Name: 決定の 3 末端と HIV-1 の間に初期の一本鎖のウイルス DNA 分子のシーケンスを逆に感染細胞における転写 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 7 s
Description: 学ぶHIV-1感染細胞における一本鎖ウイルスDNAの3'末端マッピング法。ハイブリッドキャプチャーとディープシーケンスを用いて、逆転写産物の精密解析と宿主因子の作用機序を明らかにする。

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著者・ マリム研究所、ルイス アポロニア、Jernej Ule とレベッカ Oakey のメンバーのサポートを認めます。著者に感謝キングス カレッジ ロンドンのゲノム センターでマット アルノとデビー ヒューズ大学大学ロンドン (UCL) で、研究所神経次世代シーケンス処理施設は、MiSeq シーケンスのヘルプが実行されます。付与契約の下での作業、英国医学研究評議会 (G1000196 ・氏/M001199/1 MM に)、Wellcome の信頼 (106223/Z、14、Z MM の ~)、欧州委員会の第 7 フレームワーク プログラム (FP7/2007-2013) 支えられないです。(懲戒パネル) に PIIF-ジョージア州 2012-329679 と、保健省経由で男のと聖トマス NHS 財団保健管理センター総合医研究賞、国立衛生研究所キングス ・ カレッジ ・ ロンドンとキングとの提携で信頼大学病院 NHS の基礎信頼。

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著者は、開示するものがあることを宣言します。

高速、信頼性、およびコスト効率の高いディープ シーケンスのシーケンスに基づく分析の偉大な深さを許可する生命科学の分野での多くの側面をもたらしました。残りの課題は、革新的なデザイン、代表者の作成シーケンス ライブラリをあります。ここで初期のウイルス cDNA 分子、特に HIV-1 の逆のトランスクリプション プロセスの中間体をキャプチャするプロトコルについて述べる。
この戦略の最も重要なステップは、定量的かつ公平な方法、オープン 3'-テルミニ駅までのアダプターの ligation。両方の間の 2 つの ssDNA テルミニ間および効率、- と分子内、調査し、様々 なアプリケーション11,26,27,28,29用に最適化されています。手順 3.3 で説明した条件の下で T4 DNA リガーゼとヘアピンのアダプターを使用しての選択は異なるリガーゼ、アダプターとを表す総合的なオリゴヌクレオチド ligation 用試薬を行った実証の最適化の結果HIV-1 シーケンス (データは示されていない) (表 2)。生体外のテスト、これらの反応を確認した T4 DNA リガーゼがヘアピンのアダプターの ligation を介した國らによる記述で.11、非常に低いバイアスがあり過剰でアダプターを使用する場合、アクセプター分子の完全な結紮近く実現します。ライゲーション効率が多重プライマー システムの互換性のあるアダプターをレンダリングする塩基の添加による影響を受ける (図 4を参照)。比較では、ことがわかった、耐熱性 5' DNA ・ RNA リガーゼ (「リガーゼ」、参照テーブルの材料に比べて正確なリガーゼの)、は、設計された RNA リガーゼの一部開発された受容体とライゲーション効率を改善するには27、RNA リガーゼ (「リガーゼ B」) がある重要なバイアスは、オリゴヌクレオチドを単一塩基長の違い [表 2 間もライゲーション効率の強い相違よりも、2 つの一本鎖 Dna 分子を縛ることで確かに効果的であった;G (a) と (b) 半ば詐欺 HTP]。さらに、"リガーゼ C"、無作為に選ばれた 5' 末端を運ぶアダプター併用で最小限のバイアスのみで反応である (戦略"リガーゼ C"の知られているヌクレオチド バイアスをオフセットするために使用; たとえば鼎らを参照してください。30). ただし、"リガーゼ C"-仲介された分子間を完了、T4 DNA リガーゼ システムに優れた選択をレンダリングしていなかった。
プロトコルのコースと正と負のコントロールを含めることにいくつかの品質管理手順アッセイ継続する前に潜在的な問題の検出および努力のトラブルシューティングのためのガイダンスを提供できます。QPCR 数量 2.2.2 と 2.3.12 の手順では、入力素材の量が十分であることを確認します。約 10,000 に 30万個 μ L から 200 μ L (ステップ 2.1) からの溶出範囲で典型的な cDNA コピー数。ハイブリッド キャプチャ ステップことができます全体的な HIV-1 のいくつかが失われる cDNA 数量 HIV 1 cDNA の強い濃縮によって濃縮の前後にゲノム DNA を定量化する適切なプライマーを使用して定めることができる細胞の DNA にありますが、qPCR または DNA 濃度の測定によって。回復の HIV-1 cDNA ハイブリッド キャプチャ手順を実行した後は、入力の少なくとも 10% をする必要があります。開始材料低可能性があります成功したオリゴヌクレオチド肯定的な制御を説明するそれ以外の場合 (手順 3.3.2 参照) しますが、限られたサンプルでの読み取り。低は、MiSeq アダプターなし無関係 DNA 種の存在のためのライブラリ濃度の過大評価で説明できるは、全体の数字もお読みください。これは低クラスター密度になるし、蛍光アッセイによって合計の DNA 量に加えて qPCR によるライブラリ内の HIV-1 シーケンスの濃度を決定することで改善できます。メソッドの非常に敏感な性質のため特別な注意が必要 (特に、高濃度コントロール オリゴヌクレオチド株式) からでなく、実験装置からの他のサンプルの両方からも低レベルの汚染を避けるために。PCR のワークステーションを殺菌紫外線での作業この点で有益です。最後のライブラリ (ステップ 6.1.2) の自動ゲル電気泳動は、さらに品質管理指標です。通常観察核酸サイズ範囲は 150 に 500 nt プライマー PCR 後浄化 (ステップ 5.2 の注を参照してください) 今欠席すべき前に、オプションのコントロールで検出可能です。代表的な結果でサンプル強度曲線のピークは約 160 に 170 nt と 2 番目のシャープ ピーク約 320 に 350 nt。これはおそらく比較的短い (1 に 20 nt 挿入長さ) 逆のコピーとフルレングスの強力な停止 (182 に 180 nt 挿入長さ) の両方でよく見かける高い豊かさを反映している (図 3b)。
提案するプロトコルと選択したプライマーが早期の HIV-1 逆のトランスクリプションの構成要素の特定、メソッドはオープン 3' 末端の DNA を決定することを目指して研究に一般的に適用されます。他のコンテキストに必要な主な変更は、ハイブリッド キャプチャ ・ プライマー デザイン戦略メソッドになります。たとえば、ターゲットを後半の HIV-1 の成績証明書に適応する場合は、多数の異なるキャプチャ ビオチン標識オリゴヌクレオチド Dna の長さにわたって焼鈍勧められる、ハイブリッド キャプチャ手順で損失を減少する可能性が。導入で述べたように、その 3' 末端がさまざまなソース バイアスを避けるために検出する範囲を設計するときの制限を考慮することが重要です。最初に場合、可能性がありますバイアス PCR の反作用でアダプターのテンプレートは、非常に様々 な長さの。第二に、(例えばMiSeq) シーケンス プラットフォーム使用ここでは、最適なクラスタ リングの最寄りの挿入長さの範囲と短く、長い製品が同じ効率でのシーケンスを処理しない可能性があります大幅。一部では、これは計算上、長さバイアスの補正係数を計算することによって行われていた対処できる (図 4下のグラフを参照してください)。ただしの 3' 末端のマッピングが必要な領域が長い場合 (> 1000 nt)、それはより結紮の転写産物が関与する反応を分割し、3' 末端のセクションでを評価するために複数の上流のプライマーを使用することをお勧めします。
解析プログラムは、任意の突然変異を識別するために全ての基地の基本バリエーションだけでなく、固定アダプター シーケンスに隣接する HIV-1 シーケンスの両方の最後のヌクレオチドの分析の特定の目的のため社内に書かれていた。個々 のステップは、以下を構成する: まず、アダプター シーケンスは fastx 0.0.13 ツールキット; を使用してトリムされますその後、(バーコードを含む同一のシーケンスを意味する) 重複したシーケンスが削除されます。残りのすべてのユニークな読み取りは、ボウタイ (http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml) を用いた 3 つの拠点に設定最大の不一致 HIV-1 シーケンスに配置されます。テンプレートのシーケンスで構成されています最初の 635 - sss シーケンスと polypurine トラック (U5 R U3 PPT; を参照してください図 1) までの最初の鎖転送製品を含む HIV 1 cDNA (NL4.3 株) の nt。これにより、指定されたソフトウェアとテンプレートも、直接適切なメソッドを使用して同じアプリケーション (HIV-1NL4.3の初期の逆のコピーの検出) の場合だけです。調整は、他のターゲット シーケンスのために作られる必要があります。各 read に対して 3' テルミニの位置は、配置位置によって決定されました。各位置のためのデータベース呼び出しが記録され、突然変異率は異なりますが、さまざまな長さの読み取りがあり、Read2 の 125 ベース シーケンスによって長い挿入は全く扱われない各拠点の全体のカバレッジから計算されます。
最後に、研究の多くの種類のための貴重なツールであることこの方法と考えています。明白なアプリケーションには、抗レトロ ウイルス薬や携帯電話の制限要因を逆転写抑制機構の調査が含まれます。ただし、唯一の比較的マイナーな調整は 3' 末端他一本鎖 DNA ウイルス中間体、パルボ ウイルス複製にたとえば、ある内でマッピングするシステムを適応する必要する必要があります。さらに、法、特にその最適化された結紮のステップの原理が伸び触媒による細胞の二本鎖 DNA を含むすべての 3' の DNA の拡張の特性のライブラリ作成デザインのコアな部分を提供できます。ポリメラーゼ。

