Name: マウスの皮膚腫瘍からリンパ管を介して白血球出口の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: 学ぶマウス皮膚腫瘍における白血球リンパ管出口の定量化法。Kaedeトランスジェニックマウスと光変換技術を用いて、in vivoで内源性免疫細胞動態を追跡し、がん免疫応答の理解に貢献します。

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著者は、B6 を提供するため YUMM 1.1 YUMM 1.7 マウス黒色線と博士デボラ ・ j ・ Fowell を提供する博士マーカス ボーゼンベルクを感謝したいです。理研 BRC を通じて、国立生物資源文部科学省、日本の合意 cg Tg(CAG-tdKaede) 15Utr マウス。

動物のすべてのプロトコルは、機関動物ケアとオレゴン健康及び科学大学で利用委員会によって承認されています。
1. 炎症とマウス耳介の FITC 絵画の誘導
<ol><li>層流フードの麻酔気化した isofluorane を用いた c57bl/6 マウス (3-5 %isofluorane で誘導し、1-3 %isofluorane; 維持酸素流量 0.5 〜 1.0 L/分)。ペダル反射の損失を監視することによって適切な anesthetization を確保する不随意運動と呼吸数の減少。</li>
	<li>上を向いて耳の腹側をフラット耳を置きます。ピペット 20 μ L 5 %fitc 溶液の溶解フタル酸 1:1 アセトン: ジブチル (DBP) 耳介の腹側へ。数秒間乾燥する耳を許可します。</li>
	<li>FITC 塗布後 24 時間は、頚部転位続いて二酸化炭素暴露を介してマウスを安楽死させます。PBS に耳の耳介を収集するには、はさみを使って頭から耳を分離します。LNs を周囲の組織から分離するピンセットを使用して PBS に頸部 dLNs と鼠径非排水 LNs を収集します。鼠径部の非排水 LNs は、FITC+/Kaede 赤+白血球の存在に否定的なコントロールとして機能します。組織のプロトコルごとの死体を処分します。 注: セルの種類および知られている移住性の動作の分析のための最適な時間ポスト光電によって異なります。たとえば、樹状細胞は、6 h ポスト DBP アプリケーションとして、早く dLNs に検出できます。</li>
</ol>2. マウス耳介の炎症の誘導
<ol><li>層流フードのケタミン 80 mg/kg および 10 mg/kg キシラジン生理食塩水に溶解した腹腔内投与によって楓 Tg マウス (背景 C57Bl/6) を麻酔します。手順 1.1 で説明されているように、適切な anesthetization を確認します。</li>
	<li>上を向いて耳の腹側をフラット耳を置きます。ピペット 20 μ L 1:1 アセトン: DBP、耳介の腹側への。数秒間乾燥する耳を許可します。</li>
	<li>DBP アプリケーション後アルミ箔の部分にスリットを切り、紫外線光源に耳を公開するスリットを介して耳を引き出します。耳が上向きに両面テープを使用して箔に耳を保護する背側で平ら。</li>
	<li>3 分で 100 mw 405 nm 光源を使用して光源、および photoconvert の下で直接耳を配置します。</li>
	<li>光電後、24 h 楓 Tg マウスを安楽死させるし、手順 1.3 で説明したように耳耳介、頸の LNs と鼠径 LNs を収穫します。 注: 手順 1.3 で引用される考慮事項に加えて増殖率決定分析のタイミング楓赤の損失が急速に細胞分裂で発生するとします。</li>
</ol>3. ワクシニア感染マウス耳介の FITC
<ol><li>手順 1.1 で説明されているように気化した isofluorane と c57bl/6 マウスを麻酔します。</li>
	<li>耳の腹側を平らに横たわっていた。ピペット 5 x 106プラーク形成単位 (PFU) ワクシニア ウイルス (VacV) の耳の耳介に 10 μ L の PBS で希釈しました。29 ゲージ針を使用して、25 回40耳介を突きます。</li>
	<li>24 h 後感染手順 1.1 およびピペット 20 μ L 5% 耳の耳介の腹側にアセトンに溶解した FITC で説明されているように isofluorane と VacV に感染したマウスを麻酔します。数秒間乾燥する耳を許可します。</li>
	<li>FITC 塗布後 24 時間はマウスを安楽死させるし、手順 1.3 で説明するように耳の耳介、頸部 LNs と鼠径 LNs を収集します。 注: FITC DC さまざまな 24 h 間隔で人身売買を決定する任意の時間ポイント記事感染症に適用できます。我々 は、dLNs に DC 移行が日 1 に 3 記事感染41から同じようなレベルで維持されることを報告しました。</li>
</ol>4. ワクシニア マウス耳介と光電の感染症。
<ol><li>手順 1.1 で説明されているように気化した isofluorane と楓 Tg マウスを麻酔します。</li>
	<li>ステップ 3.2 で説明されているように VacV と耳介を感染させます。</li>
	<li>24 h 後の感染症は、楓の VacV 感染マウス ステップ 2.1 で説明されるように麻酔し、2.3 2.4 の手順で説明するよう光電を実行します。</li>
	<li>光電後、24 h はマウスを安楽死させるし、手順 1.3 で説明したように耳耳介、頸の LNs と鼠径 LNs を収穫します。 注: 手順 3.4 で上記のよう光電は任意の時間ポイントのポスト感染で管理できます。</li>
</ol>5. 耳とリンパ節のフローサイトメトリー用処理
