Name: CRISPR ベース Cas9 の競争の試金を使用して遺伝的依存関係の調査 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: 学ぶCRISPR-Cas9競争的増殖アッセイを用いて、急性骨髄性白血病細胞における複数遺伝子の機能を並列に調査する方法。この技術は迅速かつスケーラブルで、他のがん細胞系への応用も可能である。

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PCW Cas9 プラスミドだったエリック ・ ランダー & デヴィッド ・ サバティーニ (Addgene プラスミド # 50661) と pKLV2 U6gRNA5 (BbsI) - PGKpuro2ABFP - からの贈り物 W プラスミドから遊佐ラボ (Addgene プラスミド #67974。フローの分析と並べ替えとタイムリーなヘルプ SBP 医療探索所フローサイトメトリー コアに感謝したいと思います。西暦女性タタ記念財団のサポートを確認したいと思いますまた次の資金調達のサポートを確認したいと思います: NIH/NCI P30 CA030199 がんセンター主催グラント、V 財団とサンディエゴの NCI のがんセンター (C3) #PTC2017to A.J.D.

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A.J.D は、A2A 医薬品 (ニュージャージー)、Salgomed (サンディエゴ) 治療コンサルタントです。他の作家を宣言する競合があります。

本稿では、人間/マウス急性骨髄性白血病細胞 (図 5) でフローサイトメトリーを用いた急性骨髄性白血病細胞株における候補者の遺伝子の役割を調査する競争力のある成長の CRISPR ベース Cas9 アッセイを行うための詳しいプロトコルについて述べる。分析の目的は、中規模で 2、3 週間以上の急性骨髄性白血病細胞の増殖維持に関する遺伝子欠失の影響を識別するためにです。いくつかの重要なステップは説明プロトコルのスケール アップしやすく慎重に従われる必要があります。Cas9 レンチ ウイルスの生産、293 t 細胞の上清を含むウイルスへのキャリー オーバーを避けるために 0.45 μ M のフィルターを通してエアコン ウイルス中にフィルターを適用する必要は。Spinfection 中、spinfection 板パラフィルムやしがみつくの折り返しにより遠心分離中に潜在的な汚染を回避できます。しかし、組織培養のインキュベーターで戻る spinfected プレートを配置する前にラップを削除必要があります。編集効率の Cas9 発現クローンを評価するために非常に重要です。低ゲノム編集効率を...

過去数十年間は、急性骨髄性白血病 (AML) の病因に重要な分子経路の貢献を識別するのに焦点を当てた多くの研究努力を見てきました。伝統的に、急性骨髄性白血病細胞における遺伝子破壊は条件付きノックアウト マウスまたは短いヘアピン RNA (shRNA) を使用して行われています。ノックアウト マウスは、遺伝子欠失の時空間的制御のための洗練されたシステムを提供する間は、手間、時間がかかり、高価なは遺伝子ノックアウト マウスを生成します。さらに、遺伝子のノックアウト再結合戦略を使用して拡張が容易ではないです。これらの戦略は並列で複数の遺伝子の尋問によく自分自身を貸すか。小さい干渉の RNA (siRNA) または shRNA を使用してノック ダウン内因性 Mrna に RNA 干渉法の発見は後の多くのグループ AML の特定の遺伝子の役割を調査する RNA 干渉技術を使用し始めた。マウスとヒトの急性骨髄性白血病細胞は脂質ベースのトランスフェクションを伝統的な方法を使用して transfect に困難なのでほとんど lentivirally 採用、レトロ ウイルスでエンコードされた shRNA 急性骨髄性白血病細胞における遺伝子の機能を研究するための研究します。最近の発見は、定期的に空間の短い回文繰り返し (CRISPR) をクラスター化し、関連付けられた Ca 核酸 (CRISPR Cas9) は遺伝子ターゲティング技術1,2,3に革命をもたらしました。CRISPR Cas9 を使用して、特定の遺伝子やゲノム領域削除、編集またはできますが付いた検索効率と使いやすさ。CRISPR ベース Cas9 遺伝子編集は、シンプルさ、有効性、この技術の幅広い適用性などの多様な細胞型の遺伝子型-表現型の関係を調査するための選択の方法として現れている今。CRISPR ベース Cas9 の方法も急性骨髄性白血病、個々 の遺伝子の尋問だけを目的としたアレイまたはプールされた遺伝的画面に複数の遺伝子を対象とする方法としても可能性として並列にいくつかの遺伝子の調査での選択の方法になっています。アジア ・ マイル リミテッド依存関係4,5,6。
本稿では、安定した CRISPR Cas9 仲介された遺伝子 - に続く編集高スループット フローサイトメトリーに基づく急性骨髄性白血病細胞の成長の遺伝子破壊の影響を測定するための単純な競争力のある成長アッセイをについて説明します。このメソッドは、シンプルで効率的、かつ急性骨髄性白血病細胞における並列にいくつかの遺伝子の役割を調査するため媒体スループット実験にスケーラブルです。

