Name: 多重蛍光免疫組織化学染色、イメージング、およびリンパ腫の組織学的試料中の分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
Description: 学ぶ多重蛍光免疫組織化学染色法でリンパ腫組織中の複数がん関連抗原を同時検出し、抗原共発現と空間的関係を定量的に解析する手法を習得できます。

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S. B.N. と A.D.J. は、シンガポール保健省国立医療研究評議会移行賞 (ナノ材研/TA/0020/2013 とナノ材研/TA/0052/2016) でサポートされます。著者は、ベクトラ スペクトル イメージング顕微鏡の購入に向けてシンガポールの国民大学癌研究所から A.D.J. に容 Siew 尹研究助成を認めます。本研究はシンガポール NHG ドメイン特定のレビュー ボード B によって承認されて (2014/00693)。

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A.D.J. は、ユーザー グループのミーティングに旅行に向けてパーキンエルマー社から資金を受けています。著者はあるその他利益相反を開示します。

mf IHC 病理リンパ病理学における diagnosticcriteria を修正し、臨床転帰の予測に向けた特定の細胞型におけるバイオ マーカーの役割を分析するを有効にする可能性があります。新しい研究方法としては、mf IHC ますます腫瘍細胞17の複数の免疫パラメーターの定量的および空間同定に適用されます。腫瘍マーカーの共発現の mf IHC の検出は、再現性と信頼性の高い5に示されています。しかし、初期と試薬およびティッシュの固定および処理の矛盾によるものなど、組織関連の要因から生じる変動を受ける技術のまま。
技術に重要な固有、よく検証された抗体の使用を区別する、および再現可能な結果を与える。最初の抗原のために特定する説明し、後でノックアウト モデル14を使用して無関係なタンパク質を認識する抗体の文献に例があります。どの野生型のノックアウト/ノックダウン検証メソッドまたはノックアウトか siRNA や CRISPR メソッドによってノ...

リンパ系腫瘍はリンパ球の無秩序の悪性増殖によって引き起こされます。これらの細胞は、免疫システムの重要なコンポーネントし、骨髄、リンパ節、脾臓、その他粘膜関連リンパ系など、プライマリとセカンダリの免疫臓器にローカライズします。リンパ腫瘍は、機能、形態、イムノフェノ タイプ、遺伝的特徴、臨床症状などの星座に基づいて分類される無秩序の異質グループです。各パラメーターは、役割を果たしている、リネージュ定義の特徴のまま、B 細胞、T 細胞および自然なキラー (NK) 細胞1から派生した腫瘍を認識する WHO 分類体系のための基礎を形作る。
リンパ腫の分類にキーは、白血球リンパ球2のさまざまなサブタイプの表面マーカーに対する抗体の評価をされています。免疫組織染色 (IHC) は伝統的にそのようなマーカーの分析のために使用されているし、顕微鏡的に視覚化できる細胞・組織ベースの分子を検出する抗体抗原認識の原則に基づいて3ですしかし、従来明視野発色多重 IHC によって 1 枚のスライドに複数のターゲットの同定、制限単一ティッシュ セクションで複数の色信号を確実に区別するために困難なことが多いため、特に。非常に低い式4抗原の視感評価と染色の定量化は、主観的、分析およびデータ解釈5の変動を引き起こすことができます。
そのため、ホルマリン固定のパラフィン埋め込まれた (FFPE) サンプルに従来の IHC はリンパ腫のような多様な免疫学的疾患の複数のターゲットを同時検出するため不可能です。さらに、周囲の免疫細胞から腫瘍性リンパ球を区別する正確ではありません多くの場合です。これはリンパ腫における新規バイオ マーカーの関連性を見て研究を妨げています。多重蛍光 IHC (mf IHC) をこのコンテキストではそれにより抗原共発現の定量的評価と限定を節約しながら、精度の高い空間的な関係のサンプル6,に有望な代替手段を提供しています7.このイメージング技術は、デジタル画像解析ソフトウェアと提携して、データ解釈はさらに効率的、腫瘍微小環境の不均一性8,9の研究が容易になります。このプロトコルの多重化通信方式パスチラミドシグナル ベースの蛍光 (IF) 信号を増幅するのに適用され、あらゆるホスト種であっても同じ種5,7の開発から IHC 検証抗体と互換性のあります。,10. パスチラミドシグナル ベースのプロトコルは、興味のティッシュに fluorophore の直接接合複数汚れの逐次適用を可能にする、各ステップの後、一次および二次抗体を取り除くことができますので、なし抗体の交差反応します。
多重化された戦略は、ターゲットとリンパ腫におけるバリアント免疫学的パターンを特定することにより予後の治療成績を予測するため役に立つでしょう。多重蛍光 IHC の T および B リンパ球のマーカーと T 濾胞ヘルパー T 細胞血管免疫芽球性リンパ腫 (AITL)、マーカー パネルの調査のため研究室に適用されている積極的なによって臨床的に特徴づけられる末梢性 T 細胞リンパ腫のサブタイプ行動と腫瘍の不均一性の11。このメソッドの有用性を示したびまん性大 B 細胞リンパ腫 (DLBCL)、ブルートンのチロシンキナーゼ阻害の潜在的な治療上の使用を示唆している同時 C-MYC と BCL 2 式と B 細胞受容体の信号を増加しました。12. 
ここで適切な管理組織の選択に抗体検証から全体のプロトコルについて述べるし、リンパ腫 FFPE を用いた多重スキャンを使用して染色スライドの最終的な分析と組織自動定量病理学画像システム。