分析し、ウイルスの複製に、ますます洗練されたレプリケーションをキャプチャ技術を理解するために、中間体が必要です。日付に多くのウイルスの複製機構を持っているので特に、ウイルス核酸種感染細胞のコンテキスト内での正確な定義は新しい洞察力を提供できるされて分離の in vitro反応を検討しました。典型的な例は、ひと免疫不全ウイルス (HIV-1) 1 など、レトロ ウイルスの逆転写の過程です。浄化された蛋白質とプライマー延長の試金を中心に学び、核酸酵素ウイルス逆転写酵素 (RT) が二本鎖 DNA に一本鎖 RNA ゲノムをコピー中に、HIV 1 逆のトランスクリプションの様々 なステップがされています。酸1,2,3,4,5。基本原則が確立された、このような試金すべてのウイルスと細胞成分を内蔵していないと関与因子の生物学的関連性の高い結果を反映していない可能性があります。したがって、正確な cDNA 3' 末端 (すなわち、彼らの正確な長さを決定する) と生活の伝染のコンテキストで塩基配列の逆のトランスクリプション中間体のスペクトルを決定するための強力な手法を考案しました。セル6。抗ウイルスの分子や蛋白質が効率性と DNA 合成のドメインに影響を与える可能性がありますの存在など、様々 な条件下での成績証明書のプロファイルを比較する実験・実習を利用できる時間からのデータ収集、蓄積。これにより標的薬剤設計および成功した治療的介入の基礎は、しばしば自然の病原体のライフ サイクルの詳細を理解します。
HIV 1 逆転写する一連のマイナス鎖の強力な停止と呼ばれる短い一本鎖 cDNA のトラン スクリプトを生成する RT 延長はゲノムの RNA テンプレートに tRNA プライマーのアニーリングによる連続イベント (-sss) (参照してください図 1)。その後、sss cDNA リピート (左から右) 5'-長いターミナルから、焼鈍、機能継続の RT のプライマーはマイナスの伸びを媒介として鎖 DNA ゲノムの RNA の 3' LTR に転送されます (逆のトランスクリプション1のレビューを参照してください。,2,3,4). この最初の鎖の転送は逆のトランスクリプションの率制限ステップの 1 つしたがって、蓄積する sss cDNA が知られています。感染細胞の逆のトランスクリプション製品をキャプチャする基本的なワークフローとライブラリの設計は、図 2 aに記載されています。特異的プライマーとプロトコルで使用され、表 1に記載されている設定はすべてを早くターゲット分析逆転写 cDNA 中間長さ範囲 23 ~ 650 の nt は、180-182 nt - sss DNA にはが含まれています。ただし、適切なマイナーな適応戦略は、後半の逆のトランスクリプション製品だけでなく、他のウイルスやシステムへの応用目的は 3' OH 含む DNA 終了を検出できます。考慮する重要な制限事項は、ライブラリの最終的な PCR の製品の長さの範囲特に、オープン 3'-末端のアダプターと上流プライマー サイト間の距離が 1000 nt を超えるテンプレートが可能性が高いより効率的にシーケンス、ライブラリの準備 (の間に技術的なバイアスを誤解を招く潜在的導入詳細と適応提案についての説明を参照)。
以前核酸鎖の 3'-テルミニの系統的定量のための報告の技術は、DNA ではなく RNA を分子に焦点を当てています。1 つの例は 3' レース (cDNA の端の急速な拡大)7mRNA の起こるに依存しています。さらに、RLM レース (RNA のリガーゼ仲介競争)8またはレース (cDNA の端の結紮による増幅)9含まれている RNA リガーゼを用いたアダプター結紮ベース戦略は開発されました。結紮ベースの拡大、ligation の反作用自体によって導入された任意のバイアスに敏感であることを強調することが重要です。たとえば、結紮は、3' の位置、シーケンス、合計の分子の長さ、または局所構造の特定の塩基配列によってもっとまたはより少なく効率的かもしれません。このようなリガーゼの好みは分子と私たちと他の人は9,10を観察している読み出しの不実表示の不完全なキャプチャに します。記載プロトコルでは、アダプターに追加の手順の中に、結紮バイアスを最小限に抑える、我々 は結紮戦略の数をテストし、T4 DNA リガーゼ ヘアピン一本鎖 DNA アダプターでの使用を発見した (國らによって記述します。11) ライゲーション効率制御オリゴヌクレオチド6の特別に選択したセットで評価するときに有意差には至らなかった定量的結紮の近くとプロシージャだけをします。この結紮戦略の選択は、したがって、このプロトコルの成功に重要な機能です。
日には、感染細胞内の HIV-1 RT 進行の監視主によって達成されている一意に測定短いまたは長いプライマー-プローブ セットを使用して量的な PCR (qPCR) と様々 な長さの逆のトランスクリプション製品を測定 (初期と後半、それぞれ) cDNA 製品12,13,14。この qPCR のアプローチはセルラ システムにおける逆のトランスクリプション プロセスの本質的な効率を決定する適切なのですが、出力は比較的低解像度の派生シーケンス情報がありません。我々 の新しいアプローチに基づいて最適化されたアダプター結紮、PCR を利用したライブラリを生成、およびアドレス ディープ シーケンス技術格差と定量的および単一のヌクレオチドの HIV-1 感染時に逆のトランスクリプションを監視する機会を提供しています解像度。
2 つ提案モデル間の HIV-1 制限因子 APOBEC3G の容量 (アテロームの mRNA 編集酵素触媒のポリペプチドのような 3 G) 干渉する識別における本法の有用性を説明している、ウイルスの逆のコピー6の生産。

