Name: 高コンテンツ イメージング解析によるロドプシン輸送アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: 学ぶ高コンテンツイメージング解析によるロドプシン輸送アッセイ。網膜色素変性症治療薬のスクリーニングと薬力動態評価に応用可能な定量的手法を確立し、膜タンパク質輸送研究を加速します。

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我々 は博士マーク E. Schurdak に感謝し、ピッツバーグ大学創高コンテンツ イメージャと初期研修を提供する研究所します。博士クシシュトフ ・ Palczewski (ケース ウェスタン リザーブ大学) は寛大 B630 反ロドプシン抗体と 1 4 を共有しました。マウス ロドプシン-金星コンストラクトの cDNA を含んでいるプラスミッド博士ネビン ・ ランバート (オーガスタ大学) で共有されていました。この仕事は、健康からの助成金 EY024992 YC と P30EY008098 にピッツバーグ大学ビジョン研究コア付与の国立研究所によって支えられました。

注: ロドプシン輸送アッセイ.
1. 調製と細胞の培養
<ol><li>野生型 (WT) または変異マウス ロドプシン-金星の融合蛋白質を表現する低温保持 U2OS 安定した細胞を復活させます。バイアルに小さな氷の結晶だけが残るまで、37 ° C で細胞を解凍します。 注: U2OS 細胞が使用されるこのプロトコルでの in vitro研究光受容細胞ラインはありませんロドプシンの前毛様体の生合成は哺乳類細胞で同様の分子メカニズムによって調整されます。さらに、U2OS セルはプレートの底にしっかりと接続、ロドプシン輸送アッセイに最適ですので大型の細胞体があります。7 U2OS 安定細胞 WT、T4R、P23H、P53R、C110Y、D190N と P267L ロドプシンの突然変異体を使用ここでは品質と分析の信頼性を示す例として。他のロドプシンの変異体または他の膜タンパク質を発現する安定細胞は、アッセイの目的に応じて使用できます。利用可能な場合、ヒト ロドプシンを発現する安定細胞はこの試金で使用できます。マウスとヒト ロドプシン蛋白 95% の相同性を共有し、テスト生体内でモデルを使用マウス adRP P23H 変異8ロドプシンを運ぶこの試金によって同定された化合物になりますので、マウス ロドプシンはここに使いました。安定した細胞は、19を前述のように生成されました。WT と変異型ロドプシンのトラン スクリプトの q-PCR による定量を行った、WT と変異型ロドプシンのトラン スクリプトの同じようなレベルを発現する安定細胞のクローンがこの試金のために選ばれました。ロドプシン タンパク質の発現は、イムノブロットおよび免疫染色によって確認されました。この試金で使用されるセルの通路は 20 よりも低いはずです。</li>
	<li>(高グルコース ダルベッコ改変イーグルの 10% 牛胎児血清 (FBS) の培地 (DMEM) と 5 μ G/ml Plasmocin) 成長培地 10 ml、15 mL の円錐管にセルのそれぞれの行を転送します。</li>
	<li>上清 200 x gで 5 分間破棄でチューブを遠心し、各セルライン細胞成長培地 5 mL を細胞ペレットを再懸濁します。60 mm の組織培養皿に細胞懸濁液のそれぞれの行を転送し、, 5% CO2と 37 ° C で。</li>
	<li>参照12に記載されている細胞培養皿として 90% の合流点に達するとサブカルチャー。</li>
</ol>2. ウェルあたり 5,000 の細胞に細胞を播種
注: は、ティッシュ文化フードの次の手順を実行します。
<ol><li>ポリ リジンとプレートを扱います。<ol>
<li>細胞を播種する前に 1 日を扱う黒壁しポリ リジン溶液中 30 分間の 20 μ L/ウェルの 384 ウェル プレートを底をクリアします。</li>
		<li>液体を吸引し乾燥 1 h. プレート蓋を戻すためにすべての井戸を許可し、細胞の播種のために夜通し 4 ° C でプレートを格納します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞懸濁液を準備します。<ol>
<li>90% 合流まで 100 mm 細胞培養用ディッシュの培地に各セルラインの文化.</li>
		<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) でそれぞれ皿を洗うし、0.05 %1 mL の細胞をデタッチ 37 ° C でトリプシン</li>
		<li>アッセイ培地 (10 %fbs、100 単位/ml ペニシリン ストレプトマイシン 100 μ g/mL と高グルコース DMEM) の 10 mL のセルのそれぞれの行を再懸濁します。</li>
		<li>セルを数えるし、105セル/mL アッセイ中 x 1.25 にセルのそれぞれの行を希釈します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞を播きます。<ol>
<li>セルの線と塗りつぶしの列 1-21 384 ウェル プレート (図 2) のあたりの 3 つの列に細胞懸濁液 40 μ L/ウェル分注するのに電子マルチ チャンネル ピペットまたは自動試薬ディスペンサーを使用します。</li>
		<li>U2OS の 40 μ L/ウェルを追加 (P23H-ロドプシン-ヴィーナス) と列 22-23 および U2OS の 40 μ L/ウェル (ロドプシン-金星) コントロールとして 24 の列に。</li>