<ol><li>耳の耳介の単一細胞懸濁液を作成: 離れて 1 mg/mL コラゲナーゼ D と 80 U/mL DNase の希釈を含む 24 ウェル プレートのウェルに下に向けて耳の内側でピンセットと場所の 2 つのペアを使用して耳の耳介の腹側と背側の皮をむく ハンクの緩衝生理食塩水ソリューション (HBSS) (Ca2 +と Mg2 +を含む)。70 μ m ナイロン携帯こし器を通って 30 分押して消化組織の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>LNs から単一細胞懸濁液を作成: 1 mg/mL コラゲナーゼ D と 80 U/mL DNase HBSS で希釈を含む 24 ウェル プレートの井戸の LNs を配置。リンパ節 2 つ 29 ゲージ針を使用してカプセルし、リンパ節の 37 ° C で 30 分間インキュベーションしていじめるオープンは、70 μ m ナイロン携帯こし器を通って消化組織を押します。</li>
</ol>6. 皮内黒色腫腫瘍移植と光電。
<ol><li>電気かみそりを使用して楓 Tg マウスの背中の中心から毛を剃る。</li>
	<li>29 ゲージ針を左と右の肩甲骨の間の背中の中央に位置し、掻き楓 Tg マウスの皮膚に 5 × 105腫瘍細胞 (50 μ L の生理食塩水で希釈) を注入します。腫瘍は、指定されたリンパ節 (すなわち、左と右の上腕腫瘍 LNs は背中の上部中央に配置) にリンパドレナージュをように慎重に位置する必要があります。これにより、皮膚の腫瘍を LNs の直接光電、dLN 上腫瘍を配置しないでください。</li>
	<li>希望サイズ (100-650 mm3) に成長する腫瘍を許可します。</li>
	<li>組織採取前 1 日楓 Tg マウスを麻酔は、2.1 で説明されると、腫瘍周辺新しく再成長毛を剃る。</li>
	<li>アルミ箔に穴をあけるし、光源に腫瘍を公開する腫瘍を通りぬけた。腫瘍が穴を通って戻って落ちるを防ぐために腫瘍よりわずかに小さい穴を開けるし、隣接する、非腫瘍性の皮膚の変換を最小限に抑えます。</li>
	<li>5 分で 200 mw 405 nm 光源を使用して photoconvert と光源直下の腫瘍を位置します。</li>
	<li>光電後、24 h は、手順 1.3 で説明するように、マウスを安楽死させます。PBS に腫瘍、上腕の dLNs と鼠径非排水 LNs を収集します。はさみを使用して周囲の皮膚から腫瘍を切り取って手順 1.3 で説明したように、LNs を削除します。</li>
</ol>7. 腫瘍とリンパ節のフローサイトメトリー用処理
<ol><li>腫瘍から単一細胞懸濁液を作成: 1 mg/mL コラゲナーゼ D と 80 U/mL DNase HBSS で希釈を含む 24 ウェル プレートのウェルにハサミで腫瘍をミンチします。70 μ m ナイロン ストレーナー 1 h. プレス消化組織の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>ステップ 5.2 で説明されているようにリンパ節の単一細胞懸濁液を作成します。</li>
</ol>8. フローサイトメトリー用染色抗体
<ol><li>単一細胞懸濁液に組織を消化した後、興味のマーカーとセルにラベルを付ける標準流れ cytometry 染色法を実行します。96 ウェル プレートに、6セルを簡単に言えば、ピペット 2 x 10 です。Fc ブロック (1 μ g/mL) 氷; 上で 20 分間サンプルをインキュベートします。FACs バッファー (1% ウシ血清アルブミンの PBS) で 2 回洗浄します。ライブ/死者の汚れ (PBS で希釈) をサンプルに追加し、氷; 15 分間インキュベートFACs バッファーで 2 回洗浄します。氷; 上で 30 分間 FACs バッファーで希釈した一次抗体 (材料表) と孵化します。FACs バッファーで 2 回洗浄します。 注: 緑楓と楓; FITC と PE fluorophores が付いて赤い蛍光性が重なっています。したがって、FITC や PE 標識抗体楓蛋白質との組み合わせでは使用できません。</li>
	<li>汚損の後流れの cytometer でサンプルを実行します。また、2% のセルを修復する PFA。</li>
</ol>9. フローサイトメトリー解析
<ol><li>範囲全体の 70-80% に FITC (緑楓) と PE (楓赤) チャネル PMT 電圧を設定 (人口約 10 のセンター4) 楓グリーン前のヴィヴォまたは楓赤単色脾細胞や血液を使用します。 注: は、広がる大きい信号になるので楓の緑 (FITC) 楓赤 (PE) チャンネルの賠償しません。<ol>
<li>単色楓コントロールを作成するには、楓 Tg マウスから脾臓や血液を収集します。ACK バッファーが付いて赤い血液細胞を溶解し、セルを 2 つのグループに分割: 楓の緑と変換後の楓赤をダブルクォートします。</li>
		<li>単一色の楓赤コントロール中断 1 mL の PBS のセルと 100 の力で 405 nm 光源を使用して 5 分 24 ウェル プレートで photoconvert mW。これらの細胞を使用して楓楓緑 (FITC) を設定する流れの cytometer (ステップ 9.1) の赤の PMT 電圧。</li>
	</ol>
</li>
	<li>楓蛋白質のため電圧を設定すると、単一分子蛍光ラベルの製造元の指示に従って補償ビーズを使用して他のすべての一次抗体の汚れを補正します。</li>
	<li>データを収集するために流れの cytometer でサンプルを実行します。 注: 楓蛋白質は細胞によって生産されて継続的に。つまり、24 h、光電変換されたセル楓緑の二重肯定的なとが楓新生楓 (緑) として赤いタンパク質は細胞内蓄積してきた。</li>
	<li>FlowJo ソフトウェアまたは類似のソフトウェアを使用してデータを分析します。</li>
</ol>

