Name: 細胞接着促進における補体タンパク質C1qとヒアルロン酸間の相互作用の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 学ぶ C1qとヒアルロン酸の相互作用による細胞接着促進メカニズム。ヒト由来細胞を用いた実験系で、補体タンパク質の細胞外マトリックスにおける機能を評価する手法を解説します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、HA、レオナルド・アマディオ、ガブリエラ・ジト(IRCCS「ブロ・ガロフォロ」、トリエステ、イタリア)とアンドレア・ロマーノ(解剖学と病理学の手術臨床ユニット、カティナラ病院、トリエステ、イタリアの婦人科の部門)を提供するためのイワン・ドナティに感謝します)を使用して、組織サンプルコレクションを行います。また、ニコロ・モロシーニがビデオの準備とアレックス・コッポラの声に助けをしてくれたことに感謝します。この研究は、母子保健研究所、IRCCS「ブロ・ガロフォロ」、トリエステ、イタリア(RC20/16)、フォンダジオーネ・カッサ・ディ・リスパルミオ・トリエステからR.Bullaへの助成金によって支援されました。

患者からの組織サンプルは、イタリアのトリエステ大学病院の機関委員会による倫理的配慮の承認を受けた後、インフォームドコンセントの後に収集されました。
1. 腫瘍細胞の単離と培養(1日目)
<ol><li>MPM固体標本からヒト中皮腫細胞を単離する。約2-3mm2の断片をカッターで細かくミンチし、ハンクスのバランス塩溶液(HBSS)で構成された消化溶液の5mLでインキュベートし、0.5mM Ca2+/Mg 2+、0.5%トリプシンおよび50 μg/mLを補充DNase I,4°Cで一晩。</li>
	<li>腫瘍細胞の単離と培養(2日目)<ol>
<li>一晩インキュベーションした後、消化した組織を37°Cのインキュベーターに30分間入れ、穏やかな揺れを起こす。</li>
		<li>遠心分離(250 x g)時の消化液を3mg/mLコラゲナーゼタイプ1をHBSSで中5mLに溶解し、さらに37°Cで30分間インキュベートします。</li>
		<li>10%の熱不活性化胎児ウシ血清(FBS)を加えることによって酵素反応をブロックする。5 mLピペで細胞を非常に慎重に再中断し、細胞のほとんどが組織から放出されることを確認します。次に、100 μmの細孔フィルターを通してセル懸濁液を濾過する。</li>
		<li>12.5 cm2フラスコで細胞を播種し、ヒト内皮細胞無血清培地(HESF)で37°Cで培養し、10%FBSでEGF(10 ng/mL)、塩基性FGF(20ng/mL)、および1%ペニシリン-ストレプトマイシンを加えた。 注:2-3日ごとに新鮮な媒体に交換してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. HAコーティング(1日目)
<ol><li>1 mg/mL6の濃度で二重蒸留水で高分子量HA(1.5 kDa)を再中断する。</li>
	<li>穏やかなピペッティングで炭酸塩/重炭酸塩バッファー(0.1M、pH 9.6)で50 μg/mLにHAストック溶液を希釈します。</li>
	<li>96ウェルプレートを100μLの希釈HAストック溶液で一晩4°Cでコーティングします。 注:ヒアルロン酸は、トリエステ大学生命科学部のイワン・ドナティ教授からの親切な贈り物でした。</li>
</ol>3. C1qコーティング(2日目)
<ol><li>一晩インキュベーションの後、真空は処理されたウェルを吸引し、井戸あたり100 μLのダルベッコのPBS(dPBS)で96ウェルプレートを洗浄します。</li>
	<li>DPBS + 0.5% BSA および 0.7 mM Ca2+Mg /2+ でこれらのタンパク質を 25 μg/mL の濃度でインキュベートすることにより、C1q (25 μg/mL または用量応答実験用の異なる濃度) または BSA (負の対照として) をプラスチック固定化-HA に結合できるようにします。.その後、4°Cで一晩インキュベートします。</li>
	<li>真空は井戸を吸引し、dPBSの100 μL/ウェルで96ウェルプレートを洗浄します。</li>
</ol>4. FAST DiIによる細胞ラベリング
<ol><li>蛍光色素FAST DiIの10 μg/mLを含むdPBSの500 μLの500 μLの腫瘍細胞を再中断する。ラベリング用の5%v/vCO2インキュベーターで37°Cで15分間インキュベートし、5分間隔後に手動で混合する。<ol>
<li>過剰なFAST DiIを除去するには、dPBSの10 mLを追加し、ピペットを上下に優しく、遠心分離機を250 x gで7分間7分間、0.1%BSAを含むヒト内皮血清フリー培地の1mLで細胞ペレットを再ステーペンする(HESF + 0.1%BSA)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. HA/C1qマトリックスの細胞接着(1日目)
<ol><li>真空は、異なるマトリックスでコーティングされたウェルを吸引する(ウェルはステップ3.2で被覆された)。</li>
	<li>標識された細胞懸濁液の100 μLを被覆ウェルに分配し、プレートを37°Cで35分間インキュベートし、5%v/v CO2インキュベーターに入れます。</li>
	<li>上清を吸引して非付着細胞を除去する。0.5% BSA、0.7 mM Ca2+および 0.7 mM Mg2+を含む dPBS で一度洗浄します。
</li>
	<li>10 mM Tris-HCl、pH 7.4 + 0.1% v/v SDSの200 μL/ウェルを加えて付着細胞をlyseし、蛍光リーダー(544nm、発光590nm)を使用して96ウェルプレートを直ちに読み取り、ラベルの数を増やすリサイジングを通して生成された較正曲線を使用して細胞。</li>
</ol>