<table><tbody><tr><td>FLAG-M2 抗体</td><td>sigma-aldrich</td><td>F3165, lot # SLBS3530V</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Antibody</td><td>Invitrogen</td><td>31446, lot # TA2514341</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td><td>Thermo Fisher</td><td>34095</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc Imaging System</td><td>BIO RAD</td><td>17001401</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT 遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブラストサイ</td>ジン<td>サーモフィッシャーR21001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYTOXレッド</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーS34859</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>サーモフィッシャー</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー11965-092</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー11875-093</td><td></td></tr>ペ<tr><td>ニシリンストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン (200 mM)</td><td>Thermo Fisher</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>SAFC</td><td>12303C</td><td></td></tr><tr><td>single gRNA vector</td><td>Addgene #67974</td><td>pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2ABFP-W</td><td></td></tr><tr><td>CelLytic 核抽出キット</td><td>sigma-alorich</td><td>NXTRACT</td><td></td></tr><tr><td>XtremeGENE 9</td><td>sigma-alorich</td><td>6365787001</td><td></td></tr><tr><td>レトロネクチン</td><td>タカラ</td><td>T100B</td><td></td></tr><tr><td>フローサイトメーター</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>NEBioLabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ライゲーションバッファー</td><td>NEBioLabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ酵素</td><td>NEBioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>フィッシャー科学</td><td>BP1760-25</td><td></td></tr><tr><td>LB寒天</td><td>フィッシャー科学</td><td>BP9724-500</td><td></td></tr><tr><td>LBブロス</td><td>フィッシャー科学</td><td>BP9731-500</td><td></td></tr><tr><td>キアゲンミニプレップキット</td><td>キアゲン</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop分光光度計</td><td>サーモフィッシャー</td><td>ナノドロップ1つの</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウスIL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウスIL-6</td><td>Peprotech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウス M-CSF</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>安定なコンピテントセル</td><td>NEBiolabs</td><td>C3040I</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 組織培養皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>細胞溶解液</td><td>Qiagen</td><td>158906</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質沈殿液</td><td>Qiagen</td><td>158910</td><td></td></tr><tr><td>DNA水和液</td><td>Qiagen</td><td>158914</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick ゲル抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>BbSI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0539S</td><td></td></tr><tr><td>APEX 2.0x Taq Red Master Mix Kit</td><td>Genessee Scientific</td><td>42-138</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Fisher scientific</td><td>BP2956100</td><td></td></tr><tr><td>50 mL ポリプロピレン コニカルチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>1495949A</td><td></td></tr><tr><td>15 mLポリプロピレンコニカルチューブフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>1495970C</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr ベース cas9 の競争の試金を使用して遺伝的依存関係の調査