著者を開示するとの競合があります。

周辺機器、非リンパ系組織から白血球の出口は、開始と免疫応答の解像度の重要が、出口を支配する分子メカニズムはよくわかっていません。知識で、このギャップは主に定量化の vivoのためのツールの準備状況のためです。ここでは、蛍光マウス皮膚腫瘍から内因性白血球出口を定量化し、炎症性の FITC ペンキを直接頭に頭の比較を提供 (楓 Tg) と感染症モデルの使用について述べる。両方のモデルは、内因性の DC 集団を追跡、FITC と貧しい吸収非貪食細胞の自由な排水は FITC 塗料を含む周辺、リンパ系の組織から骨髄性とリンパの出口の広範な分析のためのユーティリティを制限することを示す腫瘍。さらに、提案する腫瘍から出口が Torcellanらによって提示された結果を裏付けて確率よりもむしろ選択を示すデータ39. 腫瘍から白血球出口を支配するメカニズムのそれ以上の調査は腫瘍炎症と免疫に新しい洞察力を明らかにするかもしれない。
文献で報告されると設定を使用してマウスの皮膚とその局所炎症に対する光電の効率性をまず評価...

末梢組織の免疫反応は炎症のサイトに白血球動員だけでなく、後続の維持を調節するメカニズムによっても形成されます。したがって、防御免疫は、内で、滞在がリンパ管を介して末梢組織から移行というか白血球を入力すると、かどうかを決定する累積的な細胞および分子メカニズムによって決まります。重要なは、出口 (出口と呼ばれる) リンパ管を介して組織への白血球のための傾向は、その特殊な機能にリンクされます。樹状細胞 (DC) は、抗原輸送と排水のリンパ節 (dLN)、適応免疫1に必要なプロセスのプレゼンテーションにつながる成熟信号への応答での回遊行動を取得します。マクロファージや好中球などの清掃の骨髄細胞は貪食によりアポトーシス破片をオフになります。細菌感染時に好中球が組織を離脱、最終的に dLNs2で、DSS 誘発大腸炎モデルにおけるアポトーシスを受ける、データはマクロファージ出口局所炎症3を解決する必要がある仮説をサポートします。好中球とマクロファージの出口が炎症性のすべてのコンテキストで発生するかどうかも不明です。定常状態4,5,6、7、感染8、および炎症を起こして4,9,10、から T リンパ球の出口のための証拠11,12周辺機器、非リンパ系組織が、この出口を駆動する組織に基づく信号のままかり、T 細胞が積極的に循環させるを示します。いくつかの研究を特定 21 (CCL21) とその受容体 CCR74,11、ケモカイン (C C モチーフ) 配位子を含む出力の信号に向かってリンパ毛細血管を排出方向の移行に必要なその後 13ケモカイン (モチーフ C X) 12 (cxcl 12) リガンドとその受容体 CXCR42,14、そしてスフィンゴシン-1-リン酸 (S1P)10,,1516。しかし、これらのメカニズムはすべてのコンテキストでアクティブではない、未解決の問題が残っているかどうか、彼らはすべてのセル型の出力を決定します。重要なは、さらには、出口と疾患における関連性機能を制御するメカニズムに洞察力は体内の定量的分析の方法する必要があります。
複数モデル動物体内のリンパ管の直接カニューレ装着前のヴィヴォ標識白血球、蛍光トレーサーの経皮吸収型アプリケーションの養子の転送を含む出口を定量化するいくつかの方法が使用されています。ラベル付けされた粒子と生体内で光電17,18の注入。マウスの求心性リンパ管の直接穿刺が難しい、収集することができます流体のボリュームで小動物に限られました。大型の動物でカニュレーションが大きく行われてしたがって、(e.g。、羊) このような手術操作、実用的。これらの研究は、リンパ性と骨髄性リンパ10,19,20細胞の存在の直接的な証拠を提供します。さらに、羊のモデルは、急性および慢性の炎症がほぼ 100 の10、21でリンパでリンパ球の存在を増加することを明らかにします。