<ol><li>Zamboni, F., Vieira, S., Reis, R. L., Oliveira, J. M., Collins, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+hyaluronic+acid+in+immunoprotection+and+immunomodulation%3A+Chemistry%2C+processing+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Materials+Science%22%5BJournal%5D)">The potential of hyaluronic acid in immunoprotection and immunomodulation: Chemistry, processing and function.</a> Progress in Materials Science. 97, 97-122 (2018).</li>
<li>Lorusso, G., Ruegg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+microenvironment+and+its+contribution+to+tumor+evolution+toward+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The tumor microenvironment and its contribution to tumor evolution toward metastasis.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (6), 1091-1103 (2008).</li>
<li>Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement%3A+a+key+system+for+immune+surveillance+and+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis.</a> Nature Immunology. 11 (9), 785-797 (2010).</li>
<li>Bulla, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1q+acts+in+the+tumour+microenvironment+as+a+cancer-promoting+factor+independently+of+complement+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">C1q acts in the tumour microenvironment as a cancer-promoting factor independently of complement activation.</a> Nature Communications. 7, 10346(2016).</li>
<li>Winslow, S., Leandersson, K., Edsjo, A., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+stromal+gene+signatures+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Prognostic stromal gene signatures in breast cancer.</a> Breast Cancer Research. 17, 23(2015).</li>
<li>Collins, M. N., Birkinshaw, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid+solutions%3A+A+processing+method+for+efficient+chemical+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid solutions: A processing method for efficient chemical modification.</a> Journal of Applied Polymer Science. 130 (1), 145-152 (2013).</li>
<li>Itano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+primary+structure%2C+complex+turnover+regulation+and+multiple+roles+of+hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simple primary structure, complex turnover regulation and multiple roles of hyaluronan.</a> Journal of Biochemistry. 144 (2), 131-137 (2008).</li>
<li>Agostinis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+role+of+C1q+in+cell+migration+and+tissue+remodeling%3A+contribution+to+trophoblast+invasion+and+placental+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">An alternative role of C1q in cell migration and tissue remodeling: contribution to trophoblast invasion and placental development.</a> Journal of Immunology. 185 (7), 4420-4429 (2010).</li>
<li>Agostinis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+Protein+C1q+Binds+to+Hyaluronic+Acid+in+the+Malignant+Pleural+Mesothelioma+Microenvironment+and+Promotes+Tumor+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Complement Protein C1q Binds to Hyaluronic Acid in the Malignant Pleural Mesothelioma Microenvironment and Promotes Tumor Growth.</a> Frontiers in Immunology. 8, 1559(2017).</li>
<li>Bossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C1q+as+a+unique+player+in+angiogenesis+with+therapeutic+implication+in+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">C1q as a unique player in angiogenesis with therapeutic implication in wound healing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (11), 4209-4214 (2014).</li>
<li>Hosszu, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+expression+and+function+of+the+macromolecular+c1+complex+on+the+surface+of+human+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cell surface expression and function of the macromolecular c1 complex on the surface of human monocytes.</a> Frontiers in Immunology. 3, 38(2012).</li>
<li>Laurent, T. C., Fraser, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hyaluronan.</a> Journal of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 6 (7), 2397-2404 (1992).</li>
<li>Gaboriaud, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+crystal+structure+of+the+globular+head+of+complement+protein+C1q+provides+a+basis+for+its+versatile+recognition+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The crystal structure of the globular head of complement protein C1q provides a basis for its versatile recognition properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (47), 46974-46982 (2003).</li>
<li>Lam, J., Truong, N. F., Segura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+cell-matrix+interactions+in+hyaluronic+acid+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Design of cell-matrix interactions in hyaluronic acid hydrogel scaffolds.</a> Acta Biomaterialia. 10 (4), 1571-1580 (2014).</li>
</ol>

