細胞接着促進における補体タンパク質C1qとヒアルロン酸間の相互作用の評価
2019年6月15日
補体成分C1qは、細胞外マトリックスと相互作用しうる組織微小環境において高度に発現する炎症性分子である。ここでは、ヒアルロン酸に結合したC1qが細胞接着にどのように影響するかを試験する方法について述述する。
細胞接着促進における補体タンパク質C1qとヒアルロン酸の相互作用を評価するための包括的な手順。我々は最近、自然免疫系の分子であるC1qの補体が腫瘍および胎盤微小環境において高発現し、細胞外マトリックスの成分と相互作用することができると定義した。この場合、ヒアルロン酸。
タンパク質の生物学的機能をエクロノミック環境全体で研究する方法を提案する。これらの分子の能力を調べるため、細胞外マトリックス因子の細胞分裂特性を形成する。この相互作用が環境の組織に存在する細胞によってどのように感知できるかを研究するために、我々は、ヒト組織由来のバイナリ細胞が細胞外マトリックス(この場合はヒアルロン酸)に結合したC1qに付着することを許されるこの容易な方法を設定した。
コーティング手順の第1段階は、高分子量ヒアルロン酸を96ウェル組織被覆マイクロプレートに結合することである。コーティングの場合、ヒアルロン酸は、1ミリリットル当たり15マイクログラムの濃度で0.1モル炭素バッファーPH 9.6で希釈される。そして穏やかに配管は均質な解決を達成するために報される。
100マイクロリットルの溶液を使用して、ウェルをコーティングします。プレートは、一晩摂氏4度で移動します。翌日、処理された井戸を真空吸気する。
dPBSで一度洗います。対応するウェルに C1q または BSA を追加します。C1qは、今日では1ミリリットル当たり1ミリグラムの濃度で市販されており、1ミリリットル当たり25マイクログラムの濃度で希釈されています。
そして、0.5%BSAと0.7ミリモルカルシウムとマグネシウムと二価カチウムを含むdPBS。BSA LPS フリーは、0.5% および日付 PBF の濃度で使用されます。プレートは、一晩摂氏4度で移動します。
固定化ヒアルロン酸とのC1q用量依存相互作用は、酵素結合免疫SAによって決定される。高速 DiI でラベリングするセル。親油性トレーサー高速DiIは、対象の細胞にラベルを付けるために使用されます。dPBSで再懸濁した細胞は、1ミリリットル当たり100万個の細胞の濃度で使用される。
高速DiIは、細胞懸濁液に直接1〜100を希釈する。細胞懸濁液は手動で混合し、15分間摂氏37度で移動する。5分間のインキュベーションの後、細胞懸濁液を混ぜ、この操作をさらに2回繰り返します。
速いDiIの過剰を除去するために、dPBSの10ミリリットルを加える。250gで静かに上下に旋回し、遠心分離機を7分間回転させます。0.1%BSAの存在下でヒトの好酸血清遊離培地の1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。
ヒアルロン酸C1qマトリックスに対する細胞接着性。コーティングされた井戸からdPBSを真空吸引する。100マイクロリットルの標識された細胞懸濁液をコーティングされた井戸に分配する。
200マイクロリットルの標識された細胞は、標準的な曲線生成に使用されるエプ耐えチューブで分解される。プレートを摂氏37度で35分間インキュベートします。インキュベーターからプレートを取り出します。
バランスの取れた細胞をそっと吸引する。0.5%BSAと0.7ミリモルのカルシウムとマグネシウムを含むdPBSで1回洗浄します。200マイクロリットルのライシスバッファーを添加することにより接着細胞をlysする。
同時に、溶解バッファー内の標識された細胞の 1 ~ 2 つの連続希釈時に標準曲線を調製します。544ナノメートルを励起波長、590ナノメートルを発光波長として使用し、無限F200 T缶計測器で蛍光信号の読み取りを行います。代表結果。
代表結果に示すように、ヒアルロン酸に対する細胞接着は、HA単独またはHA結合BSAと比較して強く増強されたC1qを発見したのが明らかである。各マトリックスの接着セルのパーセントは、標準曲線に基づいて計算されます。結論。まず、補体成分C12が、この場合、ハイアルロン酸を有する金属を用いて細胞外マトリックスに結合する能力を評価した。
次に、蛍光色素で染色されたヒト初等細胞の能力を分析し、結合ヒアルロン酸を求めた。今回の研究で提案したモデルは、この細胞間応答を刺激の組み合わせに対する評価用に、細胞外マトリックス足場の3Dモデルに代わる、より速く、より安価な方法である。
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概要
この研究は、補体成分C1qとヒアルロン酸の相互作用を探り、この相互作用が細胞接着にどのように影響するかに焦点を当てています。炎症を促進する分子であるC1qは、腫瘍と胎盤の微小環境で著しく発現しています。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 免疫学
背景
- C1qは自然免疫系の一部です。
- 特定の組織の微小環境で高度に発現しています。
- C1qは細胞外マトリックスの成分と相互作用します。
- ヒアルロン酸は細胞外マトリックスの主要な成分です。
研究目的
- 細胞接着におけるC1qの役割を評価すること。
- ヒアルロン酸に結合したC1qが細胞の挙動にどのように影響するかを調査すること。
- 細胞外環境におけるタンパク質相互作用を研究する方法を開発すること。
使用された方法
- ヒト組織由来の二分割細胞が利用されました。
- 細胞がヒアルロン酸に結合したC1qに接着することが許可されました。
- 評価のための包括的な手順が確立されました。
- 細胞外マトリックスの文脈でタンパク質の生物学的機能が評価されました。
主な結果
- C1qとヒアルロン酸の相互作用は細胞接着を促進します。
- 細胞は細胞外マトリックスにおけるC1qの存在に反応します。
- この方法は細胞外因子に影響される細胞分裂特性についての洞察を提供します。
- 結果は組織環境における免疫応答の理解に影響を与える可能性があります。
結論
- C1qはヒアルロン酸との相互作用を通じて細胞接着において重要な役割を果たします。
- 開発された方法はタンパク質相互作用のさらなる研究に適用できます。
- これらの相互作用の理解は様々な組織における免疫系機能の知識を深める可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Understanding how complement protein C1q modulates extracellular matrix components like hyaluronic acid provides mechanistic insight into tumor-stroma interactions that drive adhesion-mediated progression. This assay enables early de-risking of targets involved in microenvironmental remodeling by quantifying how immune-derived signals alter matrix-dependent cell behavior. The method supports target validation in immuno-oncology by linking innate immune effectors to functional extracellular matrix changes relevant to metastatic competence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates how C1q binding to hyaluronic acid alters matrix properties to influence tumor cell adhesion, supporting functional target validation of microenvironmental mediators.