ラベルおよび遺伝子を組み換えられたリンパ球の養子の転送は CCR7 は CD4 の出口に必要な重要なは明らかに+ T 細胞急性炎症を起こした皮膚5,11, リンパ球の前処理中から小分子 S1P 受容体アゴニスト、FTY720、部分的にしか、出口10を抑制します。興味深いことに、慢性的な炎症を起こした皮膚から転送されたリンパ球の出口は CCR7 独立10が、部分的に CXCR49を必要があります。養子転送実験、ただし、提供ex vivoの非生理的番号活性およびラベル付けされたリンパ球挿入により、組織と間質性流体圧力の生体力学的環境を変える組織に初期リンパ毛細血管を開き、トランスポート プロパティ22を変更します。かに (FITC) 皮膚刺激の有無での代替、経皮吸収型アプリケーションとして (e.g、フタル酸ジブチル、DBP) または感染23,24の追跡が可能になります。トレーサーを蓄積し、dLNs に移行する貪食細胞。同様に、蛍光に分類された腫瘍は腫瘍材料25を飲み込んでいる貪食細胞を追跡する手段を提供します。これらのメソッドは、DC の出口13,14,17,26,の27を支配するが、非貪食を追跡することができるメカニズムの重要な洞察を提供しています。リンパ球と、解釈可溶性 FITC 非渡り鳥、こうしてラベリング LN バイオハザード Dc のリンパ排液無料によって複雑になることができます。
また、生体顕微鏡観察は、リアルタイム28,29生理関連の白血球ポピュレーションの生体内での追跡のためにできる強力なツールです。顕微鏡は空間の複合体を明らかにした生体レポーター マウスと体内に抗体を用いた免疫蛍光ラベリングと組み合わせて使用し、ダイナミクスの免疫細胞人身売買などの間質性の移行30、リンパ内皮、内リンパ腔と LN エントリ28,31に移行通路輪廻。生体イメージング技術の広範な採用経費、設定のための必要な専門知識によって制限され、種類の細胞を定量化のスループットを制限します。まだ、人口動態を分析定量メソッドを結合組織生体イメージング洞察を提供する追加と重要な機構運動とリンパ毛細血管内の移行のメカニズムに関して18,31,32。
その結果、生体内で光電として浮上しているメソッドをその場でラベルは、貪食活性の生理的白血球出口 (フローサイトメトリーによる結合) 時での定量化のために独立した、チャレンジの有無。楓 Tg マウスは恒常不可逆的赤い蛍光性 (楓赤)33に変換した後、紫の光にさらされるまで、蛍光グリーン (緑楓) を表わす石サンゴから分離した蛋白質を表現します。Photoconverted 細胞は末梢組織サイトから離脱する彼らを追跡できる、dLNs の蓄積します。これとその他似たような蛍光マウス モデル34,35肌36から制御性 T 細胞の構成の出口、パイエル板の37 から CXCR4 依存性 B 細胞の出口を含む重要な生物学を明らかにしました。、ペプチド再チャレンジ38、および広範な白血球腫瘍微小39から出口に常駐メモリー T 細胞の動員。ここで、皮膚の炎症や感染症蛍光法による既存データの直接比較を可能にするためのコンテキストで経皮 FITC アプリケーションと光電の比較を実行します。さらに、我々 は移植腫瘍における光電を示し、変換効率および腫瘍微小から選択的避難説明。など、私たちは腫瘍、腫瘍内白血球複雑さ、抗腫瘍免疫の解釈にとって重要な意義があるから白血球出口の重要な生物学の解明に更にこれらのメソッドのアプリケーションを必要と主張して療法への応答。