Investigation of Genetic Dependencies Using CRISPR-Cas9-based Competition Assays

遺伝子摂動の研究は、急性骨髄性白血病の病因における個別遺伝子の役割を調べるため広く使用されています。これらの研究の多くをした完全な遺伝子破壊を達成するための複雑な遺伝子ノックアウト モデルを使用します。ノックアウト マウスとこれらの研究は、遺伝子型-表現型の関係を調査するためのエレガントで実績のあるシステムを提供しながら候補者の遺伝子を評価するための迅速かつスケーラブルな方法再生急性骨髄性白血病細胞増殖における役割またはアジア ・ マイル リミテッド モデルで生存複数の候補者の遺伝子の並列の尋問を加速するのに役立ちます。ゲノム編集技術の最近の進歩は、前例のない規模で遺伝的摂動を実行する当社の能力を大幅に強化しました。ゲノム編集の 1 つのようなシステムは、ターゲット細胞のゲノムに迅速かつ効果的な変更を加えるに使用することができます CRISPR ベース Cas9 の方法です。使いやすさとスケーラビリティ CRISPR/Cas9 を介した遺伝子削除のそれに 1 つ遺伝子の多数の尋問のための最も魅力的な技術表現型の試金。ここ、CRISPR/Cas9 を介した遺伝子破壊高スループット流れ cytometry による競争の試金と組み合わせてを使用して増殖に重要な役割を果たす可能性があります遺伝子の役割や人間の生存率を調査する簡易測定法を提案し、マウスの急性骨髄性白血病細胞株。

本研究で我々 は最初高力価ウイルス Cas9 ブラストサイジン レンチ ウイルス プラスミドをエンコードと MLL AF9 転座をクマ MOLM13 ヒト急性骨髄性白血病細胞株を導入しました。私たちの手では、一括未整理 MOLM13 Cas9 セル西部にしみが付くことによって高レベル Cas9 式表示されずもしていないメソッドを編集-使用して高効率な遺伝子の場合に、7を前述しました。したがって、我々 は、単一細胞のクローンを確立し、西部しみが付く (図 1) で見られるようにだけ Cas9 の高レベルのクローンを選択に進んだ。我々 は 2 つの異なるクローンを選んだし、説明以前7として AAVS1 セーフ ハーバーの軌跡のサイトをターゲット sgRNAs を導入しました。ピューロマイシンを選択 MOLM13-Cas9-AAVS1 sgRNA から抽出したゲノム DNA を使用してクローン サイトをカット AAVS1 s...

本稿では急性骨髄性白血病 (AML) 細胞増殖で複数の候補者の遺伝子の役割を簡単かつ迅速な捜査のためクラスター化定期的に空間短い回文を繰り返す (CRISPR) CRISPR ベース Cas9 方法を記述します。並列。この手法はスケーラブル、他癌細胞を同様に適用することができます。

CRISPR ベース Cas9 の競争の試金を使用して遺伝的依存関係の調査

Gene perturbation studies have been extensively used to investigate the role of individual genes in AML pathogenesis. For achieving complete gene ...