		<li>300 x g 30 でプレートを遠心分離機 384 ウェル プレートの下のすべてのセルをダウンさせる s。 注: は、細胞播種後プレートに物理的な衝撃を避けてください。それ以外の場合、セルは、各井戸の 1 つのコーナーに押しつぶされるが、プレートは高コンテンツ撮影に適したできません。</li>
		<li>5% CO2プレートの底に付けるセルの 3 h の 37 ° C で 384 ウェル プレートを孵化させなさい。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 化合物とセルを扱う
<ol><li>図 2に示すように、処理条件とプレート マップを生成します。</li>
	<li>96 ウェル プレートで最大 15 化合物の作業ソリューション x 5 の 300 μ L を準備します。<ol>
<li>Cps 1 に 15 (図 2 a) プレート 96 ウェルの井戸 A1 G2 を最終濃度 5 倍アッセイ培地を希釈します。よく H2 のアッセイ培地 300 μ L を追加します。 注: 各化合物の最終的な集中を HTS12,13P23H ロドプシンのトランスポートを救出するため最も効果的な濃度で使用は。</li>
		<li>2% ジメチルスルホキシド (DMSO) ウェルあたり 100 μ L を追加し、25 μ M の 9 -cis-それぞれ列 11 と 12 にアッセイ培地で希釈されて網膜。追加 9 -シス-薄明かりの中で網膜。</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 x 働くと細胞 (図 2 b) 384 ウェル プレートにソリューションの井戸あたり 10 μ L を追加します。<ol>
<li>列 1 に 21 (図 2) から行 A、C、E、G、I、K、M、および O に 1、3、5、7、9、11、13、および 15 の化合物を追加するのに、電子マルチ チャンネル ピペットを使用します。化合物を追加 2、4、6、8、10、12、14 と 21 に 1 列から行 B、D、F、H、J、L、N、P、M。</li>
		<li>10 μ L/2 %dmso のウェルを 22 と 24 の列に追加します。9-25 μ m ウェルあたり 10 μ l 添加cis-列 23 に網膜。 注: すべての化合物は最初株式として DMSO に溶解したため、DMSO が車両制御として使用をされます。DMSO 処理セルを含む 22、P23H を表現するロドプシン 0% コントロールとして使用される、列。9 -シス-P23H ロドプシンを発現する網膜の扱われた細胞は 100% コントロールとして使用されます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>アルミ箔で 384 ウェル プレートをカバーし、24 h の 37 ° C でプレートを孵化させなさい。</li>
</ol>4. 膜透過ロドプシン細胞表面タンパク質を染色することがなく免疫染色。
注: は、そのまま細胞膜を維持する全体染色プロセスで任意の洗剤を避けるため。
<ol><li>16% 希釈することによって 4% パラホルムアルデヒド (PFA) の準備 1:4 容積比で化学の発煙のフードで PBS で PFA。転送 4 %pfa 試薬リザーバーで。</li>
	<li>薄暗い赤い光で暗い部屋で 384 ウェル プレートを取り出してください。真空ボトルに接続された 8 ch アスピレータを使用して、軽く培地を吸引します。電子マルチ チャンネル ピペットを使用して作りたての 4% の井戸あたり 20 μ L を追加する全体の 384 ウェル プレートに PFA と室温で 20 分間インキュベートします。細胞の剥離を避けるためには、常に願望の中に各ウェルの同じ側を吸引の先端をポイントします。各ウェルの下部中央のエリアを触れないでください。画像を撮るときは、アスピレータ感動領域を避けるためにフィールドを選択します。10 分以上の孵化、蒸発を避けるためにそのふた付き 384 ウェル プレートをカバーしてください。 注: セルは 100% コントロールの結果に影響する再生バソの変質を避けるために暗い部屋で固定されます。固定後は、通常の光の下で 384 ウェル プレートを出せます。</li>
	<li>各ウェルに PFA を吸引し、電子マルチ チャンネル ピペットを使用して PBS のウェルあたり 50 μ L を追加する 8 ch の吸引器を使用します。PBS で 3 つの洗浄を実行する 2 回を繰り返します。 注意: 廃棄物液体含む PFA キャップ ボトルに収集され、実験後有害化学廃棄物として処分することです。</li>
	<li>全体の 384 ウェル プレートに 5% ヤギ血清の井戸あたり 20 μ L を追加することによって、細胞をブロックし、30 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>5% ヤギ血清を吸引し、二次抗体だけ制御グループの行 P 1% ヤギ血清の O. 追加 15 μ L/ウェルに行 A に 1% ヤギ血清中 20 μ g mL-1 B6 30 反ロドプシン抗体の井戸あたり 15 μ L を追加します。</li>
	<li>90 分間室温で 4 ° c または 384 ウェル プレート、一晩インキュベートします。384 ウェル プレート、fluorophores の変質を避けるためにアルミ箔をカバーします。</li>
	<li>PBS のウェルあたり 50 μ L で 3 回プレートを洗います。</li>
	<li>PBS を吸引し、5 μ g mL-1 Cy3 標識ヤギ抗マウス IgG 抗体の井戸あたり 15 μ L を追加します。アルミ箔で 384 ウェル プレートをカバーし、一晩 4 ° C、1 時間室温で孵化させなさい。</li>