<table><tbody><tr><td>コラゲナーゼ D</td><td>ロシュ</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>ロシュ</td><td>4536282001</td><td></td></tr><tr><td>光ファイバーとコリムターを備えた銀LED-405B 光源</td><td>Prizmatix Ltd</td><td>V8144</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセイン イソチオシアネート異性体 I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4274</td><td></td></tr><tr><td>フタル酸ジブチル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>524980</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>マクロンファインケミカルズ</td><td>2440-02</td><td></td></tr><tr><td>29ゲージシリンジエク</td><td>セルインターナショナル</td><td>26029</td><td></td></tr>エ<tr><td>バンスブルー</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>70ウムセルス</td><td>トレーナーVWR</td><td>732-2758</td><td></td></tr>パラ<tr><td>ホルムアルデヒド</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ケーソン</td><td>HBL06</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>精製抗マウス CD16/CD32</td><td>とんぼバイオサイエンス</td><td>70-0161-M001</td><td></td></tr><tr><td>BV605 CD11c (クローン N418)</td><td>Biolegend</td><td>117334</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2)</td><td>BD Pharmingen</td><td>562363</td><td></td></tr><tr><td>BV421 CD3e (clone 145-2C11)</td><td>Biolegend</td><td>100341</td><td></td></tr><tr><td>APC CD8a (クローン 53-6.7)</td><td>TonBo Biosciences</td><td>20-0081-u100</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 CD45 (クローン 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>BV650 CD19 (クローン 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115541</td><td></td></tr><tr><td>PercCP-Cy5.5 Ly6C (クローン HK1.4)</td><td>Biolegend</td><td>128011</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 F4/80 (クローン BM8)</td><td>Biolegend</td><td>123121</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Ly6G (クローン 1A8)</td><td>Biolegend</td><td>127623</td><td></td></tr><tr><td>BV711 CD11b (クローン M1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101241</td><td></td></tr><tr><td>BV605 CD45 (クローン 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103155</td><td></td></tr><tr><td>BV711 CD4 (クローン RM4-5)</td><td>BD Biosciences</td><td>563726</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (Fraction V)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Anit-Ratおよび反ハムスターIgk /否定的な制御の補償の粒子セット</td><td>BDのBiosciences</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>Fortessaの流れのサイトメーター</td><td>BDのBiosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10ソフトウェア</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスの皮膚腫瘍からリンパ管を介して白血球出口の定量化