<table><tbody><tr><td>293T細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ改変イーグルス培地</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15150-122</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>HeraCell Vios 250i CO2インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>51030966</td><td></td></tr><tr><td>層流フローフード - CAS BioMAT2</td><td>Wolflabs</td><td>CAS001-C2R-1800</td><td></td></tr><tr><td>10mm TC処理培養皿</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE&trade;Express (1x), 安定トリプシン置換酵素</td><td>Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM&reg;(ミニマルエッセンシャルメディウム)</td><td>Gibco</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3)</td><td>NIH Aids 試薬プログラム</td><td>114</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン (PEI) - MW:25000</td><td>PolySciences Inc</td><td>23966-2</td><td>1mg/ml で溶解し、pH7</td></tr><tr><td>RQ1- Rnase 遊離 Dnase</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>フィルター 0.22 &mu;m</td><td>Triple Red Limited</td><td>FPE404025 15</td><td></td></tr><tr><td>mL ポリプロピレンチューブ</td><td>Corning</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Calbiochem</td><td>573113</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (1x)</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>超遠心チューブ</td><td>Beckman Coulter</td><td>344060</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>Sorval</td><td>WX Ultra Series</td><td>Th-641ローター</td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24 antigen ELISA kit</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEK050001KT</td><td></td></tr><tr><td>CEM-SS cells</td><td>NIH Aids reagent program</td><td>776</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute Medium</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>CoStar&reg;TCは複数の井戸プレートを扱い</td><td>ました コーニング</td><td>CLS3513-50EA</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心分離機:Heraus&trade;マルチフュージ&トレード;X3 FR</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004536</td><td></td></tr><tr><td>TX-1000 スイングバケットローター</td><td>Thermo Scientific</td><td>75003017</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機: 5424R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000060</td><td></td></tr><tr><td>Total DNA extraction kit (DNeasy Blood and Tissue kit)</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free H2O</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Cutsmart buffer</td><td>ニューイングランドバイオラボ(DpnI酵素の一部)</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>DpnI制限酵素</td><td>ニューイングランドバイオラボルツ</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>オリゴヌクレオチドqPCR</td><td>MWGユーロフィンN</td><td>/ A</td><td>HPSF精製</td></tr><tr><td>TaqMan PCRユニバーサルマスターミックス</td><td>サーモ</td><td>4304437</td><td></td></tr><tr><td>LoBindエッペンドルフ&reg;チューブエ</td><td>ッペンドルフ</td><td>30108078</td><td></td></tr><tr><td>Axygen&trade;エアロゾルフィルターピペットチップ、1000 &mu;L</td><td>Fisher Scientific</td><td>TF-000-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Axygen&trade; エアロゾル フィルター ピペット チップ、200 &mu;L</td><td>Fisher Scientific</td><td>TF-200-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Axygen&trade; エアロゾルフィルターピペットチップ、20 &mu;L</td><td>Fisher Scientific</td><td>TF-20-R-S</td><td></td></tr><tr><td>Axygen&trade; エアロゾルフィルターピペットチップ、10 &mu;L</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>TF-10-R-S</td><td></td></tr><tr><td>PCR クリーンフード</td><td>LabCaire</td><td>モデル PCR-62</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag&trade;2磁石</td><td>Thermo</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin MagneSphere&reg; 常磁性粒子</td><td>Promega</td><td>Z5481</td><td></td></tr><tr><td>Casein</td><td>Thermo Scientific</td><td>37582</td><td></td></tr><tr><td>エンドオーバーエンド ローテーター、リボルバー&trade; 360&deg;</td><td>Labnet</td><td>H5600</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-5</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>シグマ</td><td>H1758-100ML</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 二ナトリウム塩二水和物</td><td>エレクトラン (VWR)</td> <td>443885J</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Σ</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Dri-Block&reg;アナログ ブロック ヒーター</td><td>Techne</td><td>UY-36620-13</td><td></td></tr><tr><td>PCR チューブとドーム型キャップ</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0266</td><td></td></tr><tr><td>PCR マシン</td><td>Eppendorf</td><td>Mastercycler&reg; シリーズ</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA リガーゼ</td><td>ニューイングランド バイオラボ</td><td>M0202M</td><td></td></tr><tr><td>H2O 中の 40% ポリエチレングリコール溶液 (PEG) MW: 8000</td><td>シグ</td>マ <td>P1458-25ML</td><td></td></tr><tr><td>ベタイン溶液、5M</td><td>Sigma</td><td>B0300-1VL</td><td></td></tr><tr><td>ゲルローディングバッファー II (ホルムアミドバッファー)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM8546G</td><td></td></tr><tr><td>Precast 6% TBE 尿素ゲル</td><td>Invitrogen</td><td>EC6865BOX</td><td></td></tr><tr><td>Mini cell electrophoresis system</td><td>Invitrogen, Novex</td><td>XCell SureLock&trade;</td><td></td></tr><tr><td>トリス/ホウ酸塩/EDTA溶液 (10x)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10031223</td><td></td></tr><tr><td>Needle 21 G x1 1/2</td><td>VWR</td><td>613-2022</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Gold nucleic acid stain (10000x)</td><td>Life Technologies</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>Dark Reader DR46B transilluminator</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9800797</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium acetate</td><td>Merck</td><td>101116</td><td></td></tr><tr><td>SDSの解決20% (w/v)</td><td>Biorad</td><td>161-0418</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機の管フィルター</td><td>Appleton Woods</td><td>BC591</td><td></td></tr><tr><td>フィルター ガラス繊維 Gf/D 10mm</td><td>Whatman (VWR)</td><td>512-0427</td><td></td></tr><tr><td>ポリアデニル酸 (polyA) RNA</td><td>Σ</td><td>10108626001</td><td></td></tr><tr><td>グリコーゲン、分子生物学の等級</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール(2-プロパノール)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>15809665</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、分子生物学グレード</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10041814</td><td></td></tr><tr><td>アキュプライム&trade;Supermix I (DNA polymerase premix)</td><td>Life Technologies</td><td>12342-010</td><td></td></tr><tr><td>NEB次へ&reg;イルミナ用マルチプレックスオリゴ(インデックスプライマーセット1および2)</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335S;E7500S</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation D1000スクリーンテープ 高感度</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067- 5584</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation D1000 試薬</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067- 5585</td><td></td></tr><tr><td>2200 Tapestation - 自動ゲル電気泳動システム</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2965AA</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt&reg;アンプリューレビーズ XP</td><td>ベックマン・コールター</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>量子ビット&貿易; dsDNA HS アッセイキット</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>量子ビット&貿易; 2.0 蛍光光度計</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>トポ&貿易;TAクローニングキット</td><td>Invitrogen</td><td>450071</td><td></td></tr><tr><td>シーケンシングプラットフォーム: MiSeq System</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Experiment Manager (サンプルシートソフトウェア)</td> <td>Illumina</td><td>注: TruSeq LTをテンプレート</td><td></td>として使用します</tr><tr><td>Miseq&trade;試薬キット V3 (150 cycle)</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3001</td><td></td></tr><tr><td>シーケンシングハブ: Basespace</td><td>Illumina</td><td>https://basespace.illumina.com</td><td></td></tr><tr><td>Ligase A: Thermostable 5'アプリケーション DNA/RNA リガーゼ<</td><td>em>NEB<</td><td>em>M0319S</td><td>このプロトコルでは使用しませんが、最適化プロセスでテストされ、ディスカッションで説明されている結果が得られます。</td></tr><tr><td>Ligase B: T4 RNA リガーゼ 1<</td><td>em>NEB</td><td>M0204</td><td>このプロトコルでは使用しませんが、最適化プロセスでテストし、ディスカッションで説明されている結果を示します。</td></tr><tr><td>Ligase C: CircLigase</td><td>Epicentre</td><td>CL4111Kこの</td><td>プロトコルでは使用されませんが、最適化プロセスでテストされ、ディスカッションで説明されている結果が得られます。</td></tr></tbody></table>

