Name: 全血豚で表されるコーディングおよび非コーディングの RNA クラスの識別 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学ぶグロビン減少RNA-seqライブラリーからのmRNAおよびncRNA処理プロトコル。単一全血サンプルからコーディング・非コーディングRNAを同時に抽出し、宿主病原体相互作用の研究に有用です。

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この作品は主に支えられ、米国農務省 NIFA アフリカ 2013年-67015-21236 によって、一部は米国農務省 NIFA アフリカ 2015年 67015 23216 によって。本研究は、農業研究サービス研究参加プログラム、米国エネルギー省 (間の省庁間協定により科学と教育 (ORISE) のオークリッジ国立研究所によって管理に任命によって部分で支えられましたDOE)、米国農務省。ORISE は、オーク リッジ関連大学によってない DOE の契約の下で管理されます。デ-AC05-06OR2310。
HP PRRSV 感染クローン、動物実験では、関与と彼女の助けのための博士スーザン Brockmeier と原稿の準備でセクレタリーのスー オーレンドルフ博士ケイ Faaberg に感謝したいと思います。

<ol><li>Finotello, F., Di Camillo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+differential+gene+expression+with+RNA-seq%3A+challenges+and+strategies+for+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).</li>
<li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084(2014).</li>
<li>Koltes, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+putative+quantitative+trait+nucleotide+in+guanylate+binding+protein+5+for+host+response+to+PRRS+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection.</a> BMC Genomics. 16, 412(2015).</li>
<li>Miller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+signature+genes+in+PRRSV-infected+porcine+monocyte-derived+cells+to+different+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli.</a> PLoS One. 12 (7), 0181256(2017).</li>
<li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+construction+for+next-generation+sequencing%3A+overviews+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+RNA+Depletion+for+Efficient+Use+of+RNA-Seq+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).</li>
<li>Pollet, S. FR-AgEncode: a French pilot project to enrich the annotation of livestock genomes- RNA Extraction Protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf">ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf</a> (2015).</li>
<li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+small+non-coding+RNA+classes+expressed+in+swine+whole+blood+during+HP-PRRSV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection.</a> Virology. 517, 56-61 (2018).</li>
<li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+non-coding+RNA+expression+status+in+animals+faced+with+highly+pathogenic+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+%28HP-PRRSV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+World+Congress+on+Genetics+Applied+to+Livestock+Production%22%5BJournal%5D)">Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV).</a> Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), Species - Porcine 2 (2018).</li>
<li>Bivens Nathan, J., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+Library+Construction+Methods+for+Transcriptome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).</li>
<li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+ribo-minus+RNA-sequencing+and+polyA-selected+RNA-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing.</a> Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAseq+by+Total+RNA+Library+Identifies+Additional+RNAs+Compared+to+Poly%28A%29+RNA+Library%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library.</a> BioMed Research International. 2015, 9(2015).</li>
<li>Choi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+gene+discovery+and+coverage+using+RNA-seq+of+globin+RNA+reduced+porcine+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples.</a> BMC Genomics. 15, 954(2014).</li>
<li>Wu, K., Miyada, G., Martin, J., Finkelstein, D. Globin reduction protocol: A method for processing whole blood RNA samples for improved array results. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf">http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf</a> (2007).</li>
<li>TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Illumina%22">Illumina</a>. , (2018).</li>
<li>New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018).</li>
<li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041(2014).</li>
<li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916(2010).</li>
<li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。
商号またはこの資料の商用製品の言及は固有の情報を提供する目的は、勧告または米国農務省によって承認とは限りません。米国農務省は、機会均等のプロバイダーと雇用者です。