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

末梢組織から排出リンパ節の白血球出口免疫監視の開始に重要ではありませんが、末梢組織の応答の解像度にも貢献しています。非リンパ系、末梢組織から白血球出口を定量化するためには、さまざまなメソッドを使用、文脈依存の出力を制御する細胞・分子メカニズムままかり。ここでは、マウスの皮膚腫瘍から白血球出口の定量分析のための in situ光電の使用について述べる。光電直接ラベル白血球の皮膚組織内で常駐が可能です。紫外光に肌の露出を引き起こすローカルも炎症反応によって特徴付けられる白血球浸潤と血管の水漏れしたため、蛍光トレーサーの経皮吸収型アプリケーションとの比較で光電具体的渡り鳥の樹状細胞集団をラベルし、皮膚微小と腫瘍から骨髄性とリンパの出口の定量化を同時に有効になっています。腫瘍内白血球複雑さの私達の理解の不足しているコンポーネントのまま白血球出口のメカニズムと免疫微小両方記載ツールのアプリケーションが腫瘍のダイナミクスにユニークな洞察を提供するため定常状態と治療への反応で。

我々 はまず効率を評価し、マウス皮膚に関連付けられている炎症を決定する文献で公表された光電結果を複製しようと思う。耳の耳介は、100 mW の青紫の光にさらされた (405 nm) 3 分で33が前述の。単一の細胞懸濁液すべて CD45 の 78% の変換効率を明らかに露出の後すぐに、耳の皮膚や子宮頸 dLNs から生成された+ dLNs (図 1 a) にみられたない変換されたセルで皮膚の白血球。CD45 の浸潤の数を数値化光電に関連付けられている炎症反応を評価する+変換された耳 0 と 24 h で白血球ポスト変換 (図 1 b) と急性変化血管透過性の測定としてマイルのアッセイ42 (図 1)。簡単に言えば、エバンス ブルーが、巡って 0.5 0 μ...

ここでは、我々 は生体内の白血球、炎症、ナイーブから出口の定量化とマウス皮膚の悪性の方法を示します。我々 は 2 つのモデルの比較を実行: 経皮 FITC アプリケーションとその場で光電。さらに、光電性皮膚腫瘍から白血球出口を追跡するためのユーティリティを紹介します。

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...