このビデオでは、フローサイトメトリーベースの競合成長アッセイと組み合わせたCrisper-Cas9システムを使用して、AML内の複数の候補遺伝子を並行して調査する簡単な方法を紹介します。この手法の主な利点は、高速でスケーラブルな点です。手順のデモンストレーションは、私たちの研究室のポストドキュメントであるBo Rui Chenです。ウェブベースのCRISPR設計ソフトウェアは、対象遺伝子用の4〜6つの単一のガイドRNAを設計するために使用されます。まず、フィールドの該当する情報にアスタリスクを入力します。次に、単一ガイドRNA設計用の標的ゲノムを選択します。シーケンスボックスにターゲットシーケンスを貼り付け、送信ボタンをクリックします。所望の単一ガイドRNA発現プラスミドでクローニングする場合、ヌクレオチドCACCをセンスオリオヌクレオチドおよびAAACに逆に無料のアンチセンスオリゴヌクレオチドに付加する。プレミックスセンスとアンチセンスオリゴヌクレオチドは、オリゴミックスとラベル付けされた96ウェルプレートで会社から注文されます。アニーリングプレートとラベル付けされた別のU-Bottom 96ウェルプレートをセットします。T4ポリヌクレオチドキナーゼの1マイクロリットル、10x T4 DNAライゲーションバッファーの1マイクロリットル、および6マイクロリットルの水パーアニーリング反応のマスターミックスを調製する。アニーリングプレートの各ウェルにマスターミックスの8マイクロリットルを加え、続いて2マイクロリットルのプレミックスセンスとアンチセンスオリゴヌクレオチドを加えます。ピペットを2~3回穏やかに混ぜ合わせ、プレートを短く回転させ、ミックスを井戸の底に入れます。PCRマシンでは、次のアニーリングプログラムを使用してください。30分間摂氏37度、摂氏95度を2分30秒、続いて摂氏0.1度/秒の速度で摂氏22度までゆっくりと冷却します。アニーリングが完了したら、水で焼鈍反応1から200までリン酸化およびアニールオリゴヌクレオチドを希釈することにより、希釈オリゴミックスとラベル付けされた新鮮な96ウェルプレートを調製する。1.5マイクログラムのBBS1制限酵素でベクターを5マイクログラム消化し、摂氏37度で適切なバッファーを2時間使用して、単一ガイドRNA発現ベクターを線形化します。次に、ライゲーションプレートとラベル付けされた新鮮な96ウェルプレートを取り、BBS1消化単一ガイドRNA発現ベクターの20ナノグラムを所望の単一ガイドRNAライゲーションあたり1つのウェルに加えます。これに、希釈されたオリゴミックスプレートから2マイクロリットルのリン酸化アニールオリゴヌクレオチドを加える。各ウェルに、10X T4リガーゼバッファーの1マイクロリットル、T4リガーゼ酵素の1マイクロリットルを加え、穏やかにピペットを混合します。プレートを室温で2時間インキュベートします。ライゲーション反応が行われる約10分前に、氷上に化学的に有能な大腸菌細胞の90マイクロリットルを充填する。有能な細胞の10マイクロリットルのアリコートを、個別の96ウェルプレートの各ウェルに個別に移します。有能な細胞を含むウェルにライゲーション混合物を加える。ピペットを上下に軽くし、室温で10分間インキュベートします。各変質反応から直接6ウェルプレートのウェルに混合する細菌DNAのピペット5マイクロリットルは、アンピシリンのミリリットル当たり100ミリグラムのLB寒天を含む。各ウェルに約5〜8個のガラスビーズを加え、6ウェルプレートを8~10回円運動で振ります。一晩で摂氏37度でプレートをインキュベートします。翌日、各井戸から1〜2つの単一のコロニーを選び、無菌20マイクロリットルピペットチップを付け、無菌10センチメートルのシャーレのラベル付きスポットにストリークし、LBプレートにストリークした後、アンピシリン1ミリリットルあたり100ミリグラム、先端を14ミリリットルの底管で3ミリリットルに排出します。、対応する細菌クローン番号でマークされます。細菌プレートは、サンガーシーケンシングのために直接送信されます。クローン化された単一ガイドRNAの配列確認後、メーカーの指示に従ってミニプレップキットを使用して、対応する14ミリリットルチューブからDNAを精製する。単一ガイドRNAレンチウイルス粒子は、テキストプロトコルに記載されているように、96ウェル形式で生成される。そして、ウイルス上清はすぐにマイナス80°Cで凍結されます。AML Cas9細胞における単一ガイドRNAの導入の1日前に、平底非組織培養処理96ウェルプレートをコーティングし、1ミリリットル当たり10マイクログラムの濃度で組み換えヒトフィブロネクチン断片を100ミリリットル塗布する。