最適化は、プロトコルの最初の重要なステップには、全血のサンプルから品質の読み取りを取得する可能追加グロビン枯渇の手順が含まれています。配列研究に全血を使用しての最大の制限の 1 つは高いグロビン分子にマップし、金利18の他の分子にマップ可能性があります読み取りを減らしたサンプルの読み取り数です。したがって、我々 のサンプルのタイプのプロトコルの最適化で最高の可能な mRNA および非コーディングの RNA シーケンスをキャプチャできるようにグロビン枯渇ステップを組み込む必要があります。すべてのサンプルは、グロビン グロビン成績チェら、2014年14からの手順に基づいて豚特定ヘモグロビン A と B (HBA と HBB) オリゴヌクレオチドを使用しての高レベルのアカウントに枯渇だった。もう一つの重要なステップだった能力内で実験的関心の polyadenylated 非コーディングとウイルス RNA の分子を同時に維持しながら、サンプルから不要な RNA の分子を削除するための許可リボ枯渇抽出キットの使用シーケンス<sup c...

次世代シーケンシング (NGS) は、生物のゲノムのレベルで発生する変更の調査のための強力なツールとして浮上しています。NGS メソッドのサンプル準備は、生体組織の種類によって様々 なことより重要な質問、研究者に注目しているアドレスです。多くの研究は、健康と病気の個人1,2,3、4などの状態の間の遺伝子発現の差異を検討するための手段として、NGS になっています。すべて一度に特定の遺伝標識のゲノム情報のシーケンスを全ゲノム的に配置し、ほとんどのキャプチャを研究者を許可しない場合。
観察式の最も一般的なマーカーは、メッセンジャー Rna (Mrna) です。RNA シーケンスの準備中のライブラリの最もよく使われるプロシージャは、浄化、断片化、および5,6のシリーズを使用して mRNA 分子の回復に最適です。ただし、プロトコルが実行される方法の決定は、サンプルの種類及び当該サンプルについての質問に大きく依存します。ほとんどの場合では、総 RNA を抽出する;しかし、すべての RNA 分子は、関心のある、mRNA 発現研究などの場合過度に豊富な rna、リボソーム Rna (rRNA) のようなは、Mrna に関連付けられている検出成績の数を増やすために削除する必要があります。豊富な rRNA 分子を除去する最も人気のあると広く使用されている方法は、ポリア枯渇7と呼ばれる polyadenylated RNA 転写産物の減少です。このアプローチは、mRNA のコピーには影響しません、mRNA 発現の解析のためによく動作します。ただし、非コーディングやウイルスの Rna に興味がある学部で polyA 枯渇がまたこれらの分子を削除します。
多くの研究は、(コーディング) いずれかの mRNA の発現を RNA シーケンス ライブラリの準備や小規模または大規模な非コーディングの RNA の特定のクラスに集中する選択します。デュアル試料調製を可能にする我々 のような他の手順8にありますが、多くの研究は利用可能な独立した研究個別のサンプルからライブラリを準備します。我々 のような研究、これは通常時間、消耗品、および動物のストレスを増加して複数の血液サンプルを必要があります。私たちの研究の目標は動物から全血を使用して識別および両方の mRNA の異なるクラスを定量化することができる、および非コーディングの RNA 発現健康と高病原性豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス (PRRSV-HP) の間各豚からのみ 1 つの全血のサンプル (2.5 mL) を持っていることにもかかわらず豚9,10に挑戦。これを行うには、一般的な抽出と mRNA と非コード RNA (ncRNA) 式11 1 つのサンプルからの両方の分析を許可する適切なデータを生成するライブラリ作成プロトコルを最適化する必要があります。
これは mRNA のために主に意図されていた、ポリ A 枯渇ステップ12を使用して、入手可能な標準的なキットと RNA 抽出とライブラリを作成するためのメソッド、mRNA の非コーディングの RNA 解析できるプロトコルの必要性を求めてください。このステップしたらサンプルから非コーディングの RNA やウイルスの成績証明書を回復することは不可能。したがって、最適化されたメソッドが必要だったサンプル polyA 枯渇せず総 RNA の抽出に使用できます。本稿で紹介した方法は、サンプルの種類と全血の使用を可能にし、mRNA の小規模および大規模サイズの ncRNAs シーケンス ライブラリを構築する最適化されています。メソッドは、以降の調査13ウイルス Rna を保持と同様、すべての検出可能な非コード Rna の解析を可能にする最適化されています。すべてでは、私たちの最適化されたライブラリの準備のプロトコルは、単一の全血のサンプルから複数の RNA 分子の調査のためことができます。
このメソッドを使用しての背後にある全体的な目標は、全血のサンプルから非コード RNA と mRNA のコレクションに対して許可プロセスを開発しました。これにより、9つのサンプルから本研究では mRNA、ncRNA とそれぞれの動物のウイルスの RNA があります。これは最終的に、動物の追加費用なしより多くの科学的発見は、それぞれの個々 のサンプルの式のより完全な画像を与えます。記載されているメソッドを使用する両方の比較相関研究の完了を可能にすると同様、遺伝子発現の規制当局の検査のため mRNA および非コーディングの RNA 発現単一の全血サンプルを使用して。我々 の研究は、遺伝子発現の変化を調べるにこのプロトコルを使用し、可能なエピジェネティックな規制当局、9 週間の古い男性商業豚ウィルスに感染します。