	<li>PBS のウェルあたり 50 μ L で 3 回プレートを洗います。1 μ g mL-1 15 分間室温で核を染色するヘキスト 33342 を含む PBS のウェルあたり 50 μ L を追加します。</li>
	<li>イメージングの前に透明フィルムで 384 ウェル プレートをシールします。アルミ箔で 384 ウェル プレートをカバーし、画像がすぐにとられる場合週まで 4 ° C で保管します。</li>
</ol>5. イメージング.
注: この高コンテンツ イメージング手順、材料表に記載されているイメージング システムに適応。プロシージャは、他高コンテンツ イメージング システムを使用している場合は異なることがあります。
<ol><li>ふたを外すし、プレートの左上隅に配置されている A1 と高コンテンツ イメージャに 384 ウェル プレートを入れた。</li>
	<li>画像のパラメーターを設定できる画像集録ソフトを開きます。<ol>
<li>プレート取得セットアップ ウィンドウを開くと新しい設定を作成または既存の設定ファイルを読み込みます。</li>
		<li>20 × 対物を選択し、ピクセルビニング 2 として校正のピクセル サイズは 0.80 × 0.80 μ m 設定スキャン ライン 2,000 とイメージのサイズ (W × H) サイトあたり 1,000 x 1,000 ピクセル (800.00 800.00 μ m x) として。</li>
		<li>イメージを作成するプレートの種類を選択します。384 ウェル プレートの製造元によって提供される情報を使用して、プレートの寸法を記入します。</li>
		<li>384 ウェル プレートのイメージを作成する井戸を選択します。</li>
		<li>ウェルあたりイメージを作成する 4 つのサイトを選択します。吸引のヒントも感動の側面を避けてください。</li>
		<li>405、励起レーザを選択 488 561 nm。排出フィルター DAPI、FITC とテキサスの赤のチャンネルを選択します。レーザー パワーを最適化し、肯定的な制御の井戸から撮影した画像の明るさを確保するため各チャンネルのゲインは飽和のしきい値未満。</li>
		<li>オート フォーカスのための井戸からもフォーカスを選択します。最初よくサンプルを見つけることは、初期として取得を選択します。すべてのサイトにサイトのオート フォーカスを設定します。</li>
		<li>各チャンネルに 1 回線あたり 4 つの平均値を選択します。各チャンネルの Z オフセットの値を最適化します。</li>
		<li>画像を確認する 384 ウェル プレートの対角コーナーで 2-3 井戸があるフォーカスの以上 40% の合流およびすべてのチャンネルの蛍光強度と細胞すべてテスト井戸、井戸ごとのすべてのサイトからの画像の約半分で飽和する 100% テスト 井戸を制御します。</li>
		<li>画像の取得方法を保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プレート全体を実行します。撮像素子を出発する前に画像の品質を再確認するプレートの最初の列から画像の取り込みが完了するまでは、撮像素子を見る。384 ウェル プレートを取るし、将来の使用のための 4 ° C で保存します。 注: も、撮影したチャンネルごとに選択したサイトの数、に応じてイメージング 1 384 ウェル プレートを完了する 3 h 40 分がかかります。</li>
</ol>6. 画像解析。
<ol><li>高コンテンツ イメージ解析ソフトウェアを使用してイメージ データを引き出します。パラメーターを設定する 100% コントロール井戸 (列 23) のいずれかを選択します。</li>
	<li>分析方法として多波長セル得点を選択し、設定の構成を開始します。<ol>
<li>DAPI チャネルからのイメージを使用して核を定義します。プレビュー選択した定義された核形も核のイメージとうまく合っているかどうかを確認します。</li>
		<li>ロドプシン-金星のイメージ、FITC チャンネルでセルの形状を定義します。</li>
		<li>テキサスの赤チャネルのロドプシン細胞表面の染みの領域を定義します。</li>
		<li>5 井戸の設定が最適化されたかどうかを決定するために現在のアルゴリズムをテストします。設定を保存し、設定ウィンドウを閉じます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>最適化された解析メソッドですべての井戸を実行します。</li>
	<li>そのまま携帯番号としてオブジェクト番号をエクスポートします。ロドプシン-金星の輝度 (ロドプシン-金星は INT) を FITC チャンネルの平均強度をエクスポートします。細胞膜 (細胞膜におけるロドプシン INT) のロドプシンの強度としてテキサス赤チャネルの平均強度をエクスポートします。</li>
	<li>表計算ソフトでエクスポートしたデータを開きます。MEM 率としてロドプシン-金星 INT によって細胞膜におけるロドプシンの強度を分割します。Z を計算する '-要因分析の質を評価するパラメーターごとに。スプリアス = 1−3X (STD100% 制御+STD0% 制御)/|100% コントロール−Mean0% 制御を意味 | 注: Z'-0 高コンテンツ画面と Z のため十分な適度なアッセイより高い係数 ' 0.5 ~ 1 の係数は、高スループット画面20,21に必要な優れたアッセイを示唆しています。</li>
	<li>表計算ソフトを使用して、各パラメーターの 2 色ヒート マップを生成します。X 軸の細胞と y 軸上の化合物の名前を配置します。</li>
</ol>