著者らは、この研究は、潜在的な利益相反と解釈される可能性のある商業的または財政的な関係がない場合に行われたと宣言している。

ヒアルロン酸と相互作用する補体成分C1qが、ヒト腫瘍組織から単離された原発細胞の挙動を調節する方法を調べるための簡単な方法を説明する。HAおよびC1qは両方とも生理学的および病理学的条件下で組織微小環境に豊富に存在し、いくつかの細胞生物学的プロセスに関与する。例えば、C1qは胎盤の微小環境に存在することが示されており、胎盤8の間に母性決定権の外陰性栄養芽細胞侵行を支持する。C1qはまた、組織再生および修復10に必要な血管遺伝学的プロセスを促進する創傷治癒皮膚に沈着する。最後に、C1qは、いくつかの異なる腫瘍組織4で同定されている。高分子量HAは血管新生および増殖のための自然な障壁であり、最近の証拠はC1qが補体活性化における古典的な役割に加えて、ECM分子として作用し、細胞移動を好むことを示した。
本研究の新規性は、C1qとHAの結合がHAとの腫瘍細胞の相互作用を強く修飾するという知見に含まれる。このメソッドをセットアップするには、いくつか...

腫瘍微小環境(TME)は、細胞の生存、増殖および侵入に寛容なニッチを提供することができるので、癌の発達および進行に影響を与える。TMEにおける新しい主要なプレーヤーの同定は、標的治療のための新しい分子ツールの発見に役立つ可能性がある。TMEは、内皮細胞、線維芽細胞および免疫系の細胞などの非悪性細胞の複雑かつ動的なネットワークを含み、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンを含む周囲の細胞外マトリックス(ECM)成分に埋め込まれ、プロテオグリカンとヒアルロナン。腫瘍細胞と非腫瘍細胞の両方が、サイトカイン、ケモカイン、成長因子および炎症およびマトリックスリモデリング酵素と共にECM成分を合成し、分泌し、TMEの物理的、化学的およびシグナル伝達特性を全体的に変化させます。これらの成分の中で、ヒアルロン酸(HA)は腫瘍生物学において重要な役割を果たすために出現した。その単純な化学組成にもかかわらず、HAは、そのHA結合分子(ヒャラデリン)と共に、血管新生、免疫系応答性およびECMリモデリングを大きさおよび濃度依存的な方法1で調節することができる。
補体(C)システムは、最近注目を集めているローカルTMEの一部でもあります。C系は、非自己細胞、不要な宿主要素および病原体に対する防御の第一行に関与する可溶性および膜結合タンパク質のセットを包含する。機能的には、Cは、直接細胞死または炎症反応2の取り付けを促進するために、先天的および適応系の2エフェクターアームをリンクする。C活性化は、癌細胞を破壊したり、その増殖を阻害することによって腫瘍増殖を抑制することができるが、慢性炎症を持続することにより腫瘍促進活性を有することがますます明らかになってなくなって、免疫抑制milieuは、血管新生を誘導し、癌関連シグナル伝達経路3を活性化する。この文脈において、C1qは、C系の古典的経路の第1認識分子が、C活性化4とは無関係に腫瘍微小環境において重要な機能を発揮するために出現した。C1qは、血管新生および転移に加えて癌細胞の接着、移行および増殖を支持することができるヒト悪性腫瘍の範囲によって局所的に発現することが示されている5。興味深いことに、C1qはHAなどのECMの主要な構成要素と相互作用する。
原発性癌細胞を腫瘍塊から分離する技術を開発した。さらに、腫瘍微小環境、特にC1qと高分子量ヒアルロン酸との相互作用を刺激するマトリックスを作成しました。HAに結合したC1qは、腫瘍細胞の接着を誘導することができた。