<table><tbody><tr><td>抗体希釈液</td><td>DAKO</td><td>REF S3022</td><td>ブロッキング</td></tr><tr><td>ペルオキシダーゼブロッキングソリューション</td><td>DAKO</td><td>S2023</td><td>過酸化物ブロッキング用</td></tr><tr><td>ベクトラマルチスペクトル自動顕微鏡</td><td>パーキンエルマー</td><td>ベクトラ2.0.8</td><td>スペクトルイメージング</td></tr><tr><td>絶対 エタノール</td><td>EMSURE</td><td>1.00983.2500</td><td>水分補給用エチルアルコール</td></tr><tr><td>増幅希釈剤</td><td>PERKIN ELMER</td><td>FP1135</td><td>蛍光色素希釈バッファー</td></tr><tr><td>抗マウスIgG [ヤギ] HRP標識</td><td>PERKIN ELMER</td><td>NEF822001EA</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>抗ウサギIgG [ヤギ] HRP標識</td><td>PERKIN ELMER</td><td>NEF812001EA</td><td>二次抗体</td></tr><tr><td>BCL2</td><td>DAKO</td><td>クローン 124 ( Lot No. 20031561)(RRID-AB578693)</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>BCL6</td><td>ライカ</td><td>NCL-L-Bcl6-564(Lot No.6050438)(RRID-AB563429)</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>CD20</td><td>DAKO</td><td>Clone L26 (Lot No.20028627) (RRID-AB442055)</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>c-MYC</td><td>ABCAM</td><td>Y 69 clone ab32072 (Lot No.GR29511133)(RRID-AB731658)</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>Cy 5</td><td>PERKIN ELMER</td><td>FP1171</td><td>適切なチラミド系蛍光試薬</td></tr><tr><td>Graphpad Prism 7</td><td>Graph pad</td><td></td><td>統計ソフトウェア</td></tr><tr><td>HistoClear クリアリング剤</td><td>SIGMA</td><td>H2779-1L</td><td>脱ロウ・クリアリング用Histoclear</td></tr><tr><td>inForm Advanced 画像解析ソフトウェア</td><td>パーキン・エルマー</td><td>インフォームソフト 2.2.1</td><td>データ解析ソフト</td></tr><tr><td>KI67</td><td>DAKO</td><td>Clone MIB-1 (Lot No.20040401) (RRID-AB2314699)</td><td>一次抗体</td></tr><tr><td>KOS MILESTONE 多機能組織処理装置</td><td>Milestone</td><td>熱誘起エピトープ検索用マイクロ</td><td></td>波</tr><tr><td></td><td>パナソニック</td><td>NN-ST651M</td><td>マイクロ波ストリッピング</td></tr><tr><td>Mowiol</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>81381 Aldrichモヴィオル&reg;4-88</td><td>封入剤</td></tr><tr><td>オパール 570</td><td>パーキン エルマー</td><td>FP1488</td><td>適切なチラミドベースの蛍光試薬</td></tr><tr><td>オパール520</td><td>パーキン エルマー</td><td>FP1487B21</td><td>適切なチラミドベースの蛍光試薬</td></tr><tr><td>オパール540</td><td>パーキンエルマー</td><td>FP1494</td><td>適切なチラミドベースの蛍光試薬</td></tr><tr><td>オパール620</td><td>パーキンエルマー</td><td>FP1495</td><td>適切なチラミドベースの蛍光試薬</td></tr><tr><td>ポリ-L-リジンコーティングスライド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>120-550-15</td><td>ルーチン組織学的使用における組織切片接着用スライド</td></tr><tr><td>スペクトル</td><td>DAPI PERKIN ELMER</td><td>FP1490</td><td>核酸染色</td></tr><tr><td>ターゲット検索液、pH9.0(10x)</td><td>DAKO</td><td>S2367</td><td>HIER</td></tr><tr><td>用 トリスバッファー生理食塩水 (TBS)</td><td>1st BASE</td><td>BUF3030 20X4L</td> バッファー<td>用ウォッシュ</td></tr><tr><td>トゥイーン20</td>シ<td>グマアルドリッチ</td><td>P1379-1L</td><td>トゥイーン</td></tr></tbody></table>