<table><tbody><tr><td>PAXgene チューブ</td><td>PreAnalytix</td><td>762165</td><td></td></tr><tr><td>分子生物学グレード 水</td><td>ThermoFisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA アイソレーションキット</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute クリーンアップキット</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL 薄肉チューブ</td><td>ThermoFisher</td><td>98010540</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL RNase/DNase - フリーチューブ</td><td>任意のサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti 96-well</td><td>Thermocycler ThermoFisher</td><td>4375786R</td><td></td></tr><tr><td>グロビン還元オリゴ (&alpha; 1)</td><td>任意のサプライヤー</td><td></td><td>シーケンス GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td></tr><tr><td>グロビン還元オリゴ (&alpha; 2)</td><td>任意のサプライヤー</td><td></td><td>Sequence TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA</td></tr><tr><td>Globin Reduction Oligo (&beta; 1)</td><td>任意のサプライヤー</td><td></td><td>Sequence AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG GT</td></tr><tr><td>Globin Reduction Oligo (&beta; 2)</td><td>任意のサプライヤー</td><td></td><td>Sequence GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT</td></tr><tr><td>10X Oligo Hybridization</td> Buffer-Tris-HCl<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, pH 7.6</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1757-100-KCl</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ミリポアシグマ</td><td>60142-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>10X RNase H バッファー</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&-Tris-HCl, pH 7.6</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-DTT</td><td>サーモフィッシャー</td><td>Y00147</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-MgCl2</td><td>Promega</td><td>A351B</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-分子生物学グレード水</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー10977-015</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーAM2292</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-IN</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーAM2694</td><td>RNase阻害剤</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ミリポアシグマ</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機</td><td>任意のサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;2100電気泳動BioAnalyzerの器械</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nanoのキット</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNA&nbsp;キット</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit with Ribo-Zero&nbsp;</td><td>イルミナ</td><td>RS-122-2201</td><td>mRNAキット;人間/マウス/ラットセットA&nbsp;(48サンプル、12インデックス)</td></tr><tr><td>TruSeq Stranded Total RNA Sample Preparation Guide</td><td>Illumina</td><td></td><td>オンラインで利用可能</td></tr><tr><td>RNAClean XP ビーズ</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP ビーズ</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp 光学 8 チューブストリップ</td><td>ThermoFisher</td><td>N8010580</td><td>0.2 ml 薄肉チューブ</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学 8 チューブストリップキャップ</td><td>ThermoFisher</td><td>N801-0535</td><td></td></tr><tr><td>RNase/DNase - フリー試薬リザーバー</td><td>任意のサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperScript II 逆転写酵素</td><td>ThermoFisher</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96 ウェルプレート</td><td>ThermoFisher</td><td>N8010560</td><td>これらは、必要に応じて .3mL プレートの代わりに使用されました</td></tr><tr><td>MicroAmp 光学接着フィルム</td><td>ThermoFisher</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina&reg;(セット1)&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E73005</td><td>small RNA kit</td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex small RNA Library Prep Set for Illumina&reg;(セット2)&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>E75805</td><td>スモールRNAキット</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR精製キット</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>96Sスーパーマグネットプレート</td><td>アルパクア</td><td>A001322</td><td></td></tr></tbody></table>