決定の 3' 末端と hiv-1 の間に初期の一本鎖のウイルス dna 分子のシーケンスを逆に感染細胞における転写

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

ウイルスの複製中に核酸中間体の監視ウイルスの DNA 合成の効果および抗ウイルス化合物とホスト細胞タンパク質の作用メカニズムに洞察力を提供します。ここでウイルス感染症の生理学的なコンテキスト内でレトロ ウイルスの逆のトランスクリプション中間体を定義することができる細胞ベース、カバー力が高く、高解像度のアッセイの欠如に取り組みます。記載されているメソッドは、単一のヌクレオチドの解像度での HIV-1 感染細胞内で初期相補的 DNA (cDNA) 分子の 3' テルミニをキャプチャします。プロトコルを含む全細胞の DNA ハイブリッド キャプチャを介してウイルス DNA、アダプター結紮、ゲル精製、PCR 増幅、ディープ シーケンスとデータ解析によるサイズ分別の対象となる濃縮の収穫します。重要なステップは、3'-DNA テルミニを開くアダプター分子の効率的かつ公平な結紮です。記載されているメソッドのアプリケーションは、ある特定のサンプルのそれぞれの特定の長さの逆の転写の豊富さを決定します。それはまた任意の潜在的な突然変異により逆のコピーの (内部) シーケンス変化に関する情報を提供します。一般に、アッセイは、テンプレートの順序は知られている、DNA 3'-拡張に関する質問に適しています。