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ここでは、ヒット、HTS. から識別の特性評価に使用される高いコンテンツ イメージング アッセイを示したこれらのプロトコルに関連する唯一のオートメーションは高固体撮像素子です。染色とロドプシンの蛍光イメージングは、ロドプシン5,14,15,16のローカリゼーションを特徴付けるために一般的に使用されています。しかし、従来の撮像方法で撮影した画像の定量化は、1 つの条件、実験、あたりのイメージの低容量で品質管理パラメーターの不足十分な細胞像の欠如によって制限されます。我々 は 384 ウェル フォーマットに伝統的な染色プロトコルに適応、高コンテンツ イメージングに伝統的なイメージングを置き換え。この高コンテンツ イメージング プロトコルを使用して、我々 は正常に選択され、HTS11,...

タンパクは、筋ジストロフィー、神経変性、網膜色素変性症 (RP)1を含む、まばゆいばかりの病気に関与しています。RP は継承と進歩的な網膜変性と機能とロッド視細胞や網膜色素 epitheliums (RPEs)2,3の恒常性に影響を与える 60 以上の遺伝子の突然変異に関連付けられているです。RP には現在効果的な治療法はありません。ロドプシンの突然変異は、RP の場合優性 (ad) の約 25-30% を占めています。クラス II 変異以上 150ロドプシン変異4 (ひと遺伝子変異データベース、http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/) 中、ロッド視細胞死に貢献するロドプシン蛋白構造不安定になるとビジョンの損失5,6,7,8。P23H は北アメリカの最も頻繁なロドプシンの突然変異もクラス II ロドプシン変異9,10の典型的な例であります。その固有の構造不安定性野生型ロドプシン細胞膜5にあるに対し、誤って折りたたまれたロドプシンは哺乳類細胞の小胞体 (ER) に蓄積されます。誤って折りたたまれたロドプシン P23H 突然変異体展示支配的否定的な細胞毒性ハプロ不全により、原因ではないが、小胞体の活性化に関連しては、タンパク質分解経路と中断された棒外側セグメント組織に関連付けられます。棒の光受容器細胞ストレスを軽減するために 1 つの戦略は、薬理学的シャペロンを用いた変異型ロドプシンの折りたたみでネイティブを安定させるためにです。
この目標を達成するために行ったプラズマ輸送 P23H ロドプシンの突然変異体を定量化する β-ガラクトシダーゼ フラグメント否定回路試金を使用して細胞を用いた高スループット画面 (HTSs)11,12,13膜。この HTS アッセイの堅牢でシンプルなプロトコルでは、各画面の約 79,000 小分子の活動を探索することができました。しかし、この HTS アッセイは、発光信号を読み取っているので偽陽性 β gal 阻害剤を含む色または細胞毒性化合物に含まれますセカンダリ分析によって識別される待っているヒット リスト。
伝統的な染色と蛍光イメージング法は、哺乳類細胞5,14,,1516におけるロドプシン輸送を研究に長年使用されています。ただし、信頼性の高い画像解析が必要である非常に一貫した条件の下で撮影した画像の数が多いために、ロドプシン輸送に向けて 10 以上の化合物の薬理学的効果を定量化するこれらの従来の方法は使用できません。従来の撮像方法で不適法。ここでは、我々 は誤って折りたたまれたロドプシン変異体11,13,17のセル表面輸送を定量化する二次試験として免疫染色による高コンテンツ イメージング プロトコルを開発しました。ロドプシン細胞膜上にラベルを付ける、我々 手順をスキップした細胞膜透過と immunostained のロドプシン変異体細胞の細胞外の側でロドプシンの N 末端エピトープを認識モノクローナル抗体 (B6 30) 反ロドプシン膜18。全細胞で変異型ロドプシンを視覚化するには、金星蛍光タンパク質ロドプシンを融合しました。異なる蛍光管内の蛍光強度の定量化、我々 は細胞表面との比、セル全体で合計ロドプシン強度を含む 1 つの単一の実験から複数のパラメーターを取得することができます。ロドプシン セル全体を細胞表面に蛍光します。この方式では、合計六つの誤って折りたたまれたロドプシンの変異体を発現する細胞を安定した、これらの突然変異体の方の複数の小さい分子シャペロンの薬理学的プロファイルを生成できます。このプロトコルではすべて細胞は 384 ウェル プレートで immunostained、非常に一貫した撮像条件下で自動イメージング システムを使用してイメージを作成します。セル形状とタンパク質発現レベルの変動と細胞の不均一性による変動を低減し、600 以上細胞の画像を含む、各ウェルの画像解析が実行されます。このプロトコルのワークフローは、図 1のとおりです。このメソッドの利点は、画像ベースの分析からマルチパラ メーターの数量だけでなく、高解像度画像を得る我々 ことです。一般に、このプロトコルを変更および興味のすべての誤って折りたたまれた膜蛋白質の輸送の定量化に適用できます。