全血豚で表されるコーディングおよび非コーディングの rna クラスの識別

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

革新的でますます強力な次世代シーケンシング技術の出現は、興味の生物学的プロセスに関連する根本的な遺伝子発現を調べる能力に新たな道をオープンしました。これらの技術革新だけでなく、遺伝子の効果細胞機能をコードする mRNA シーケンスから式を観察する研究者が、無変換、それでも残っている非コーディングの RNA (ncRNA) 分子が規制機能を持っているも。研究者には、mRNA および ncRNA の表現を観察する能力があるが、どちらか一方に焦点を当てる研究の慣習だった。ただし、研究 mRNA および ncRNA の表現に興味を持っていると、何度も使用別サンプル コーディングまたは非コード Rna ライブラリの準備で差を調べる。これは時間、消耗品、および動物のストレスを高めることができるより多くのサンプルの必要性につながることができます。さらに、研究者は通常、mRNA を調べることができます生物の質問の数を制限する 1 つだけ分析用サンプルを準備することがあります。しかし、ncRNAs はその効果発現調節的役割を持つ複数のクラスに します。NcRNA は伝染の間に基本的な生物学的プロセスおよびこれらのプロセスの障害が重要なので、治療のための魅力的なターゲットを下す可能性があります、したがって。この原稿は、世代のための修正されたプロトコルを示します mRNA と非コード RNA 発現ライブラリー、全血の 1 つのサンプルからウイルスの RNA を含みます。このプロトコルの最適化 RNA の純度を改善、メチル化された Rna の回復のための結紮を増加しより多くの RNA 種の捕獲を許可するように、サイズの選択を省略すると。

我々 の研究の代表的なサンプルは、グロビンとリボ枯渇全血サンプルです。プロトコルの代表的な結果は、7 (図 1、) と 260/280 nm 濃度比 2 (図 1b と 1 c) 以上で上記 RNA 整合性数 (鈴) とグロビン劣化ライブラリのサンプルで構成されています。分光光度計を使用して各ライブラリの最終的な集中を提供するサンプル結果の検証を行ったし、りん数 (mRNA または ncRNA) 分子が捕獲されたを示すピークのグラフと一緒にチップを使った電気泳動に基づくプールおよびシーケンスの前にライブラリのサンプル サイズを挿入します。現在の研究の焦点は、mRNA と小さな ncRNAs のみに置かれました。代表の結果は、mRNA ライブラリ ~ 280 一塩ピーク bp (図 1d)。結果 ...

ここで、(mRNA) を符号化の処理のために最適化されたプロトコルを提案する、非コーディング (ncRNA) グロビンが単一の全血のサンプルから RNA シーケンス ライブラリを削減します。