<table><tbody><tr><td>100&シンスプ;&マイクロ;mポア</td><td>フィルターBDファルコン</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>アムホテリシンB溶液(菌類)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr><td>基礎FGF</td><td>免疫科学</td><td>GRF-15595</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C-4901</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼI型</td><td>Worthington Biochemical Corporation, DBA</td><td>MX1D12644</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>DNase I&nbsp;</td><td>ロシュ</td><td>10 104 159 001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>60-00-4</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Immunological Sciences</td><td>GRF-10544</td><td></td></tr><tr><td>FAST DiI</td><td>Molecular probes, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific</td><td>D7756</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco,&nbsp;サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>ロシュ</td><td>細胞</td>培養用11051407001<td></td></tr><tr><td>フラスコ</td><td>コーニング</td><td>430639</td><td>滅菌済み、通気式</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン溶液</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G1397-10ML</td><td></td></tr><tr><td>ハンク平衡塩溶液(HBBS)&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>H6648</td><td>EDTA、グルコース、ペニシリン-ストレプタマイシン、ゲンタマイシン、真菌ゾーンを補給</td></tr><tr><td>高分子量ヒアルロン酸</td><td>イワン・ドナティ</td><td></td><td></td>教授による親切な贈り物</tr><tr><td>ヒト内皮血清フリー培地&nbsp;</td><td>ギブコ、&nbsp;サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>11111-044</td><td>EGF(5&thinsp;ng/mL)、塩基性FGF(10μm;ng/mL)、および&nbsp;1%ペニシリン&ndash;ストレプトマイシン(Sigma-Aldrich)</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td>カル<td>ロエルバ</td><td>13446-18-9</td><td></td></tr><tr><td>ミディアム199ハンク'塩</td><td>シグマ・アルドリッチ&nbsp;</td><td>M7653</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>タイムラプス顕微鏡&nbsp;</td><td>ニコン&nbsp;</td><td>イメージングシステム BioStation IM-Q</td><td></td></tr><tr><td>Titertek Multiskan ELISA Reader</td><td>Flow Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T4674</td><td></td></tr></tbody></table>

細胞接着促進における補体タンパク質c1qとヒアルロン酸間の相互作用の評価

Evaluation of the Interplay Between the Complement Protein C1q and Hyaluronic Acid in Promoting Cell Adhesion

腫瘍微小環境が新生物の成長および転移に積極的な役割を果たしていることをますます実証されている。異なる経路を通じて、腫瘍細胞は刺激因子、ケモカインおよびサイトカインを分泌することにより、間質細胞、免疫細胞および内皮細胞を効率的に募集することができる。次に、これらの細胞は、高い増殖および転移能力を維持するために、成長促進シグナル、代謝産物および細胞外マトリックス成分を放出することにより、微小環境のシグナル伝達特性を変化させることができる。この文脈において、我々は、ヒト悪性腫瘍の範囲によって局所的に高く発現する補体成分C1qが、細胞外マトリックスヒアルロン酸と相互作用した場合、ヒト腫瘍から単離された原発細胞の挙動に強く影響を及ぼすことを同定する。標本。ここでは、ヒアルロン酸(HA)に結合したC1qが腫瘍細胞接着にどのように影響するかを調べ、細胞外マトリックスの主要成分(この場合はHA)の生物学的特性が腫瘍に対する生理活性シグナルによって形成できるという事実を基礎とする方法を説明する。進行。

HAは、繰り返し(β,1-4)-D-グルクロン酸−(β,1-3)-N-アセチル-D-グルコサミン二糖単位(図1B)7を繰り返すことで構成される負の帯電高分子量多糖類である。96ウェルプレート上のHAの結合の発生およびその固定化の効率は、ビオチン化HA(バイオHA)を利用して試験した。10μg/mLから1mg/mLまでのバイオHAの異なる濃度を、100mM炭酸塩/重炭酸塩バッファーpH9.6で再懸濁し、4°Cで一晩インキュベートした。
広範な洗い流しの後、96ウェルプレートに結合したバイオHAをアルカリホスファターゼに結合したストレプトアビジンを用いて検出し、ストレプトアビジンの存在はpNPP(1mg/mL)を基質として定量した。読み取りは、ELISAリーダーを用いて405nmの波長で行った。Bio-HAは、用量応答方式で96ウェルプレートに結合す...