蒸発損失を避けるために、しがみつくラップでプレートを包み、一晩ベンチに置いておきます。翌日、96ウェルプレートの各ウェルから組換えヒトフィブロネクチン断片を除去する。各単一ガイドRNAのウイルス上清を室温で解凍する。各チューブから、トランスダクションプレートの各被覆ウェルに50マイクロリットルのウイルス上清を加えます。遠心分離時の潜在的な汚染を避けるために、プレートをしがみつくラップで包みます。1、300回で90分間摂氏35度でプレートを回転させます。スプ感染の終わりに向かって、培養フラスコからB3細胞を発現する高Cas9を数える。カウント後、必要なセル数をスピンダウンし、新鮮な培地で再中断します。90分のスプ感染後、プレートを傾けてすべてのウェルから上清をゆっくりと除去するために50マイクロリットルに調整したマルチチャンネルピペットを使用してください。クローンB3細胞の培養液を100マイクロリットルずつゆっくりと各ウェルに加え、リムから滑り落ちる。セルが底に落ち着くようにするために、摂氏35度で1、300倍gでプレートを回転させます。プレートを摂氏37度の組織培養グレードインキュベーターに移します。翌日、1つのガイドRNA導入細胞を含む各ウェルに100マイクロリットルの新鮮な培地を加え、最終的な培地容量が200マイクロリットルになるようにします。プレートをインキュベーターに戻します。72時間後の伝達は、フローサイトメトリーにより各ウェルにBFP陽性細胞を含む単一ガイドRNAの割合を確認する。細胞生存率染料を使用して、死んだ細胞を解析からマークおよび除外します。アッセイ中の過剰増殖を避けるために、すべての事実分析の後、新鮮な媒体で新しい井戸に細胞の割合を再めっきし続けます。2~3日ごとに、事実分析を繰り返し、BFP陰性細胞と比較したBFP陽性細胞の相対的割合をチェックする。事実分析ソフトウェアを使用して、各時点のBFP陽性セルの割合を分析します。競合的な増殖アッセイの成功の鍵は、最終的な生細胞数が正確であることを確認するために適切な格言技術を使用することです。各サンプルのFCSファイルをソフトウェアにドラッグします。いずれかのサンプル ファイルをダブルクリックし、X 軸に前方散布図、y 軸に横散布図を使用して、前方散布図と横散布図をプロットします。すべてのセルをゲートします。ゲートセルをダブルクリックし、y軸と前方散乱高さまたは面積ドットプロットに生存率染色をプロットします。生存率染色負の細胞をゲートします。ゲート付きのライブ セルをダブルクリックし、X 軸上の Y 軸と前方散布図に BFP をプロットします。BFP陽性細胞をゲートします。グループ タブの下のすべてのサンプルに選択したサンプルをドラッグして、すべてのゲートをすべてのサンプルに適用します。テーブルエディタをクリックして、すべてのサンプルの分析テーブルを作成します。BFP 正数を 1 つのサンプルから表にドラッグし、テーブルエディタの表示ボタンをクリックして、BFP 陽性セルの割合を表に表示して、すべてのサンプルのバッチレポートを作成します。テーブルを Excel ファイルとして保存します。このシステムは、ヒトおよびマウスAML細胞株の増殖または生存に役割を果たす可能性のある遺伝子の役割を調べるのに使用された。2つの別々の単一ガイドRNAを有するAAVS1セーフハーバー軌跡を標的にしてもヒトMOM13 Cas9細胞の増殖に影響を及ぼさなかった対照的に、DNA複製関連遺伝子RPA3が標的化された場合、BFPネガティブな未伝達の対応物と比較してBFP陽性細胞の割合が進行的かつ有意に低下することが観察された。同様に、エピジェネティックレギュレータであるDot1lを標的とする単一ガイドRNAと、眼色素沈着遺伝子であるロドプシンの効果を、マウスMLL-AF9 Cas9細胞で試験した。Dot1lを標的とした単一ガイドRNAは、ロドプシンを標的とする単一ガイドRNAとは対照的に、競争増殖の劇的かつ進歩的な減少を示した。これらの結果は、大量白血病細胞をDot1l枯渇に発現するMLL-AF9の脆弱性を示し、以前に発表された結果を確認した。遺伝子当たり4〜6個のガイドRNAを仮定すると、この方法は少なくとも16〜24個の遺伝子を並行して検査するのに適しており、また、任意の癌細胞株における遺伝子の依存性をテストするために適用することができる。AML細胞で試験する必要がある分子経路全体など、より多くの遺伝子の場合、プールCRISPR-Cas9ベースのスクリーンがより有用であろう。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