全血豚で表されるコーディングおよび非コーディングの RNA クラスの識別

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

この方法は、宿主のアミノ応答に関与するコーディング、非コーディング、およびウイルスRNA発現の検査と、病原体が宿主の生物学的機能にどのような影響を与えるかを調べることによって、宿主と病原体の相互作用の研究における主要な質問に答える助けとなる。この技術の主な利点は、単一の全血サンプルからのグロビン還元RNAseqライブラリーからのmRNAおよび非コードRNAの処理に最適化されたプロトコルを提示することです。この技術のデモンストレーションは、私の研究室の技術者であるサラ・アンダーソンです。室温で10分間Gの50 20倍の血液管を遠心から開始します。生物学的安全キャビネットで作業し、上清を除去した後、ペレットにRNaseフリー水の8ミリリットルを追加します。チューブを閉じ、ペレットを目に見えて溶解するまでペレットを渦巻きし、その後、チューブを室温で10分間G50 20倍に遠心し、ペレットを回収する。生物学的安全キャビネットで作業し、上清を捨ててペレットを保存します。総RNAを単離するには、300マイクロリットルのリシス結合バッファーをペレットにピペット処理して開始する。ボルテックス後、各チューブから新しいラベル1.5ミリリットル遠心管に混合物を移します。miRNA分離キットから30マイクロリットルのホモジネート添加剤を加えます。チューブを渦し、氷の上に10分間置きます。ヒュームフードで作業し、氷からチューブを取り除き、キットから酸フェノールクロロホルム試薬の300マイクロリットルを追加し、再び渦を混ぜます。室温で5分間Gを10,000倍に遠心した後、新しいチューブに水相を慎重に除去する。前工程からの水性回収量に基づき、各チューブとピペットの水性ファージに1.25倍のエタノールの体積を加えて混合する。各サンプルにフィルターカートリッジを含む新鮮な回収管を準備します。約675マイクロリットルのリゼット-エタノール混合物をフィルターカートリッジにピペット。遠心分離機はGの10,000倍で液体をフィルターに通す。フロースルーを破棄します。完全に使用されるまで、フィルターに加えて遠心分離するライセートエタノール混合物を繰り返します。700マイクロリットルの洗浄液をキットからフィルターカートリッジに加えます。フィルターを介して溶液を引っ張るために遠心分離機を簡単に。フロースルーを破棄し、同じフィルターカートリッジとコレクションチューブを保持します。各フィルターカートリッジに500マイクロリットルの洗浄液を2~3個加えます。再度遠心した後、流れを捨てて、洗浄工程を繰り返します。フィルターカートリッジから残った液体を取り除くために、さらに60秒回転させます。カートリッジを新しい回収管に移します。各フィルターカートリッジの中央に95°Cの予熱ヌクレアーゼフリー水の100マイクロリットルを加えます。最高速度で卓上遠心分離機で約20〜30秒間カートリッジを遠心分離します。グロビン還元オリゴによるハイブリダイゼーションをプレフォームするには、まず抽出した各サンプルを0.2ミリリットルの薄肉ヌクレアーゼフリー反応チューブに加えてRNAを変性させた。チューブをサーマルサイクラーに2分間摂氏70度に入れます。その後、すぐに最適なRNA品質を得るために氷の上にチューブを置きます。チューブが冷却されている間、400マイクロリットルの10Xグロビン還元オリゴミックスと10Xオリゴハイブリダイゼーションバッファーを2ミリリットルチューブに調製します。ハイブリダイゼーションミックスを作るために、RNAサンプル6マイクログラム、10Xグロビン還元オリゴミックスの2マイクロリットル、10Xオリゴハイブリダイゼーションバッファーの1マイクロリットル、ヌクレアーゼフリー水を各0.2ミリリットルの薄肉、ヌクレアーゼフリー反応チューブにそれぞれ10マイクロリットルの最終体積に加えます。チューブをサーマルサイクラーに摂氏70度で2分間置きます。その後、すぐに氷の上にチューブを置きます。RNase Hの消化を行うために、最初に10X RNase Hを1つのX RNase Hバッファーで1つのX RNase Hに希釈した。