補体成分C1qは、細胞外マトリックスと相互作用しうる組織微小環境において高度に発現する炎症性分子である。ここでは、ヒアルロン酸に結合したC1qが細胞接着にどのように影響するかを試験する方法について述述する。

細胞接着促進における補体タンパク質C1qとヒアルロン酸間の相互作用の評価

It has been increasingly demonstrated that the tumor microenvironment plays an active role in neoplasia growth and metastasis. Through different pathways, ...

細胞接着促進における補体タンパク質C1qとヒアルロン酸の相互作用を評価するための包括的な手順。我々は最近、自然免疫系の分子であるC1qの補体が腫瘍および胎盤微小環境において高発現し、細胞外マトリックスの成分と相互作用することができると定義した。この場合、ヒアルロン酸。タンパク質の生物学的機能をエクロノミック環境全体で研究する方法を提案する。これらの分子の能力を調べるため、細胞外マトリックス因子の細胞分裂特性を形成する。この相互作用が環境の組織に存在する細胞によってどのように感知できるかを研究するために、我々は、ヒト組織由来のバイナリ細胞が細胞外マトリックス(この場合はヒアルロン酸)に結合したC1qに付着することを許されるこの容易な方法を設定した。コーティング手順の第1段階は、高分子量ヒアルロン酸を96ウェル組織被覆マイクロプレートに結合することである。コーティングの場合、ヒアルロン酸は、1ミリリットル当たり15マイクログラムの濃度で0.1モル炭素バッファーPH 9.6で希釈される。そして穏やかに配管は均質な解決を達成するために報される。100マイクロリットルの溶液を使用して、ウェルをコーティングします。プレートは、一晩摂氏4度で移動します。翌日、処理された井戸を真空吸気する。dPBSで一度洗います。対応するウェルに C1q または BSA を追加します。C1qは、今日では1ミリリットル当たり1ミリグラムの濃度で市販されており、1ミリリットル当たり25マイクログラムの濃度で希釈されています。そして、0.5%BSAと0.7ミリモルカルシウムとマグネシウムと二価カチウムを含むdPBS。BSA LPS フリーは、0.5% および日付 PBF の濃度で使用されます。プレートは、一晩摂氏4度で移動します。固定化ヒアルロン酸とのC1q用量依存相互作用は、酵素結合免疫SAによって決定される。高速 DiI でラベリングするセル。親油性トレーサー高速DiIは、対象の細胞にラベルを付けるために使用されます。dPBSで再懸濁した細胞は、1ミリリットル当たり100万個の細胞の濃度で使用される。高速DiIは、細胞懸濁液に直接1〜100を希釈する。細胞懸濁液は手動で混合し、15分間摂氏37度で移動する。5分間のインキュベーションの後、細胞懸濁液を混ぜ、この操作をさらに2回繰り返します。速いDiIの過剰を除去するために、dPBSの10ミリリットルを加える。250gで静かに上下に旋回し、遠心分離機を7分間回転させます。0.1%BSAの存在下でヒトの好酸血清遊離培地の1ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。ヒアルロン酸C1qマトリックスに対する細胞接着性。コーティングされた井戸からdPBSを真空吸引する。100マイクロリットルの標識された細胞懸濁液をコーティングされた井戸に分配する。200マイクロリットルの標識された細胞は、標準的な曲線生成に使用されるエプ耐えチューブで分解される。プレートを摂氏37度で35分間インキュベートします。インキュベーターからプレートを取り出します。バランスの取れた細胞をそっと吸引する。0.5%BSAと0.7ミリモルのカルシウムとマグネシウムを含むdPBSで1回洗浄します。200マイクロリットルのライシスバッファーを添加することにより接着細胞をlysする。同時に、溶解バッファー内の標識された細胞の 1 ~ 2 つの連続希釈時に標準曲線を調製します。544ナノメートルを励起波長、590ナノメートルを発光波長として使用し、無限F200 T缶計測器で蛍光信号の読み取りを行います。代表結果。代表結果に示すように、ヒアルロン酸に対する細胞接着は、HA単独またはHA結合BSAと比較して強く増強されたC1qを発見したのが明らかである。各マトリックスの接着セルのパーセントは、標準曲線に基づいて計算されます。結論。まず、補体成分C12が、この場合、ハイアルロン酸を有する金属を用いて細胞外マトリックスに結合する能力を評価した。次に、蛍光色素で染色されたヒト初等細胞の能力を分析し、結合ヒアルロン酸を求めた。今回の研究で提案したモデルは、この細胞間応答を刺激の組み合わせに対する評価用に、細胞外マトリックス足場の3Dモデルに代わる、より速く、より安価な方法である。

