マウス表皮ケラチノサイトの単離とインビトロクロノジェニック培養

成体マウスから表皮細胞を採取する方法は、角化細胞幹細胞などの下流の用途に有用である。我々の技術は非常に再現性が高く、皮膚発癌モデルの文脈でマウスのin vivoプロシージャと共に使用することができる。安楽死させた成体マウスから側側皮膚サンプルを採取した後、オートクレーブ鉗子とメスを使用して、一度に毛深い側を薄いペトリ皿に下に置き、組織が半透明になるまで腹側皮膚組織からの脂肪を含む皮下組織をスクラップオフする。

他のすべてのスキンが処理されるまで、掻き取ったスキンをPBSに入れる。その後、メスを使用して皮膚サンプルを0.5〜1.5センチメートルのストリップにスライスします。20ミリリットルPBSの表面に毛深い側面と2つのxゲンタマイシン溶液を浮かげる前に、ストリップの毛深い側面を無菌ペトリ皿に置き、プラスチック100×20ミリメートルのペトリ皿に0.25%トリプシンを32度で2時間補充します。

インキュベーションの最後に、30度の傾斜で収穫媒体の15ミリリットルを含む無菌、プラスチック、正方形のペトリ皿を置き、慎重に浮遊皮膚ストリップを皿に移すために湾曲した鉗子を使用する。皮膚に対して垂直な角度で新しいメスの刃を保持し、十分だが過剰な力を使用して、表皮と毛髪をサンプルから媒体に削り取る。すべてのストリップが削られたら、上澄み物を含む表皮細胞を1.5インチの磁気攪拌棒を含む無菌60ミリリットルの瓶に慎重にデカントし、ペトリ皿を追加の収穫媒体で洗い流し、残りの表皮細胞を採取する。

瓶の最終容積を新鮮な培地で30ミリリットルにし、表皮細胞溶液を室温で毎分100回転で20分間攪拌する。バイオセーフティキャビネットの攪拌インキュベーションの終わりに、攪拌バーを取り外し、70マイクロメートルのストレーナーを通して50ミリリットルの円錐チューブに細胞溶液をろ過します。鉗子とピペットを使用して、ストレーナーを通して毛髪と角質層材料を押して組織を操作して閉じ込められた毛細胞を放出し、さらに5ミリリットルの収穫培地を使用して、残った閉じ込められた毛細胞をチューブに放出します。

表皮細胞と毛髪を操作して毛包から細胞を放出することが重要です。新鮮な培地でチューブ内の総容積を最大50ミリリットルにし、遠心分離によって細胞濾液を採取する。5ミリリットルのピペットで約20トリチュレーションで新鮮な収穫培地の5ミリリットルでペレットを再懸濁します。

1から20の希釈の0.5ミリリットルを取り、2ミリリットルマイクロフュージチューブに移します。サンプルを慎重に混合した後、マイクロフュージチューブから200マイクロリットルを取り、0.4%トリパンブルー溶液の等量で穏やかに混合します。この溶液を3回軽く混合し、細胞を血球計に移して有核ケラチノサイトを数える。

すべてのダークブルーの細胞を生存不可能な細胞としてスコア付けし、生存細胞として小さな金とピンクがかった細胞を獲得します。生存率は平均約80%であり、マウス当たりの最終的なケラチノサイト収量は約3000万個の生存細胞であるべきである。計数後、別の遠心分離で細胞を採取し、そして大量培養のために、2ミリリットルの細胞培養培地で35ミリペトリ皿当たり6番目の生き生きとしたケラチノサイトに2〜4回再懸濁する。

クロノゲンコロニー形成アッセイの場合、X線照射されたスイスマウス3T3フィーダー層に60ミリメートルペトリ皿をコーティングしたコラーゲン当たりの血清濃度のサプリメントを用いて、改変されたウィリアムのE培地の4ミリリットル当たり10回から3番目の角化細胞に1回で細胞を再懸濁させる。大量培養の場合、適切な細胞培養期間に対して5%の二酸化炭素で摂氏32度で培養を成長させます。培地を、マス培養のための最初の播種後24時間後に、その後週3回変更した。

クローン培養の終わりに培地を吸引し、コロニーを室温で夜間に10%緩衝ホルマリンに固定する。翌朝、水が透明になるまで冷たいオートクレーブ水で皿を洗い流す前に、1時間オートクレーブ水で0.5%ローダミンBでコロニーを汚す。その後、コロニーを数える前に乾燥するために彼らのふたの上に皿を傾斜させます。

ここで、種々の局所治療後のケラチノサイトコロニー形成アッセイからの典型的な結果が示されている。毛包幹細胞は、通常、マウス毛包幹細胞マーカーのフローサイトメトリック染色によって評価される成人C57BL/6マウスの後部皮膚から分離された細胞の約9%を占める。この図では、四つの異なる培地条件下で培養後のケラチノサイト幹細胞コロニーの増殖特性が観察できる。

この手順に従って、細胞はフローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別、細胞培養、および分子生物学的分析に使用することができる。この技術により、表皮幹細胞の数は、新しい幹細胞調節遺伝子の同定につながる定量的で複雑な形質であると判断することができました。