RNase H反応ミックスを調製し、10X RNaseバッファーの2マイクロリットル、RNase阻害剤の1マイクロリットル、1つのX RNase Hの2マイクロリットル、および5マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水を合計10マイクロリットルに組み合わせます。10マイクロリットルのRNase H反応ミックスをグロビン還元ハイブリダイゼーションサンプルに加え、十分に混合します。この反応を摂氏37度で10分間消化し、摂氏4度まで冷やします。0.5モルEDTAの1マイクロリットルをチューブに加えて消化を停止し、チューブの全内容を新鮮な1.5ミリリットルチューブに移します。その直後に、80マイクロリットルのRNaseフリー水、350マイクロリットルのライシスバッファーを加え、各チューブに250マイクロリットルの100%エタノールを加え、ピペットでよく混ぜます。700マイクロリットルのサンプルを、2つのミリリットルの回収チューブに入れた別の溶出フィルターカートリッジに移し、フロースルーを収集します。遠心分離機は8,000倍以上で15秒間G以上を行い、流れ通りを破棄します。同じ溶出フィルターカートリッジを新しい2ミリリットルの回収チューブに入れる。フィルターカートリッジ膜を洗浄するには、軽度の洗浄バッファーをフィルターカートリッジに500マイクロリットル、遠心分離機を8,000倍G以上で15秒間加えます。フロースルーを破棄します。次に、同じ回収管を使用して、フィルターカートリッジに80%エタノールの500マイクロリットルを加える。8,000倍G以上で2分間遠心分離機。フロースルーとコレクションの両方のチューブを廃棄し、溶出スピンカラムを保存します。各溶出スピンカラムを新しい2ミリリットルの回収チューブに入れる。フィルターカートリッジの開いた蓋で5分間フルスピードで遠心分離機を使用し、スピンカラム膜を乾燥させ、エタノールの持ち越しを防ぎます。回収管を捨て、乾燥した各フィルターカートリッジを1.5ミリリットルの新鮮な回収管に入れる。14マイクロリットルのRNaseフリー水をフィルターカートリッジ膜の中央に直接加えます。RNAを溶出させるために、チューブを全速力で60秒間遠心分離し、さらにRNA評価と調製を続けます。グロビン枯渇サンプルは分割され、小さな非コードRNAライブラリだけでなく、リボ枯渇mRNAおよび長く非コード的なRNAライブラリを準備するために使用することができます。このプロトコルを使用してグロビン枯渇およびリボ枯渇した全血サンプルの発現ライブラリを調製した後、電気泳動ファイルの実行概要は、6.3から9.2の範囲のRNA完全性番号を有するグロビン枯渇したライブラリサンプルを示した。これは、グロビン枯渇法を使用し、6またはほぼ6でRIN数を達成することができた他の研究と比較して改善であることが判明しました。単一のブタ全血サンプルのグロビン前還元およびポストグロビン還元は、260〜280ナノメートル濃度比が2以上であることを示した。このプロトコルを用いて、プーリングおよびシーケンシングの前に、グロビンおよびリボが枯渇した全血mRNAライブラリーサンプルのチップベースのエレクトロフェログラムが得られた。mRNAライブラリーの場合、代表的なエレクトロフェログラムは約280塩基対でピークを有する。小さなncRNAの代表的なチップベースのエレクトロフェログラムには、約100から400塩基対までのピークの範囲が含まれています。約143塩基対のピークはmiRNAに対応し、約153塩基対のピークはpiRNAに対応する。この手順を試みる間、注意した場所ですぐに氷管を覚えておくことが重要です。この手順に従って、微分発現、エピジェネティックな変化、および生物学的経路およびプロセスへの影響などの追加の質問に答えるために、次世代シーケンシングのような他の方法を実行する必要があります。フェノールクロロホルム試薬を使用すると非常に危険であり、ヒュームフードで作業などの予防措置を取る必要があることを忘れないでください。また、全血または感染性生物を取り扱う場合、感染性生物の活性化に先立って生体安全キャビネットで作業を行う必要があります。