<table><tbody><tr><td>U2OS(rhodopsin-Venus)細胞</td><td>NA</td><td></td><td>U2OS細胞から生成された安定細胞</td></tr><tr><td>U2OS(T4R-rhodopsin-Venus)細胞</td><td>NA</td><td>NA</td><td>U2OS細胞から生成された安定細胞</td></tr><tr><td>U2OS(P23H-rhodopsin-Venus)細胞</td><td>NA</td><td>NA</td><td>U2OS細胞から生成された安定細胞</td></tr><tr><td>U2OS(P53R-rhodopsin-Venus)細胞</td><td>NA</td><td></td><td>U2OS細胞から生成された安定細胞</td></tr><tr><td>U2OS(C110Y-rhodopsin-Venus)細胞</td><td>NA</td><td></td><td>U2OS細胞から生成された安定細胞</td></tr><tr><td>U2OS(D190N-rhodopsin-Venus)細胞</td><td>NA</td><td>NA</td><td>U2OS細胞から生成された安定細胞</td></tr><tr><td>U2OS(P267L-rhodopsin-Venus)細胞</td><td>NA</td><td>NA</td><td>U2OS細胞から生成された安定細胞</td></tr><tr><td>DMEM高グルコース</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>25-500</td><td>L-グルタミン、ナトリウムピルビン酸</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16140071</td><td>熱不活性化</td></tr><tr><td>プラスモシン</td><td>InvivoGen</td><td>ant-mpt</td><td>マイコプラズマ除去試薬</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (100X)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>100X 濃縮抗生物質溶液で細胞培養の細菌汚染を防止</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-510</td><td>0.25%, 1mM EDTA HBSS中 カルシウムおよびマグネシウムを含まない</td></tr><tr><td>ポリ-L-リジン溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707-50ML</td><td>Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, 滅菌ろ過済み、BioReagent、細胞培養に最適</td></tr><tr><td>CellCarrier-384 Ultra Microplates</td><td>PerkinElmer</td><td>6057300</td><td>384ウェル組織培養処理マイクロプレート、黒いウェル壁と光学的に透明な環状オレフィン底部を備えたハイコンテント解析</td></tr><tr><td>で細胞をイメージング滅菌済み96ウェルプレート</td><td>エッペンドルフ</td><td>30730119</td><td>蓋を平底にして処理した組織培養液は、検出可能なパイロジェン、Rnase、DNase、DNAを含まない無菌です。非細胞毒性</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝液 Sailine (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9625</td><td>10 x PBS Buffer, pH 7.4</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4540</td><td>>99.5%, 細胞培養試験済み</td></tr><tr><td>9-cis-retinal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5754</td><td></td></tr><tr><td>試験済み Compounds</td><td>Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized</td><td>NA</td><td>Compoundsは、異なるベンダーまたはカスタム合成</td></tr><tr><td>B6-30抗ロドプシン抗体</td><td>Novus</td><td>NBP2-25160</td>博士<td>からの贈り物 Krzysztof Palczewski</td></tr><tr><td>Cy3-標識ヤギ抗マウス二次抗体</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td><td>115-165-146</td><td></td></tr><tr><td>16%パラホルムアルデヒド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>28908</td><td>メタノール</td></tr><tr><td>フリー10%ノーマルヤギ血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>50062Z</td><td>ブロッキングバッファーHoechst</td></tr><tr><td>33342、Trihydroch</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td>核染色溶液</td></tr><tr><td>ハイコンテントイメージャー</td><td></td><td>ImageXpress</td><td>ImageXpress&reg;マイクロコンフォーカルハイコンテントイメージングシステム</td></tr><tr><td>MetaXpress ハイコンテント画像取得・解析ソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td>メタエクスプレス</td><td>ハイコンテント画像取得・解析ソフトウェア</td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット (0.5-10 & micro;L)</td><td>レイニン17013802</td><td></td><td>手動8チャンネルピペット、0.5-10 &L</td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット (0.5-10c</td><td>レイニン</td><td>17013805</td><td>手動 8チャンネルピペット、20-200 &micro;L</td></tr><tr><td>電動マルチチャンネルピペット (10-200 &mu;L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-3879-56BT</td><td>96ウェルおよび384ウェルマイクロプレートピペッティングタスク用電子マルチチャンネルピペット</td></tr><tr><td>50ml 試薬リザーバー</td><td>ジェネシーサイエンティフィック</td><td>28-125</td><td>マルチチャンネルピプテ分注用試薬リザーバー</td></tr><tr><td>8チャンネル吸引器</td><td>ABCサイエンティフィ</td>ック<td>EV503</td><td>96ウェルまたは384ウェルプレートから液体を吸引するための8チャンネルステンレス製アダプター</td></tr><tr><td>エクセル表計算ソフト</td><td>Microsoft</td><td>Excel2016</td><td>データ分析とヒートマップ生成のためのスプレッドシートソフトウェア</td></tr><tr><td>Origin2018 科学データ分析とグラフ作成ソフトウェア</td><td>OriginLab</td><td>Origin2018</td><td>線量反応曲線を生成するためのデータ分析ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