この資料で説明する手法は HIV-1 抗レトロ ウイルス人間蛋白質 APOBEC3G による逆転写 (A3G) 抑制のメカニズムに対処するための幅広い研究に適用される6。図 3は、 vif感染 CEM SS T 細胞からのサンプルでプロトコルを採用した代表的な結果を示しています-欠乏の HIV-1 A3G の有無で。同じ 6 を持っている PCR 重複除外後に各サンプルから得られるユニークな読み取りの合計数 nt バーコードと同じ長さ (提供される分析ソフトウェアで実行されます) は図 3を順にプロットされます。A3G の増加レベルは、A3G の抑制効果を介した RT cDNA を合成する以前に説明した、qPCR6,13,21,22で測定に反映して合計読み取り数を減らします。図 3b、最初 182 内それぞれの可能な長さで分子の割合 nt が表示されます。A3G の不在の HIV-1 感染、最も豊富な種はメイン 180 nt 強い停止分子自体は、いくつかの蓄積と読み取りの短い範囲で (23 に 40 nt) (青いグラフ ヒストグラム上)。このプロファイルは短く、急激な増加は、いくつかの非常に特定、再現可能な位置で cDNA 分子を切り捨てられてので、A3G 変更の追加 (中間および低いグラフ) が検出されました。A3G はシチジン アデノシンデアミナーゼ、シトシン-ウリジン (C ・ T として識別される) ので、A3G が感染しているウイルス粒子21,23,24cDNA の突然変異が発生します。得られた配列情報を使用して、C-T の突然変異の割合は (赤点線) の同じのグラフにプロットしました。変異プロファイルはすべて一意の読み取りを組み合わせるから派生し、各ヌクレオチドの報道とは異なることに留意。ただし、シーケンス情報を各分子に関連し、特定 3' 末端と相関できるために必要な場合。提供されるデータは、Pollpeterらから採取しました。6および突然変異の間の相関と cDNA 長さプロファイルを示した DNA 修復する機械の検出と細胞によって脱 cDNA の胸の谷間に起因します。
3'-マッピングのアプローチの肯定的な制御は、知られていたシーケンス、長さ、および濃度の総合的なオリゴヌクレオチドのプールを処理することにより簡単に生成できます。このコントロールは、3.3.2 の手順でアダプター結紮で追加され、多重のすべてのライブラリに含めることをお勧め。コントロールのサンプルから得られたデータは、予期される入力比、唯一の非常にマイナーなバック グラウンドの読み取りですべてのオリゴヌクレオチドをはずです。図 4は、17 の化学的合成オリゴヌクレオチドの肯定的な制御セットの結果を示しています (シーケンスは、表 2を参照)、モル比でミックスされました。予想通り、すべての分子がだけ小さな変化 (上のグラフ) と同じ豊富な近くに表示されます。オリゴヌクレオチドによる表されなかった sss DNA シーケンス内のほとんどのポジションを返す 0 の読み取り数、実際のコントロールのオリゴヌクレオチドより短い 1 または 2 nt のマイナーな種を見ました。我々 はこれらのマイナーな種をさらに調査していないが劣化または不完全な製品購入時指定されたオリゴヌクレオチド株に潜在的に存在を表すことを前提として (オリゴヌクレオチドは、HPLC 精製を命じられた、メーカーを示す &gt; 80% の高純度)。下のグラフは、別のライブラリを実行すると、変化はわずか 17 オリゴヌクレオチドとの間に高いし、長い分子の制御がより効率的に検出されるという点で、全体の長さと相関し、短いものからコントロールのサンプルを示しています。これは PCR の反作用または挿入サイズ最適のある MiSeq シーケンス処理中にクラスタ リングでマイナーなバイアスが原因である可能性があります、特に広い挿入範囲を運ぶライブラリで発生する可能性があります。このバイアスに対処する基本的な方法は、分子の長さ (ピンクの線) にバイアスを示す斜面に基づいて正規化係数のアプリケーションです。必要な計算の解析プログラムに含まれている (プロトコル 8.3 を参照)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig1.jpg"> 図 1: HIV-1 の最初のステップを逆転写を示す図。開始とウイルス cDNA (青、ステップ 2) の伸長を可能にするゲノム ウイルス rna (ステップ 1)、tRNA(Lys,3) (オレンジ) のプライマー結合部位 (PBS) に焼鈍をまずします。付随して、テンプレートのゲノム RNA は RT (ステップ 3) の RNaseH 活性が低下します。逆転写の過程で最初の完全の中間ですマイナス鎖強い-(-) sss cDNA RT 触媒重合 gRNA リピート (R) 領域 (ステップ 3) の 5' 末端に達したとき完全であります。中間の (-) sss は、相補的 3'-長いターミナル リピート (LTR) R 領域にアニールによるゲノム RNA テンプレートの 3' 末端に転送されます。ここからは、重合は、(手順 4) を続けています。この方法で逆のトランスクリプションの進行は新生ウイルス cDNA (青) の正確な長さをマッピングによって決定されます。PPT、polypurine 管;U5、ユニークな 5'-シーケンス;U3、ユニークな 3'-シーケンス。この図は、以前文書6から再発行されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig2v3.jpg"> 図 2: ワークフローのアウトラインとアダプターの結紮と PCR 増幅戦略の概略図。(3'-HIV-1 の終点を決定する記述手法の主な手順の概要ワークフロー a) 逆感染細胞の転写物です。図は、以前の文書6から適応。(b) アダプターの ligation および PCR 増幅戦略の概略図。前の手順で精製されている様々 な長さの初期 cDNA 分子が T4 DNA リガーゼを使って単一座礁させた DNA アダプターに組み合わされて。ヘアピン アダプター (名前付き「フル國 + MiSeq」、表 1を参照) のデザイン國らに触発されました。11. アダプターを運ぶランダム 6 nt バーコード シーケンス ベース ペアリング結紮を容易にすることができますし、同時に識別子として一意の読み取りを提供しています。アダプター 3' 末端は、スペーサー (SpC3) 自己 ligation を防ぐために運ぶ。結紮製品は、余分なアダプターから変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) で区切られます。核酸ゲルで、ステンド グラスし、25で井戸の中にアダプターから地区別、等しいサイズのゲル 3枚にカットします。溶出・降水量・巻き上がり後、製品は、アダプターの知られていたシーケンスにアニールするプライマーで増幅した PCR (プライマー 1、多重オリゴヌクレオチド キット、材料表を参照してください)、最初の 22 を運ぶプライマー HIV-1 の nt5'-LTR シーケンス (プライマー 2、MP1.0 + 22HIV) tRNA の直後します。選択したプライマーの 5' テルミニは、同じライブラリで実行する個々 のサンプルを区別するためにインデックス シーケンスだけでなく、選択したシーケンスのプラットフォーム (P5 と P7) 用のアダプターを運ぶ。シーケンスの開始ポイントを読むプライマーが示されます。青いボックスは、オリジナル 3' 末端キャプチャされた分子の決定に関心の領域を示します。この図は、以前の文書6から適応。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig2v3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig3.jpg"> 図 3: 代表結果。(a) 代表的なサンプルで説明されているプロトコル処理の合計読み取り数。これはその 3' 末端最初 635 内で HIV 1 分子のユニークな読み取りとして識別されたすべてのシーケンスが含まれていますマイナスの nt 鎖 cDNA (PPT、までは図 1を参照)。A3G cDNA 合成を阻害する、読み取りカウント総数が減少に対し、A3G を運んでいない HIV-1 感染は最高数のリードを生成します。総合的なオリゴヌクレオチドのセットは、肯定的な制御を提供しながら、感染していない細胞はネガティブ コントロールとして提供しています。b) nt 位置 23 と 182 の間長ごとの Cdna の相対的な豊かさ (sss 完全長 cDNA は 180 に 182 nt) HIV-1NL4.3のシーケンス (x 軸) が青のヒストグラム (左側の y 軸のスケール) で表示されます。CDNA の相対的な豊かさは、シーケンス 182nt の測定のすべての読み取りの合計で割った値 sss cDNA シーケンス内で特定の塩基配列の終端または以下の絶対数から算出しました。(-右の y 軸のスケール) のそれぞれの位置での C-T/U の突然変異を運ぶ読み取りのパーセンテージは、赤の破線で表示。図 3bは、以前文書6から再発行されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58715/58715fig4.jpg"> 図 4: コントロールのサンプルの代表の結果。17 の長さの異なる合成オリゴヌクレオチドの等モル量を含むプールの 2 つのプロファイルを示します。これらのオリゴヌクレオチド HIV-1NL4.3からのシーケンスがあるし、様々 な距離をカバーし、3'-ヌクレオチドとしてすべての 4 拠点が存在した (表 2参照)。上のグラフは、図 3から肯定的な制御のサンプルを示しています。分子の長さや、オープン 3' 末端に向かって重要なバイアスは検出されません。下のグラフは、実行すると、シーケンスでマイナーな長さバイアスを生成する別のライブラリを示しています。この場合、サイズのバイアスを表す (ピンクで表示) 斜面に由来する正規化係数を適用することをお勧めします。この図は、以前文書6から再発行されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/58715fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">オリゴ名</td>
			<td>Nt の長さ</td>
			<td colspan="12">シーケンス</td>