多重蛍光免疫組織化学染色、イメージング、およびリンパ腫の組織学的試料中の分析

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining, Imaging, and Analysis in Histological Samples of Lymphoma

光学顕微鏡によるタンパク質発現の場分析のため免疫組織化学 (IHC) メソッドは、研究および診断目的の両方のための強力なツールです。しかし、可視化と従来の発色 IHC を使用して単一のティッシュ セクションで複数の抗原の定量化は困難です。多重化されたイメージングでは特に関連リンパ腫研究、診断、マーカーが複雑な腫瘍微小環境のコンテキストで解釈しなければなりません。ここで多重蛍光 IHC 染色リンパ腫への関心の特定の細胞型の複数のターゲットの定量的評価を有効にするためのプロトコルについて述べる。メソッドは、側面をカバーして抗体検証、抗体最適化、リンパ腫サブタイプのマーカーと多重最適化、組織マイクロ アレイ (TMA) スライドとスライドのスキャンの染色続いて特定のデータ解析リンパ腫を参照します。このメソッドを使用すると、両方の平均強度の関心と割合の陽性マーカーのスコアがさらに定量的な解析が容易に生成されます。多重サンプルの使用率を最小限に抑え、各マーカーに関心のある情報空間を提供します。

mf IHC C-MYC と BCL2 遺伝子転位 (ダブル ヒット リンパ腫) DLBCL サンプル画像は、図 1のとおりです。図 2は、シミュレートされた明るいフィールド免疫組織学的イメージを示しています。図 3は、パーセント データの生成を示します。図 4には、数値データの生成のための中央値式の詳細が表示されます。図 5は、血管免疫芽球 T 細胞リンパ腫における T 細胞パネルの mf IHC のアプリケーションを示します。図 6は、へんとう腺コントロールのサンプルとこのサンプルのデータ分析の最適化画像を示しています。
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ここで多重蛍光免疫組織染色とリンパ腫における複数のがん関連抗原の同時定位のためのイメージング プロトコルについて述べる。このプロトコルは、すべての組織切片内バイオ マーカーの共局在解析に拡張できます。

Immunohistochemical (IHC) methods for the in-situ analysis of protein expression by light microscopy are a powerful tool for both research and diagnostic ...