高コンテンツ イメージング解析によるロドプシン輸送アッセイ

A Rhodopsin Transport Assay by High-Content Imaging Analysis

ロドプシンもって変異は常染色体優性支配的な網膜色素変性症 (RP)、まばゆいばかりの効果的な治療法がない疾患進行として明示されるロッド視細胞死に します。我々 は誤って折りたたまれたロドプシン変異体の細胞毒性が薬理学的変異型ロドプシン蛋白を安定化により軽減できることを仮定します。他のクラス II ロドプシン遺伝子の変異の中で、P23H の突然変異は野生型ロドプシン、哺乳類の細胞膜に輸送されるに対し小胞体 (ER) の蓄積は構造的に不安定なロドプシンの変異体タンパク質をエンコードします。セルです。以前発光による高スループット画面 (HTS) を行い細胞膜と小胞体から P23H ロドプシンのトランスポートを救出した薬理学的シャペロンのグループを識別します。ここでは、高コンテンツ イメージング解析に続いて免疫染色法を使用すると、セル全体で膜上の変異型ロドプシン蛋白の量を数値化。この方法は有益であり誤次の HTS. から真のヒット数を識別するために効果的ですさらに、高コンテンツ画像解析では、各化合物の薬理学的特性評価のための単一の実験から複数のパラメーターを数値化することができました。6 関連する RP ロドプシン変異体、これらロドプシン変異体の構造安定性に関する定量的および定性的な理解のための 2 D の薬理学的プロファイルを取得に向けて 11 さまざまな化合物の効果を行ったこの試金を使用して、これらの変異体に向けてさまざまな化合物の有効性と。

我々 は 3 つのパラメーターを持つロドプシン トランスポートを特徴付けられる: 全体のセル (ロドプシン-金星は INT)、ロドプシンの細胞膜 (細胞膜におけるロドプシン INT) の染色強度との比でロドプシン-金星強度ロドプシン ロドプシン-金星度のセル全体 (MEM 総比率) 細胞表面の汚れ。ロドプシン輸送アッセイの代表的な結果を図 3 図 4に示します。DMSO と 9 を使用してcis-網膜治療、それぞれ 0 と 100% コントロール P23H ロドプシン金星を表現するセル Z'-これらの 3 つのパラメーターは、0 から 0.5、アッセイは、中程度の品質を持っていることを示唆している間の範囲のための要因高コンテンツ画像21のために十分。にもかかわらず、最適化された Z'-要因は、HTS アッセイに比べて、比較的複雑なプロシージャのための 0.5 よりも低く、この試金はまだ堅牢...

ここでは、網膜色素変性症に関連付けられているロドプシン変異体の輸送を定量化する高コンテンツ イメージング法について述べる。多波長得点分析は、タンパク質ロドプシン細胞表面に、または全体のセルを定量化に使用されました。

Rhodopsin misfolding mutations lead to rod photoreceptor death that is manifested as autosomal dominant retinitis pigmentosa (RP), a progressive blinding ...