ここで説明したジェノタイピング技術、キャピラリーゲル電気泳動に結合する蛍光ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトクローンのハイスループット遺伝子型決定を可能にします。これは、他の遺伝子型判定技術が直面している制限を回避し、配列決定法よりも費用対効果の高いです。...

ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました

このプロトコルは哺乳類細胞における点突然変異の修復システムを編集 CRISPR/Cas9 ベースの遺伝子のワークフローについて説明します。ここで、ターゲット ・ サイトで塩基形成測定の詳細な後続実験的戦略と遺伝子編集へのコンビナトリアル...

点突然変異修復 CRISPR/Cas9 とひと細胞での SsODN によって触媒の機能として敷地内変異原性を調べるための標準方法論

ここでは、CRISPR Cas9 ribonucleoproteins と相同性依存修理テンプレートを使用して線虫のゲノム エンジニア...

迅速かつ安易なパイプラインを生成する突然変異点ゲノムにc. の elegansを用いた CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR-Cas9技術は、あらゆる細胞型の哺乳類ゲノムを正確に編集する効率的な方法を提供し、ゲノム全体の遺伝スクリーンを実行する新しい手段を表します。プールされたゲノム全体のCRISPR-Cas9スクリーンのパフォーマンスを成功させるには必要な手順を説明する詳細なプロトコルをここで提供します。...

哺乳類細胞におけるCRISPRベースの遺伝子スクリーンのプール

組み立て済みのCas9/ガイドRNAリボヌクレオタンパク質複合体の直接送達は、血行細胞におけるゲノム編集のための迅速かつ効率的な手段である。ここでは、このアプローチを用いてRUNX1イントロニックサイレンサーを削除し、OCI-AML3白血病細胞における転写応答を調べる。...

急性骨髄性白血病細胞におけるCRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質によるRUNX1イントロニックサイレンサーの転写役割の調査

ここでは、低分子Shield-1の下で定期的に間隔を合わせた短いパリンドローム反復(CRISPR-)関連タンパク質9(Cas9)の時間的および条件付き安定化に基づくゲノム編集ツールについて説明する。この方法は、培養細胞および動物モデルに使用することができる。...

条件Cas9安定化を用いた遺伝子機能評価のための新しいツールキット

本稿では、細胞外受容体とリガンドの相互作用を同定するためのゲノムスケール細胞ベースのスクリーニングアプローチについて述べる。...

ゲノムスケールCRISPR/Cas9遺伝子スクリーンを用いた細胞表面受容体同定

このプロトコルの目的は、組み立てられたリボヌクレオタンパク質複合体とスクリーニングのためのdpy-10コクリスピーマーカーを使用して、C.エレガンスゲノムのシームレスなCRISPR /...

CRISPR/Cas9 dpy-10 Co-CRISPRスクリーニングマーカーと組み立てられたリボヌクレオプロテイン複合体を用いたC.エレガンスrbm-3.2遺伝子の編集。

初期の開発は母性遺伝製品に依存しており、これらの製品の多くの役割は現在不明です。ここでは、CRISPR-Cas9を使用して、単一世代で母性効果表現型を特定するプロトコルについて説明しました。...

母体クリスパントによる初期発生における母体発現遺伝子の役割の決定

CRISPRのような技術に対する大きな障壁は、重要な遺伝子を破壊する可能性のあるオフターゲットイベントです。「Circularization for In Vitro Reporting of Cleavage Effects by...

オフターゲット遺伝子編集の検討のためのCIRCLE-Seq

ゲノムワイドなCRISPR/Cas9スクリーニング法の適用により、放射線耐性および感受性遺伝子を選択するために、細心の注意を払った構造化されたアプローチが与えられています。このプロトコルは、臨床投与された化学薬品に対する耐性のメカニズムを調査する他の研究努力のための汎用性の高いフレームワークとしても役立つ可能性を秘めています。...

放射線感受性および放射線耐性遺伝子を明らかにするためのゲノムワイドCRISPRスクリーニング

学ぶCRISPR-Cas9競争的増殖アッセイを用いて、急性骨髄性白血病細胞における複数遺伝子の機能を並列に調査する方法。この技術は迅速かつスケーラブルで、他のがん細胞系への応用も可能である。

CRISPR ベース Cas9 の競争の試金を使用して遺伝的依存関係の調査

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