			<td colspan="2">目的</td>
			<td colspan="2">メーカー (浄化)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">フルの國 + MiSeq</td>
			<td>61</td>
			<td colspan="12">5'-フォー-tgaagagcctagtcgctgttcannnnnnctgcccatagagagatcggaagagcacacgtct-SpC3-3'</td>
			<td colspan="2">アダプター</td>
			<td colspan="2">IDT DNA 技術 (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">2xBiotin SS 餌</td>
			<td>40</td>
			<td colspan="12">5'-ビオチン-cagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggac-ビオチン-3'</td>
			<td colspan="2">ハイブリッド キャプチャ</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ビオチン 1 16 ss</td>
			<td>22</td>
			<td colspan="12">5'-cagtgtggaaaatctctagcag-顕微鏡-3'</td>
			<td colspan="2">ハイブリッド キャプチャ</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (高速液体クロマトグラフィー</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">ビオチン tRNA + CTG</td>
			<td>16</td>
			<td colspan="12">5'-cagtggcgcccgaaca-顕微鏡-3'</td>
			<td colspan="2">ハイブリッド キャプチャ</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">MP1.0 + 22HIV</td>
			<td>82</td>
			<td colspan="12">5'-aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatctcactgctagagattttccacactg-3'</td>
			<td colspan="2">PCR の拡大</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (高速液体クロマトグラフィー</td>
		</tr>
</tbody></table>テーブル 1: テーブル記述プロトコルの長さ、シーケンス、および使用されている修正を含むオリゴヌクレオチドの。テーブルは、以前の文書6から適応。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/Table1_Pollpeter.xlsx" target="_blank">Excel ファイルとしてこの表をダウンロードするここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">オリゴ名</td>
			<td>Nt の長さ</td>
			<td colspan="12">シーケンス</td>
			<td colspan="2">メーカー (浄化)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con 長い C</td>
			<td>120</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaagc-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con 長い G</td>
			<td>119</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaag-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con 長い T</td>
			<td>116</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggctt-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP コン ロング A</td>
			<td>118</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagctttattgaggcttaa-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">C 半ば HTP コン</td>
			<td>76</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcac-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con 半ば G (、)</td>
			<td>71</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacg-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con 半ば G (b)</td>
			<td>72</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgg-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">A 半ば HTP コン</td>
			<td>69</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacaga-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">T 半ば HTP コン</td>
			<td>85</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactt-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP コン ショート A</td>
			<td>40</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgaggga-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con ショート T</td>
			<td>33</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggt-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con 短い G</td>
			<td>41</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtctgaggg-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP con 短い C</td>
			<td>34</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactgactaaaagggtc-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP コン 46 (T)</td>
			<td>46</td>
			<td colspan="12">5'-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctct-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP Con 83 (C)</td>
			<td>83</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="7">5'-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactac-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP Con 103 (C)</td>
			<td>103</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagc-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">HTP コン 107 (A)</td>
			<td>107</td>
			<td colspan="12" fo:font-size="6">5'-ctgctagagattttccacactg actaaaagggtctgagggatctctagttaccagagtcacacaacagacgggcacacactactttgagcactcaaggcaagcttta-3'</td>
			<td colspan="2">MWG Eurofins (HPLC)</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: 肯定的な制御サンプルとして使用される 17 の合成制御オリゴヌクレオチドのテーブル。トップ 13 オリゴヌクレオチドは、サイズに基づいて選ばれた [長い (116 を 120 nt)、中期 (69 に 85 nt)、短い (33 に 41 nt)] その 3' 末端だけでなく。テーブルは、以前の文書6から適応。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58715/Table2_Pollpeter.xlsx" target="_blank">Excel ファイルとしてこの表をダウンロードするここをクリックしてください</a>。