リンパ腫は組織学的に複雑な腫瘍である。したがって、多重化蛍光免疫組織化学は、従来の発癌性免疫組織化学よりも、腫瘍細胞および微小環境における関心のマーカーを研究する利点を提供する。この技術は、腫瘍微小環境の複雑さのために歴史的に困難であった組織学的リンパ腫サンプルにおける抗体ベース染色のスコアリングを標準化する可能性を有する。具体的には、多重化蛍光免疫体化学およびスペクトルイメージングにより、1枚のスライド内で複数の染色の定量的測定が可能となり、臨床物質内における抗原の共発現およびスペシャス関係の評価が可能となる。まず、脱ワックスおよび水分補給スライドをマイクロ波保存ガラス瓶の標準的な抗原検索バッファに浸漬し、適切なマイクロ波で熱誘導エピトープ検索を行います。最終マルチプレックス配列における抗体の位置に基づいてマイクロ波ストリッピングの追加ラウンドを行います。例えば、第4抗体は、染色前にマイクロ波ストリッピングの3ラウンドを追加する必要があります。ストリッピングプロセスが完了した後、鉗子と耐熱手袋を使用して、スライドを室温で蒸留水に移し、少なくとも10分間冷却します。抗原回収液が冷却されたら、市販のペルオキシダーゼブロックで組織ペルオキシダーゼ活性を10分間遮断し、続いてトリス緩衝生理食物、またはTBS、および非イオン性洗剤で5分間洗浄する。ブロッキングバッファーでの10分間のインキュベーションを行い、その後室温で目的とする一次抗体を30分間インキュベーションし、TBS-Dバッファーで5分間3回の洗剤を行い、非特異的染色をブロックします。次に、サンプルを適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ共役二次抗体を室温で15分間インキュベートし、続いてTBS-Dバッファーに3回の洗剤を加えます。最後の洗浄後、適切なチラミドベースの蛍光試薬をスライドに適用し、室温で5分間インキュベーションし、その後に3回の5分間のTBS-D洗浄を行います。新しい抗原検索溶液中の一次抗体および二次抗体を除去するために、マイクロ波ベースの追加ストリッピングを実行します。取り出しの最後に、蒸留水でスライドを冷却し、ラボワイプでティッシュなしでスライド上の領域を乾燥させます。室温で10分間ダッピーでスライドをインキュベートし、その後3回のTBS-D洗い物をします。次に、組織に接触することなくラボワイプでスライドを慎重に乾燥させ、イメージング用の適切な取り付け媒体でサンプルを取り付けます。モノプレックススライドスキャンの場合、サンプルの標識に使用するフルオロフォアから適切なフィルタを選択し、各マーカーとそれに対応する蛍光チャネルを調べて、クリーンなシグナルを得るための適切な露出時間を特定し、マーカーに対して最も強いシグナルを持つべき組織成分に焦点を当てます。ピクセルの強度をクロスサンプルで比較できるようにするには、ライブカメラの設定を使用して、ライブカメラの画像に露出超過の領域がなくなるまで、個々のチャンネルの露出時間を調整します。すべてのスライドをスキャンしたら、シミュレートされた明視野画像を取得して、通常の免疫組織化学的パターンと視覚的に比較し、染色パターンが正しいかどうかを判断します。組織マイクロアレイスライドをスキャンするには、画像システムで組織マイクロアレイスキャンモードと適切なオートフォーカスアルゴリズムを使用します。組織セクション全体のスライドについては、最も代表的な腫瘍領域から最適な画像を選択するために、修飾された病理学者によってレビューされたスライドを持っています。分析を開始する前に、腫瘍マーカーを選択して、分析対象の細胞を特定します。病理学者に画像を確認してもらい、組織のセグメンテーションが必要かどうかを判断します。必要に応じて、セグメンテーション用の適切な制御領域を選択し、画像解析ソフトウェアでそのような領域を正しく識別できるかどうかを確認します。細胞セグメンテーションの後、病理学者にセグメンテーションマップをレビューし、意図したセグメンテーションアプローチの忠実性を確認し、個々の画像を確認して、細胞セグメンテーションが適切であるかどうか、または腫瘍細胞、ストロマ、および壊死のために富む領域を選択するために追加の組織セグメンテーションが必要かどうかを判断します。次に、各マーカーの光学強度正カットオフ値を病理学者と組み合わせて決定し、適切な統計ソフトウェアプログラムでヒストグラムを生成し、細胞あたりのマーカー強度の周波数分布を解析する。定義済みのセル内の特定のマーカーのパーセンテージデータを生成するには、データシートにピボット テーブルを挿入し、[合計] を選択して、対象の 1 つのマーカーの陽性率を計算します。マーカーの正のセルの総数を合計数で割った値を計算します。結果は、1 つのコアまたは 1 つのスタディ番号を持つマーカーの正のセルの割合です。数値データを生成するには、サンプル内のすべての細胞研究における対象の各マーカーの平均強度を取得し、各コアまたは研究番号の各マーカーの中央値の正規化されたカウントを抽出します。ここで、c-MYCおよびBCL2遺伝子再構成を伴う拡散性大細胞B細胞リンパ腫試料に対する代表的な多重蛍光免疫体細胞化学的画像が示されている。シミュレートされた明視野免疫組織化学画像は、同様の腫瘍マーカー染色パターンを示す。血管免疫芽細胞性T細胞リンパ腫におけるT細胞パネルへの多重蛍光免疫組織化学画像の適用により、腫瘍試料の細胞不均一性が明らかになる。ここでは、扁桃腺制御試料の最適化と結果データ分析を示す。腫瘍細胞および腫瘍微小環境におけるマーカー発現および局在化を定量化するために、アンミックスステップの後に様々な画像解析ソフトウェアプログラムを使用することができる。この技術は、研究者がリンパ腫の単一組織セクションで特定の細胞型内の複数のマーカーの共同発現を研究する道を開きます。マイクロウェーブステップ中に熱による損傷を防ぎ、デッキで行われるスキャンステップ中の落下リスクに注意してください。

multiplexed-fluorescent-immunohistochemical-staining-imaging-analysis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

免疫組織化学は、タンパク質の局在と組織内での発現を評価するための強力な実験室技術です。現在の半自動定量法は主観性を招き、再現性のない結果をもたらすことがよくあります。ここでは、マルチスペクトルイメージングを用いたマルチプレックス免疫組織化学の方法と、タンパク質の発現と共局在の客観的定量方法について説明します。...

