにします。細胞を一晩インキュベートする。一方、15ミリリットルの円錐状チューブに4ミリリットルのリプログラミング培地を加え、一晩平衡化するために緩めたキャップを持つ低O 2インキュベーターに入れます。トランスフェクションの少なくとも1時間前に、低O2インキュベーターから平衡型リプログラミング培地を取り除く。1ミリリットル当たり100ナノグラムの最終濃度にbFGFを加え、B18Rを1ミリリットル当たり200ナノグラムの最終濃度に加え、よく混ぜます。一度に1つの井戸を働いて、使用済み培地を取り除くために1ミリリットルのピペットを使用してください。そして、1ミリリットルのリプログラミング培地に置き換え、bFGFおよびB18Rを補充する。低酸素インキュベーターに細胞を持つプレートを戻します。線維芽細胞トランスフェクションを開始するために、まずトランスフェクションバッファーのアリコートを室温で約1時間平衡化する。修飾MRNAの13マイクロリットルのアリコートを取り除き、MIRNA模倣物の14マイクロリットルのアリコートをマイナス80°Cから取り除き、解凍するまで約3〜5分間室温まで温めます。マイクロフュージでそれらを短時間回転させます。トランスフェクション試薬を室温まで約3~5分間温めます。チューブを2~3回反転して試薬を混合し、マイクロフュージで短時間スピンダウンします。室温トランスフェクションバッファーの 279 マイクロリットルを RNA フリーマイクロ遠心チューブに移し、トランスフェクション試薬の 31 マイクロリットルを加えます。ピペットで十分に混ぜ、室温で1分間インキュベートします。室温トランスフェクションバッファーの 132 マイクロリットルを変更 MRNA の 33 マイクロリットルアリコートに加え、ピペットを軽く混合します。MIRNAの14マイクロリットルのアリコートに室温トランスフェクションバッファーの102.6マイクロリットルを加え、穏やかにピペットを混ぜ合わせます。改変MRNAのトランスフェクションミックスを調製するために、トランスフェクションバッファーの310マイクロリットルの165マイクロリットルを加え、トランスフェクション試薬ミックスを165マイクロリットルのトランスフェクションバッファーに、改変MRNAミックスする。ミキシングするピペット。MIRNA模倣物のトランスフェクションミックスを調製するために、310マイクロリットルトランスフェクションバッファーの116.6マイクロリットルを加え、トランスフェクション試薬ミックスを116.6マイクロリットルトランスフェクションバッファーに、MIRNA模倣ミックス。よく混合し、室温で15分間インキュベートし、トランスフェクションバッファーが修正されたMRNAおよびMIRNAの模倣と複雑になります。低酸素インキュベーターから細胞を含むプレートを取り除きます。各ウェルを横切って賢明にドロップし、複雑化した改変MRNAを含むトランスフェクションミックスのウェルあたり100マイクロリットルを追加します。プレートを上に下げて十分に攪拌し、右の動きを左にしてトランスフェクション複合体を分散させます。複雑なMIRNAを含むトランスフェクションミックスのウェルあたり66.7マイクロリットルを加え、各井戸全体に落とします。プレートを上に下げて十分に攪拌し、右の動きを左にしてトランスフェクション複合体を分散させます。トランスフェクションされた細胞を含むプレートを低酸素の三ガスインキュベーターに入れる。トランスフェクション複合体を、上に下にしてプレートを十分に攪拌し、右の動きを緩やかに攪拌して分散させます。翌日培地を変える前に、16〜20時間インキュベーターでトランスフェクトされた細胞をインキュベートする。リプログラミング培地を4ミリリットルを15ミリリットルの円錐チューブに加え、一晩平衡化するために緩めたキャップを持つ低O 2インキュベーターに入れます。翌朝、トランスフェクション含有培地をbFGFおよびB18Rで補充された新鮮な事前平衡培地に置き換え、プロトコルに記載されているようにトランスフェクションレジメンを継続する。リプログラミング用の6つのウェルフォーマット皿の井戸にメッキに成功した後、線維芽細胞は非常にまばらに見えました。最初のトランスフェクションに成功してから24時間後、線維芽細胞は紡錘の形を失い、より丸みを帯びた形態を採用した。最初の3つのトランスフェクションを通じて、細胞密度は徐々に一貫して増加し、7日目から8日目の間に起こる明らかな増殖バーストで増加した。10日目までに、細胞は主にコンフルエントに現れた。最初のIPSCコロニーは早ければ11日目に出現した。15日から17日目までに、IPSCコロニーは大きく、明白になり、周囲と完全に再プログラムされた線維芽細胞とは明らかに区別された。多能性マーカーTRA-1-60に対する免疫染色は、高いリプログラミング効率を確認した。最適でないめっき密度は、このプロトコルにおけるリプログラミングの効率を低下させる最も一般的な理由です。めっき密度が低すぎると、大きな細胞バロンパッチが出現し、IPSCコロニーが形成されなかった。再プログラムされた細胞の希釈の通過に続いて、IPSCは単一のコロニーとして成長し、線維芽細胞から容易に区別できた。それらは緩やかに詰め込まれ、個々の細胞は比較的大きな細胞質領域を有していた。4~7日間の間に、IPSCは増殖し、定義されたエッジを持つ特徴的な密集したコロニーを形成しました。コロニー内の個々の細胞は、顕著な核子を有する大きな核分画を示した。患者線維芽細胞を再プログラミングした後、得られたIPSCは、メカニズムを引き起こす疾患を解明したり、新しい再生細胞ベースの治療薬を開発するために、様々な体細胞に分化することができる。

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