初期 3' 末端の公平な測定だけでなく、単一座礁させた DNA の分子の変異プロファイルを提供するディープ シーケンス アプローチをご紹介します。メイン アプリケーションは、初期のレトロ ウイルス相補的 Dna (Cdna)、レトロ ウイルスの逆転写の過程で生成される中間体の特性です。

決定の 3' 末端と HIV-1 の間に初期の一本鎖のウイルス DNA 分子のシーケンスを逆に感染細胞における転写

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

逆転写を分析するこの新しい方法は、レトロウイルス学の分野に関する新しいことを教えてくれます。例えば、細胞制限因子がどのように機能するか、抗レトロウイルス薬がHIV1 DNA合成を阻害する方法の詳細について学ぶことができます。この技術の主な利点は、Nascentリバーストランスクリプスの配列に関する情報を提供するだけでなく、単一の核タイト解像度で正確な3プライムDNA末流のマッピングを可能にすることです。HIV1感染細胞の卸売DNAからのHIV1の無料DNAの濃縮は、ハイブリッド捕獲によって行われ、PCRワークステーションで行われるべきである。サンプルあたり100マイクロのマイクロ遠心管に100マイクロのビーズを向けて磁気ストレプトアビジンビーズのマスターミックスを準備し、マイクロ遠心管に適した磁石の上にチューブを置きます。ビーズがチューブのマグネット側に向かって落ち着いたら、貯蔵バッファーを取り外し、マグネットからチューブを取り出し、ビーズを500マイクロリットルのビンバインド洗浄またはBWバッファーに再び懸濁します。チューブを磁石の上に戻し、ビーズが磁石に移動するのを待ち、上清を取り除きます。マグネットからチューブを取り出し、500マイクロリットルのカゼイン溶液を加え、ビーズを再び懸濁し、室温で10分間インキュベートします。10分後、ビーズをBWバッファーで洗います。チューブを磁石に戻し、上清を取り外し、ビーズを500マイクロリットルのBWバッファに再び懸濁します。サンプルごとに捕獲されたビオチン化オリゴヌクレオチドのピコモレスを50個加えます。エンドミキサーで30分間揺れながら室温でインキュベートします。次に、チューブを磁石に戻し、上澄み物を取り出し、磁石からチューブを取り出し、1x 10バッファの500マイクロリットルを加え、ビーズを再び中断します。2回目の洗浄後、固定化されたオリゴヌクレオチドを用いたビーズを10マイクロリットルの10マイクロリットルのサンプルあたり10個のバッファーで再び懸濁させる。各サンプルに対して、1つのマイクロセトロフュージチューブにラベルを付け、ビーズ懸濁液10マイクロリットル、170マイクロリットルのDNA、3x 10バッファの90マイクロリットルを加えます。DNAを自然に分離するために摂氏92度の乾燥した熱ブロックで2分間インキュベートする。チューブを摂氏502度に設定された別の乾燥熱ブロックに移動し、1時間インキュベートします。このインキュベーション中に10分ごとに、チューブを反転して混合します。1時間のインキュベーションが行われたら、ビーズを1x1バッファーの500マイクロリットルで1回洗浄し、ヌクレアーゼを含まない35マイクロリットルに再び懸濁します。液体を取り除く前に約3分間磁石の上にチューブを残してビーズがうまく落ち着くようにします。溶出するには、乾燥した熱ブロックで92度のチューブを2分間インキュベートします。その後、素早くマグネットにチューブを1つずつ移動します。ビーズがチューブの側面に結合されたら、HIV1DNAを含む上清を新鮮なチューブに移します。この手順を開始するには、凍結乾燥したアダプターをヌクレアーゼフリー水中の100マイクロモルで再中断し、チューブを渦に入れます。サンプルあたり、および1つの対照サンプルを加えて、ゼロポイント4 5マイクロリットルの10x T4 DNAリガーゼバッファー、4マイクロリットルのアダプター、およびヌクレアーゼフリー水のポイントゼロ5マイクロリットルを組み合わせます。2分間摂氏92度に加熱し、PCR機でゆっくりと摂氏16度まで冷却します。これにより、アダプターがヘアピン構造を形成できるようになります。この手順の重要なステップは、3-プライムDNA末語を開くために適応された分子の効率的で公平な結紮です。精製された新生cDNA分子は、T4 DNAリガーゼを用いてヘアピン単本鎖DNAアダプターに連結される。アダプターは、ランダムな6ヌクレオチドバーコード配列を運び、ライゲーションを容易にするために解析を可能にし、同時にユニークな読み取りの識別子として機能します。3素級のシロミニアダプターは、自己結紮を防ぐためにスペーサーを運ぶ。60マイクロリットルの最終体積ライゲーション反応を設定するには、各PCRチューブに、10x T4 DNAリガーゼバッファーの6マイクロリットル、40%PEGの24マイクロリットル、5モルベタインの6マイクロリットル、4ポイント5マイクロリットルのアダプター、1ポイント2マイクロリットルのT4 DNAリガーゼ、およびDNAの18ポイントマイクロリットルを追加します。反応をよく混合した後、一晩摂氏16度でPCR機でインキュベートする。アダプター結紮の翌日、DNAゲルローディングバッファーを含むホルムアミドの30マイクロリットルで各ライゲーション反応に、パイプの見出しによってよく混合する。PCRマシンで摂氏94度で2分間加熱し、すぐに氷の上に置きます。次のステップは、変性ゲル電気泳動の準備です。適切なゲルタンクにプレキャスト6%TBE変性尿素ポリアクリルアミドゲルを入れ、1x TBEランニングバッファを追加します。ゲルを20分間前に実行してください。次に、シリンジと21ゲージ針を使用して、ランニングバッファ付きのゲルポケットを洗い流します。その後、同じサンプルのウェルあたり30マイクロリットルを3つの井戸に積み込みます。クロス汚染を避けるために、ゲルごとに1つのサンプルのみを実行することをお勧めします。20分間実行します。ゲルが動いている間に、21ゲージの注射針を使用して底に穴を突き刺すことによって、サンプルごとに3つのゼロポイント5ミリリットルマイクロ遠心分離管を準備します。準備したチューブをそれぞれ2つのミリリットルマイクロ遠心分離管に挿入し、サンプル名に低、中、または高いラベルを付けます。ダークブルーの染料の前面がゲルの約半分の方にある場合は、電気泳動を停止し、ゲルカセットを取り外します。カセットをこじ開け、カミソリでゲルを縦に切ります。負荷のサンプルの3つの井戸でストリップを寛大に切除する。1x TBEと5マイクロリットルのシアニン核酸染色を含む容器にゲルストリップを加え、3〜5分間インキュベートします。後で取り外すフリーアダプターの上部を容易に識別するために、染色が十分であることを確認してください。次に、青い光のトランイルミネーターの表面を、蒸留された脱イオン水で十分に洗浄します。その後、染色容器からゲル片を取り出し、ライトボックスの上に置きます。ライトボックスの電源を入れ、オレンジ色のフィルターを通して染色された核酸を検査します。染色ゲル上の代表的な連結DNAサンプルを、ここに示す。アダプターは通常、過負荷に見え、ストリークとして上記で実行されるリゲーテッドHIV1 DNAを持つ大きなブロブとして実行されます。赤い線は、ゲルが切断されて自由なアダプターを取り除き、サンプルを3つの偶数に分割する部位を示しています。新しいカミソリの刃を使用して、サンプルがロードされていない領域がまだ存在しない場合は、ゲルの側面を切り取ります。次に、アダプターのすぐ上に切り、アダプターと下部のゲル部品を取り除きます。最後に、高分子量DNAの鋭い強烈なシグナルを持つゲルポケットの約1ミリメートルを含むゲルの一番上を切り取ります。サンプルを含む残りのゲルピースを3つの偶数に分割します。低、中、高分子量領域。次に、3つのゲル断片を2ミリメートルずつ2つに切り、準備されたゼロポイント5ミリリットルマイクロ遠心チューブに移します。開いた蓋で1分間、最高速度でスピンします。2ミリリットルチューブに穴を通してゲル片を絞り、ゲルスラッシュを作成します。ゲル粒子がゼロ点5ミリリットルチューブの底に残っている場合は、針を使用して手動で2ミリリットルチューブに移します。各マイクロ遠心分離管のゲルスラッシュに1ミリリットルの尿素ゲル抽出バッファーを加えることによってDNA抽出手順を開始します。室温でエンドミキサーの端でチューブを最低3時間回転させます。フィルター列を準備します。ピンセットをクリーンセットで使用して、セルロースアセテート膜フィルターを使用して各遠心分離機列に1つの小さな丸いガラス繊維フィルターを追加し、膜の詰まりを防ぎます。逆パイプヘッドチップでフィルターを所定の位置に置きます。ゲルスラッシュと抽出バッファーを含む 2 本のミリリットルチューブをマイクロ遠心分離機で簡単に回転させ、700 マイクロリットルの上清を準備したフィルターカラムに移します。フィルター列を最高速度で1分間、マイクロ遠心分離機で遠心分離します。その後、流れを新しい2ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに流し込みます。残りの上清を使用して列を再ロードします。抽出スラッシュからできるだけ多くの液体を得るようにしてください、そしてゲル片が含まれている場合は気にしないでください。もう一度スピンします。同じ抽出サンプルのフローを結合し、テキストプロトコルで説明されているように進みます。このプロトコルは、抗レトロウイルスヒトタンパク質A3Gの存在または存在下でVif欠損HIV-1に感染したCEMS-ST細胞からのサンプルに使用された。各サンプルから得られた一意の読み取りの総数のプロットは、A3Gのレベルを上げると、総読み取り数が減少することを示しています。逆転写酵素媒介cdna合成に対するA3Gの阻害効果を反映する。これら次の3つのプロットでは、最初の182ヌクレオチド内の各可能な長さで分子の割合が青色ヒストグラムで示されている。A3Gの添加は、いくつかの非常に特異的な再現可能な位置で短い切り捨てられたcdna分子の急激な増加を犠牲にした。破線の赤線は、それぞれの位置でC〜T突然変異を運ぶ読み取りの割合を示す。陽性のコントロールは、知っている配列、長さおよび濃度の合成オリゴヌクレオチドのプールを処理することによって生成することができる。すべての分子は、小さなバリエーションだけで同じ存在に近い存在で現れるべきです。ライブラリの実行が小さな長さのバイアスを生成する場合は、シーケンスで、サイズバイアスを表す傾斜から派生した正規化係数を適用することをお勧めします。この手順は、DNA分子の3つの素端を決定すると、核酸代謝の可能性に関する重要な洞察を追加する他のシステムに容易に適応することができます。HIVとの作業は非常に危険であり、一部の感染症は指定された安全研究所でのみ行われるべきであることを忘れないでください。