- Operational Value: Enables hypothesis testing of complement-driven matrix remodeling in a controlled, reproducible format using primary human tumor-derived cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence-based readouts of cell adhesion to C1q-HA matrices, enabling dose-response analysis of protein-matrix interactions.
- Operational Value: Uses a standardized 96-well coating protocol with defined concentrations of HA (15 µg/mL) and C1q (25 µg/mL) to ensure assay reproducibility across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models how tumor-expressed C1q reshapes HA-mediated adhesion, offering a disease-relevant system to study stromal activation in neoplasia.
- Operational Value: Bridges discovery and preclinical work by providing a scalable method to evaluate matrix-targeted interventions using clinically relevant human cell inputs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement to phenotypic screening, where matrix-dependent adhesion serves as a functional readout of pathway modulation in the tumor microenvironment.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by testing whether C1q-HA interaction drives pro-adhesive phenotypes in primary human tumor cells.
- Screening: Delivers standardized, quantitative adhesion outputs compatible with medium-throughput evaluation of modulators of protein-matrix binding.
- Analytics: Fluorescence signal quantification via standard curve enables precise comparison of adhesion conditions across HA, C1q-HA, and BSA-HA matrices.
- Translational Research: Uses human tumor-derived cells and physiologically relevant matrix components to enhance translational confidence in microenvironmental targeting strategies.
- Enterprise Reuse: Platform can be adapted to study other extracellular matrix proteins and immune mediators beyond C1q and HA, supporting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in tumor-stroma communication by isolating the effect of C1q on HA-dependent adhesion.
- Operational Value: Defined coating and blocking steps (e.g., overnight 4°C incubation, dPBS washes) promote assay standardization and inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by quantifying how immune matrix interactions influence early tumorigenic behaviors like anchorage-dependent growth.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets involved in complement-matrix crosstalk based on functional adhesion outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein coating, cell culture, and fluorescence-based quantification techniques.
- Dependent on access to fluorescence microplate readers capable of excitation at 544 nm and emission at 590 nm for fast DiI detection.
- Necessitates standardization of cell labeling protocols (e.g., fast DiI dilution, incubation times) to ensure consistent signal across experiments.
- Adaptation to other matrix proteins may require optimization of coating buffers and incubation conditions to maintain protein functionality.
- Limitations include reliance on 2D adhesion models, which may not fully capture 3D stromal complexity observed in vivo.