identification-coding-non-coding-rna-classes-expressed-swine-whole

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

RNAシークエンシングおよびバイオインフォマティクス解析は、マウスEMLcellsのリン、CD34 +およびリン-CD34-亜集団において有意にかつ差次的に発現する転写因子を同定した。これらの転写因子は、自己再生リン-CD34 +を、部分的に分化したリン-CD34-細胞との間の切り替えを決定する際に重要な役割を果たしている可能性がある。...

RNAシーケンシング解析によりEML造血前駆細胞における自己再生および分化を調節する重要な要因の同定

細胞がストレスに適応する能力は、彼らの生存にとって非常に重要です。mRNA翻訳の制御は、プロテオームの迅速な制御を可能にする適応戦略の1つです。ここでは、ストレス条件下で選択的に翻訳される特定のmRNAを同定するための標準化されたポリソームプロファイリングプロトコルを提供します。...

ポリソームプロファイリングによる哺乳動物細胞における選択的mRNAの翻訳の評価

後成の要因は遺伝子発現を調節して B 細胞の機能を調節する遺伝的プログラムと対話できます。体外B 細胞刺激、qRT PCR とハイスループット マイクロ Rna シーケンスおよび mRNA シーケンスのアプローチを組み合わせて、B 細胞のマイクロ Rna...

マイクロ Rna と受ける DNA の組換えをクラス スイッチしてプラズマ細胞の分化誘導された B 細胞における Mrna のゲノム解析の HDAC 阻害剤を介した変調

ここでは、 シロイヌナズナの葉の葉の葉のプロトプラストに適用されるインタラクトームキャプチャプロトコールを紹介する 。この方法は生体内での UV架橋に批判的に依存し、生理学的環境からの植物mRNA結合タンパク質の単離および同定を可能にする。...

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

ナノポアシーケンシングは、遠隔地でのコスト効率の高いシーケンシングと、リソースの乏しい設定を可能にする新しいテクノロジーです。ここでは、このような条件に適合する全血からの mRNAs...

ナノポアシーケンシングを用いた全血からの mRNA の配列決定

ここでは、リボタグシステムを用いた成人男性マウス生殖細胞の選択集団からリボソームおよび関連RNAの免疫沈降について説明する。戦略的な繁殖と慎重な免疫沈降は、細菌細胞の翻訳を知らせ、変異型のメカニズムに関する洞察を提供するクリーンで再現可能な結果をもたらします。...

雄マウスの生殖細胞におけるリボタグ免疫沈降

このプロトコルでは、自動グラジエントメーカーやグラジエント分画システムを使用せずにポリソームプロファイルを生成する方法について説明します。...

グラジエントメーカーまたは分画システムを使用しないポリソームプロファイリング

共翻訳相互作用は、新生鎖修飾、標的化、折り畳み、およびアセンブリ経路において重要な役割を果たします。ここで、選択的リボソームプロファイリング、 in vivo、モデル真核生物...

選択的リボソームプロファイリングによる共翻訳相互作用ネットワークのグローバル同定

リボソームを翻訳すると、コドンあたり3つのヌクレオチドがペプチドに解読される。リボソームプロファイリングによって捕捉されたmRNAに沿ったそれらの動きは、特徴的な三重項周期性を示すフットプリントを生成する。このプロトコルでは、RiboCodeを使用してリボソームプロファイリングデータからこの顕著な特徴を解読し、トランスクリプトーム全体でアクティブに翻訳されたオープンリーディングフレームを特定する方法について説明します。...

De novo リボソームプロファイリングデータによるアクティブに翻訳されたオープンリーディングフレームの同定

Absolute quantification RNA Sequencing (AQRNA-seq) は、生物学的混合物中のすべての低分子 RNA の状況を定量するために開発された技術です。ここでは、AQRNA-seqのライブラリー調製とデータ処理の両方のステップを実証し、飢餓誘発性休眠中の Mycobacterium bovis...

低分子RNAの定量のためのAQRNA-seq

学ぶグロビン減少RNA-seqライブラリーからのmRNAおよびncRNA処理プロトコル。単一全血サンプルからコーディング・非コーディングRNAを同時に抽出し、宿主病原体相互作用の研究に有用です。

全血豚で表されるコーディングおよび非コーディングの RNA クラスの識別

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