evaluation-interplay-between-complement-protein-c1q-hyaluronic-acid

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

外因性ヒアルロン酸（HA）と癌細胞の相互作用の高分解能解析を可能にする斬新なアプローチが説明されています。パターニングされた表面は、カルボジイミド化学とマイクロコンタクトプリンティングを組み合わせることによって作製されています。...

癌細胞とヒアルロン酸の相互作用を研究するマイクロパターン表面

両分子が相互作用する細胞の表面上に固定されているときに受容体 -...

用接着周波数アッセイその場で</em細胞間のインタフェースにおけるクロス接合分子間相互作用の>速度論解析

静的接着アッセイは、Tリンパ球および他の細胞型間の相互作用をモデル化するために使用することができる強力なツールである。プレートリーダーは、シリアル回洗浄し、以下の接着細胞の数を定量するために使用される相互作用は、接着分子でコーティングされたウェルに標識されたT細胞を注入することによって生成される。...

Tリンパ球におけるインテグリン活性化の研究のための静的な接着アッセイ

ここでは、推定細胞接着分子の固有の接着特性を特徴付けるための簡単で迅速な方法を提示します。 細胞接着分子の分泌されたエピトープタグ付きエクトドメインは、培養培地から小さく均一な官能基ビーズに捕捉されます。...

推定細胞接着分子のキャラクタリゼーションのためのビーズ凝集アッセイ

この流接着アッセイは、T細胞、上皮細胞間相互作用の単純な、耐衝撃性モデルを提供します。シリンジポンプは、剪断応力を生成するために使用し、共焦点顕微鏡は、定量化のための画像を捕捉します。これらの研究の目的は、効果的に流れ条件を使用して、T細胞接着を定量化することです。...

Tリンパ球接着分子の相互作用の研究のための接着性の下でせん断応力の測定

私たちは、流体脂質二重層によって取り囲まれるナノメートルタンパク質のパッチでガラスを官能化するプロトコルを提示します。これらの基板は、高度な光学顕微鏡と互換性があり、細胞接着および遊走の研究のためのプラットフォームとして機能することが期待されます。...

サポートされている脂質二重層中のリガンドナノクラスター配列

ここでは、いくつかの用途、特にアルツハイマー病（AD）のような疾患に対する感受性の評価における補体受容体1（CR1）の長さの多型を決定する革新的な方法について説明する。この方法は、ADの病因におけるCR1アイソフォームの役割をよりよく理解するのに有用であり得る。...

補体受容体1長多型のための高分解能Melting PCR Genotyping：アルツハイマー病の遺伝子感受性評価のための革新的なツール

血管壁への免疫細胞の動的付着腸内ホーミングの前提条件です。アドレスを持つコーティング毛細血管を用いた細胞の動的な細胞接着機能の in...

炎症性腸疾患における癒着防止治療の機能分析のための動的接着アッセイ

このプロトコルは、神経堤細胞のヒアルロナンに富む細胞外マトリックスへのin vivo移動に関与する分子の機能解析に適したin...

インビトロ ヒアルロン酸に富む細胞外マトリックスが神経堤細胞遊走に及ぼす影響の検討

効果的に浄化がしばしば必要とされる免疫細胞集団の機能を研究する。補体の枯渇は、高純度と免疫細胞集団を単離するための高速かつ安価な手法です。...

補体の枯渇により特定の細胞集団の枯渇

学ぶ C1qとヒアルロン酸の相互作用による細胞接着促進メカニズム。ヒト由来細胞を用いた実験系で、補体タンパク質の細胞外マトリックスにおける機能を評価する手法を解説します。

細胞接着促進における補体タンパク質C1qとヒアルロン酸間の相互作用の評価

さらに動画を探す