光変換は、白血球の居住地および疾患状態の複数の組織部位からの出口ダイナミクスに対する力学的洞察のための白血球出口の定量的分析のための追跡可能なin vivo方法を提供する。さて、ここでは、白血球の皮腫瘍からの追跡の有用性を示す。このアッセイを他の組織や疾患に適用することは、光を投与する能力によってのみ制限される。この技術の主な利点は、生体内の炎症組織からの出口として免疫細胞集団を移入するのではなく、内因性の定量化を可能にすることです。炎症を誘発するために、つま先ピンチに対する応答の欠如を確認した後、20マイクロピペットを使用して20マイクロリットルのフタル酸ジブチルまたはDBPを投与し、麻酔付きKaedeトランスジェニックマウスの耳のピナの腹側に投与する。DBPを乾燥させた後、アルミ箔のスリットを通して耳を引き、両面テープを使用して、裏側を上向きにしてホイルに耳を平らに固定します。次に、405ナノメートルの光源の下に直接位置し、100ミリワットの電力で3分間光変換します。ワクシニア感染の場合、麻酔付きKaedeトランスジェニックマウスの耳のピナ上にPBSの10マイクロリットルでワクシニアウイルスの5回10〜6番目のプラーク形成ユニットを投与するためにマイクロピペットを使用し、ピナを25回突く。24時間後、ちょうど実証したように、ピナをフォト変換します。適切な実験時に、ピナエと子宮頸部リンパ節およびインジナーリンパ節を収穫し、ピンセットの2組を使用して各ピナの腹側と側側を剥離する。次に、リンパ節と耳の内側を下に向けたピナ片を、コラゲターゼDの1ミリリットル当たり1ミリグラム、カルシウムとマグネシウムを含むHBSSで希釈したDNA1ミリリットル当たり80単位を含む24ウェルプレートの個々の井戸に入れる。2本の29本のゲージ針を使用して、各リンパ節カプセルを開け、プレートを37°Cで30分間置きます。インキュベーションの最後に、消化されたピナとリンパ節組織を別々の70ミクロンナイロン細胞ストレーナーで押し、各組織の単一細胞懸濁液を得る。腫瘍が適切な実験サイズに成長したら、腫瘍部位の周りに新しく再成長した毛皮を剃り、アルミニウム箔の一部に切断された円形の穴を通して腫瘍を引っ張る。腫瘍を405ナノメートルの光源の真下に配置し、200ミリワットの電力で5分間光変換します。光変換の24時間後、各動物から腫瘍および腕利およびインギナルリンパ節を収穫し、HBSSのコラゲナーゼDおよびDNaseを含む24ウェルプレートの個々のウェル内の腫瘍をミンチするためにはさみを使用する。リンパ節を別々の井戸に入れ、ちょうど実証したようにカプセルを開けろ。腫瘍を摂氏37度で30分間インキュベートし、リンパ節を37°Cで30分間インキュベートした後、消化した組織を別々の70ミクロンストレーナーを介して押して、各組織の単一細胞懸濁液を得る。フローサイトメトリーによる単一細胞懸濁液を解析するには、まず、ケエデトランスジェニックマウスから脾臓または血液を採取し、塩化アンモニウムカリウムバッファーで赤血球をリセ化する。細胞を1つの未変換のKaede FITCと1つの変換されたKaede PE集団に分割し、PBSの1ミリリットルの単色のKaede PE細胞を24ウェルプレートの1つの井戸に再懸濁し、100mmの電力で405ナノメートルの光源の下で5分間細胞を光変換します。次に、光変換されたKaede PEセルと未変換のKaede FITCセルを使用して、各蛍光チャネルの全範囲の70〜80%に光増倍率電圧を設定します。Kaedeタンパク質の電圧が設定されたら、メーカーの指示に従って、単一のフルオロフォア標識補償ビーズを使用して他のすべての一次抗体染色を補償します。次に、標準的なフローサイトメトリック解析プロトコルに従ってフローサイトメーター上でサンプルを実行します。光変換暴露直後に耳皮膚または子宮頸部排出リンパ節から発生した単一細胞懸濁液は、皮膚内のすべてのCD45陽性白血球の78%の変換効率を明らかにし、リンパ節の排出には変換された細胞が観察されない。光変換された耳の中の浸潤CD45陽性白血球の数を定量化して、変換後0時間および24時間、紫光暴露が白血球浸潤の統計的に有意な増加を引き起こすことを明らかにする。しかし、このCD45陽性白血球浸潤の増加は、ワクシニアウイルスなどの強力な炎症性刺激によって誘発される浸潤に対して小さい。光変換はまた、マイルズアッセイによって測定される耳のピネにおける血管透過性を増加させ、用量、暴露時間およびデータ解釈を最適化する際に、組織炎症に対する紫色光の影響を考慮すべきであることを示す。光変換された動物からの解離された腫瘍細胞のフローサイトメトリック分析は、腫瘍内CD45陽性細胞をKaede FITC陽性からKaede PE陽性に有意に変換することを明らかにし、一方でリンパ節細胞の排出は未変換のままである。CD45陽性白血球の光変換効率は腫瘍の種類と大きさの間で有意に変化し、小さな黒色腫腫瘍内のCD45陽性白血球が最も効率的な光変換を示した。腫瘍体積が増加するにつれて、変換効率は50%程度に低下し、メラニンは小さい腫瘍では約30%のメラニン産生腫瘍内で観察されたCD45陽性細胞の最大光変換で光変換効率に顕著な影響を及ぼし、腫瘍体積が400立方ミリメートルに近づくにつれて10%に低下する。光変換の24時間後にリンパ節を排出する腫瘍の検査は、種々のフェノタイプのカエデ赤陽性免疫細胞の存在を明らかにし、したがって、光変換された腫瘍からの白血球の移動を示す。その開発後、この技術は、免疫学の分野の研究者が、末梢組織における定常状態および炎症を起こした白血球回転の運動学を明らかにする道を開いた。この手順を試みる間、周囲の組織の不注意な光変換が結果を損なうため、関心のある組織のみを光変換することが重要です。この方法に新しい個人は、目的の白血球のダイナミクスに基づいて、組織の変換のための暴露時間だけでなく、組織の収集が発生する前の時間の持続時間を最適化する必要があります。

quantifying-leukocyte-egress-via-lymphatic-vessels-from-murine-skin

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

近赤外蛍光（NIRF）を使用して、最近開発されたイメージング技術は、リンパ系の癌転移、免疫応答、創傷修復、および他のリンパ関連疾患に果たす役割の解明に役立つことがあります。...