ロドプシンの誤折は、網膜色素変性症と呼ばれる進行性網膜変性を引き起こす。従来のイメージング方法ではロドプシン輸送を定量化する能力は限られていますが、この新しく開発された画像ベースのアッセイは、高スループットスクリーニングを可能にし、偽陽性を排除します。この技術は薬物薬物力学の迅速な評価を可能にする。疾患を引き起こすロドプシンの折りたたみを救い出す目では、静かに治療不能で盲目の疾患、網膜色素変性症の治療の可能性を加速させる。膜タンパク質の細胞の局在化は、その機能にとって非常に重要です。この方法は、容易に改変し、関心のある他の膜タンパク質の輸送を定量するために適用することができる。プレートマップを用意し、プレートの各ウェルから液を静かに加えて吸引し、細胞間で細胞数と免疫状態状態を一貫した状態に保つようにしてください。これにより、高い Z 係数と信頼性の高い結果が得られます。まず、黒壁、透明な底、ポリリジン処理384ウェルプレートに井戸あたり5000細胞をシード。細胞がプレートの底に付着するために3時間、5%のCO2でプレートを摂氏37度でインキュベートします。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、ここに示すような事前決定されたプレートマップに従って、5Xの作業溶液のウェルあたり10マイクロリットルを追加します。さて、2%DMSOのウェルあたり10マイクロリットルをカラム22と24に加えます。また、薄暗い赤い光の下で暗い部屋のカラム23に25マイクロモル9-シス-レチナルのウェルあたり10マイクロリットルを加えます。各種試験化合物の全ての装填が終了したら、プレートをアルミホイルで覆い、24時間37°Cでインキュベートします。薄暗い赤い光で暗い部屋で384ウェルプレートを取り出します。ここで、8チャネル吸引器を用いて、真空採取ボトルに接続し、プレートのウェルから培地を穏やかに吸引する。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、384ウェルプレート全体に作りたての4%パラホルムアルデヒドのウェルあたり20マイクロリットルを加え、室温で20分間細胞を固定します。固定後、プレートを通常の光にします。そこでは、8チャンネル吸引器を使用して、パラホルムアルデヒドを各ウェルに吸引し、マルチチャンネルピペットを使用してPBSのウェルあたり50マイクロリットルを加える。吸引し、合計3回の洗浄サイクルのためにPBSを交換してください。次に、各ウェルに5%ヤギの血清のウェルあたり20マイクロリットルを加え、室温で30分間プレートをインキュベートします。インキュベーションに続いて、ウェルを吸引し、1ミリリットルB630抗ロドプシン抗体あたり20マイクログラムの15マイクロリットルを加え、1%ヤギ血清中の行A〜O.Nextのウェルに1%ヤギ血清を加え、2次抗体のみの対照群の1%ヤギ血清のウェルに15マイクロリットルを加える。室温でプレートを90分間、または一晩で摂氏4度でインキュベートします。次に、フルオロフォアの光の吹き出しを避けるために、アルミニウム箔でプレートを覆います。次に、PBSの井戸当たり50マイクロリットルでプレートを3回洗浄します。最後の洗浄に続いて、PBSを吸引し、Cy3-共役ヤギ抗マウスIgG抗体の1ミリリットル当たり5マイクログラムのウェルあたり15マイクロリットルを加える。プレートをアルミホイルで覆い、室温で1時間インキュベートします。インキュベーションに続いて、プレートを3回洗います。次に、PBSのウェルあたり50マイクロリットルを加え、室温で1ミリリットル当たり1マイクログラムを15分間含有する。最後に、透明なフィルムでウェルプレートを密封し、アルミホイルで覆い、最大1週間摂氏4度で保管します。ホイルを取り外し、サンプルプレートを高内容のイメージャーに配置し、A1をプレートの左上隅に配置します。次に、画像取得ソフトウェアを開いて、画像取得用のパラメータを設定します。プレート取得セットアップウィンドウを開き、新しい設定を作成するか、既存のセットアップファイルをロードします。20X の目的を選択し、ピクセルビニングを 2 として設定し、キャリブレーション済みピクセル サイズは 0.80 x 0.80 ミクロンになるようにします。次に、スキャンラインを2000に設定し、画像サイズを1サイトあたり1000 x 1000ピクセルに設定します。次に、イメージするプレートタイプを選択します。プレート寸法を記入するために、メーカーから提供された情報を使用します。さて、井戸ごとに画像化される4つのサイトと一緒に画像化される井戸を選択します。吸引のヒントに触れられる井戸の側面を避けてください。イメージングでは、励起レーザーを405、488、461ナノメートルとして選択します。次に、DAPI、FITC、テキサスレッドチャンネルのエミッションフィルタを選択します。各チャンネルのレーザーパワーとゲインを最適化し、正のコントロールウェルが飽和していないことを確認します。オートフォーカスのためによく焦点を合わせるのによく選択してください。次に、取得する最初の井戸を選択し、すべてのサイトのサイトのオートフォーカスを設定します。また、各チャネルに対して 1 行あたり 4 つの平均値を選択し、各チャネルの Z オフセット値を最適化します。