多重化された免疫組織化学染色およびマルチスペクトルイメージングを用いたタンパク質発現と共局在の定量

ホルマリン固定癌組織標本の腫瘍免疫研究の自動多重蛍光パネル

多重蛍光免疫組織化学は、無傷のホルマリン固定、パラフィン埋め込み(FFPE)組織内の複数の細胞タイプの可視化を可能にする新しい技術です。抗体と試薬を最適化し、スライドを準備し、一般的な問題を回避するためのヒントを準備するための指示を持つ7色多重を成功させるためのガイドラインを提示します。...

手動多重蛍光免疫組織化学における最適化、設計、および落とし穴の回避

ここでは、ホルマリン固定パラフィン埋め込み腫瘍組織切片における免疫細胞の可視化、定量、およびマッピングのための簡単でアクセス可能な戦略について述べている。この方法論は、既存のイメージングおよびデジタル解析技術と、イメージングアッセイの多重化能力と多パラメータ分析を拡大することを目的と組み合わせたものです。...

腫瘍微小環境における免疫細胞集団の可視化、定量化、およびマッピング

凍結組織に対してマルチスペクトルイメージングを行う迅速な染色法について述べます。...

凍結組織切片の多スペクトル蛍光イメージングの迅速な方法

多重バーコード画像解析により、最近、腫瘍微小環境の特性評価が改善され、細胞組成、機能状態、および細胞間相互作用の包括的な研究が可能になりました。本明細書では、高次元画像解析技術の使用を可能にする、オリゴヌクレオチド結合抗体およびサイクルイメージングのバーコードを用いた染色およびイメージングプロトコルについて説明する。...

パラフィン組織サンプルの単一細胞分析における免疫プロファイリングと空間マッピングの特性評価のための多重バーコード画像解析(英語)

本稿では、チラミドシグナル増幅(TSA)マルチプレックス免疫蛍光法(mIF)と画像解析および空間解析を組み合わせたプロトコルについて説明します。このプロトコルは、実験室で利用可能なスライドスキャナーに応じて、スライドごとに2〜6個の抗原を染色するために、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)セクションで使用できます。...

腫瘍微小環境の臨床的および生物学的評価のための空間画像解析と組み合わせたマルチプレックス免疫蛍光法

このプロトコルは、マルチプレックス免疫組織化学を用いた腫瘍微小環境の免疫細胞特性評価がどのように行われるかを詳細に説明しています。...

腫瘍微小環境の空間免疫細胞ランドスケープのマルチプレックス免疫組織化学的解析

この実験プロトコルは、主にシングルチャネル抗体のインキュベーション条件を最適化し、抗体とチャネルの設定を調整して、臨床起源の肺癌組織における自家蛍光およびチャネルクロストークの問題を解決することにより、マルチプレックス免疫組織化学(IHC)染色法を説明および最適化します。...

パラフィン包埋肺癌組織のマルチプレックス免疫組織化学染色

マルチプレックスサイクリック免疫組織化学は、抗原抗体のインキュベーション、画像スキャン、画像のアライメントと統合を繰り返すことで、複数のマーカーを同時にin situ...

マルチプレックスサイクリック蛍光免疫組織化学

このレポートでは、自動スライドステーナーでのマルチプレックス免疫蛍光(mIF)アッセイの自動化プロトコルについて説明します。これは、標準的なハイスループット組織オートステイナーおよびホールスライド蛍光イメージャーでの空間プロテオミクスの高い再現性を実証しており、トランスレーショナルリサーチにおける多数の組織スライドにわたるカスタムmIFアッセイに最適です。...

トランスレーショナルリサーチのためのハイスループット自動マルチプレックス免疫蛍光アッセイ(英語)

学ぶ多重蛍光免疫組織化学染色法でリンパ腫組織中の複数がん関連抗原を同時検出し、抗原共発現と空間的関係を定量的に解析する手法を習得できます。

多重蛍光免疫組織化学染色、イメージング、およびリンパ腫の組織学的試料中の分析

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