マウスのリンパ脈管構造の非侵襲的光イメージング

このビデオは、マウスでMycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin...

感染マウスのドレナージリンパ節への皮膚樹状細胞の移動を監視するためのCFSEベースのアッセイ

このプロトコルは、マウス腫瘍モデルにおける腫瘍微小環境内の白血球サブセットの詳細な評価方法を記述しています。ケメリン発現B16メラノーマ細胞を同系マウスに皮下移植した。その後、腫瘍微小環境の細胞を染色し、フローサイトメトリーで解析することで、詳細な白血球サブセット解析が可能になりました。...

皮下腫瘍モデルにおける腫瘍浸潤白血球サブセットの評価

皮膚からドレインリンパ節への細胞移動を追跡するためのマウスでのアッセイが説明されており、これにより、Bacille...

での感染の間に流入領域リンパ節へのマウスの皮膚樹状細胞の移動を研究するためにCFSEベースアッセイ<em&gt;マイコバクテリウム・ボビス</em&gt;カルメット - ゲラン

リンパ球走化性と移行の定量的評価のためのプロトコルは、免疫学の研究のための重要なツールです。ここでは、リアルタイムで、多重セル移行の評価だけでなく、生体内で相補的な技術有効にする追跡ネイティブ細胞の脾臓に、体外のプロトコルを説明します。...

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウス リンパ球の定量化

このプロトコルでは、リンパ球は、多孔質膜によって下部チャンバから分離された移行系の上部チャンバーに配置される。ケモカインは底室に添加され、ケモカイン勾配に沿って活発な移動を誘導する。48時間後、リンパ球は、移行を定量するために両方の部屋でカウントされます。...

排ビボ移行システムにおけるリンパ球移動の評価

ここでは、マウスクレマスター筋の毛細管後小胞に対して生体内顕微鏡を行う方法を示す。炎症および敗血症の異なるモデル、特にケモカインおよびサイトカインによって誘発されるものに一般的に適用され、我々は誇張された筋白血球浸潤を伴うムスコロパシーの研究におけるその関連性を強調する。...

インビタル顕微鏡で評価されたマウスにおけるクレマスター筋の白血球浸潤

ここでは、経胸管リンパ球を採取し、ラット・ペイアーのパッチ中の腸管リンパ球の移動をタイムラプス写真を用いて3時間観察するための正確な方法について述べた。この技術は、炎症性条件下でリンパ球の動態がどのように影響を受けるかを明らかにすることができる。...

ラット・ペイアーのパッチにおけるリンパ球ダイナミクスの顕微鏡観察

メラノーマは、すぐに他の臓器に広がる非常に攻撃的な病気です。このプロトコルは、転移性黒色腫のBraf/Ptenマウスモデルにおける鼠径リンパ節の体積を監視するために、3Dレンダリングと組み合わせた超高周波超音波イメージングの適用を説明する。...

メラノーマのBraf/Pten遺伝子操作マウスモデルにおける超高周波超音波イメージングによるリンパ節容積の解析

この論文では、真皮リンパ管からマウス内皮細胞を磁気ビーズベースで単離する方法について説明しています。単離されたリンパ内皮細胞は、下流の in vitro 実験やタンパク質発現解析に使用できます。...

マウス真皮リンパ管内皮細胞の単離

学ぶマウス皮膚腫瘍における白血球リンパ管出口の定量化法。Kaedeトランスジェニックマウスと光変換技術を用いて、in vivoで内源性免疫細胞動態を追跡し、がん免疫応答の理解に貢献します。

マウスの皮膚腫瘍からリンパ管を介して白血球出口の定量化

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