プレートの隅で2~3個の井戸を最初にテストし、すべてのテスト済みの井戸に焦点を当てるようにして、すべてが適切に設定されていることを検証します。次に、ウェルごとにすべてのサイトからの画像が40%以上の合流率を持つ細胞を持っていることを確認してください。最後に、すべてのチャネルの蛍光強度が100%制御ウェルで約半分飽和していることを確認する。次に、画像取得方法を保存し、プレート全体を実行する。イメージャーを見て、イメージャーを離れる前に、プレートの最初の列からイメージのキャプチャを完了して、イメージの品質を再確認します。完成したら、プレートを取り外し、今後の使用のために摂氏4度で保管してください。高コンテンツ画像解析ソフトウェアを使用して、画像データを取り出します。23 列目の 100% コントロール ウェルのいずれかを選択して、パラメーターを設定します。まず、解析方法としてマルチ波長セルのスコアリングを選択し、追加の設定を開始します。DAPI チャネルのイメージを使用して、核を定義します。選択したウェルに定義された核形状が核画像に適合していることを確認するプレビュー。次に、FITC チャネルで、ロドプシン Venus が画像化されるセルの形状を定義します。これを達成するために、各細胞の最小および最大直径、背景上の最小蛍光強度、ならびに各細胞の最小面積を設定する。さて、テキサスレッドチャネルのロドプシン細胞表面染色領域を定義し、細胞形状の最小および最大直径、背景上の蛍光強度の最小および各染色された細胞の最小面積を設定することによって。設定が最適化されているかどうかを判断するために、5つのウェルで現在のアルゴリズムをテストします。次に、設定を保存し、構成ウィンドウを閉じます。最適化された分析方法ですべての井戸を実行します。完了したら、オブジェクト番号を無傷のセル番号としてエクスポートします。FITCチャンネルの平均強度をロドプシン金星強度としてエクスポートし、テキサスレッドチャンネルの平均強度をセル表面のロドプシン強度としてエクスポートします。スプレッドシート ソフトウェアを使用して、各パラメータに対して 2 色のヒート マップを生成します。X 軸上にセルラインの名前を並べ、y 軸上にコンパウンドを配置します。ここでは、P23Hロドプシン金星の画像はU2OS細胞を処理し、金星蛍光を緑色で発現し、細胞表面の免疫染色を赤色で表した。細胞は、DMSOまたは5個のミクロモル9-シス-レチナルで処理した。ロドプシン輸送アッセイは、種々の条件下で全細胞におけるロドプシン量を比較し、P23H変異細胞株において有意な回復を示し、9-シス-レチナルで処理した場合である。また、細胞表面上のロドプシン強度は、細胞表面のロドプシン染色の比率と全細胞におけるロドプシン金星強度に対する比と、P23H変異体に対して有意に低くはないが、DMSOで処理された野生型ロドプシンと比較する。ヒート マップは、複数の変異体のセルあたりの平均ロドプシン量とローカリゼーションを比較する効率的な方法です。ここで、野生型対照および6個のロドプシン変異体が水平に列挙され、化合物処理の効果を垂直に比較する。これまでの研究と一致して、細胞表面のロドプシン強度と細胞表面のロドプシン染色の比率と、セル表面のロドプシンの強度と、DMSOで処理された野生型と比較して6つの変異体の強度が低い。化合物1、2、6および9は、T4R、P23H、D190N、およびP267Lロドプシン変異体におけるロドプシン金星強度に対する細胞表面上のロドプシン染色の比率を有意に増加させ、これらの化合物がこれらのロドプシン変異体の細胞膜への輸送を救うことを示唆している。これは画像分析にとって重要であるため、固定前に細胞は50〜70%のコンフルエントである必要があります。また、プレート全体に井戸の画像を見せました。フォーカスのある画像と、終了しない蛍光がどのチャンネルのしきい値もすべて持っていることを確認します。選択化合物まで、誤って折り畳まれたロドプシン輸送を救助し、プロセスを検証し、次にロドプシンP23H突然変異体を発現するマウスモデルを使用して、生体内でこれらの化合物の有効性を渡すことができる。この方法により、膜タンパク質量とその局在性を定量化することができます。したがって、それは、保存および分解を支援する膜タンパク質で開始したマイクロミスのための素晴らしいツールです。パラホルムアルデヒドは、この実験と同様に、この試薬の取り扱いに関する手順を有する。それはフードの下で行われます。この試薬を含む廃棄物は、有害な化学物質として適切に廃棄する必要があります。

a-rhodopsin-transport-assay-by-high-content-imaging-analysis

Research

JoVE Journal

Chemistry

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学ぶ高コンテンツイメージング解析によるロドプシン輸送アッセイ。網膜色素変性症治療薬のスクリーニングと薬力動態評価に応用可能な定量的手法を確立し、膜タンパク質輸送研究を加速します。

高コンテンツ イメージング解析によるロドプシン輸送アッセイ

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高コンテンツイメージング解析によるロドプシン輸送アッセイ