determining-3-termini-sequences-nascent-single-stranded-viral-dna

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

HIV指向性は、ウイルスエンベロープのV3領域から推測することができます。 V3は、PCRには、ネストされたRT -...

V3の人口ベースのシーケンシングを用いたHIV - 1トロピズムの遺伝子型推論

検出限界（50〜75コピー/ ml）以下のウイルス量の個体から血漿とクエンシングにおけるHIV - 1 RNAのレベルを定量シングルHIV - 1ゲノムは困難です。ここでは、確実に0.3コピー/ mLにHIV - 1...

標準的な臨床アッセイによる検出限界以下のウイルス量とHIV感染個体におけるHIV - 1 RNAを増幅して定量化

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

ここでは、細胞毒性を説明し、化合物の迅速かつ正確なスクリーニングを可能にする単一ラウンド感染性アッセイは、それらの細胞傷害性（CC 50）を決定し、WTおよび薬物耐性HIV-1に対するIC 50値を示す。...

HIV逆転写酵素及びインテグラーゼ阻害剤の迅速なスクリーニング

このプロトコルは、HIV-1ヌクレオカプシドタンパク質のシャペロン活性をin...

ヌクレオカプシドアニーリング媒介電気泳動（NAME）アッセイは、HIV-1ヌクレオカプシド阻害剤の迅速な同定を可能にする

ほぼ同質遺伝子のウイルス間の成長競争は、相対的な複製適応度を決定するための高感度な測定を提供します。ここで説明するプロトコルには、組換えHIV-1クローンの構築、ウイルスの増殖と増殖の競合、および高感度で一貫性のある結果を得るために最適化された分析方法が含まれます。...

ヒト免疫不全ウイルスの複製フィットネスを決定するためのペアごとの成長競合アッセイ

感染した細胞のゲノムDNAからレトロウイルス統合部位を増幅し、増幅されたウイルス-宿主ジャンクションを配列決定し、次にこれらの配列を参照ゲノムにマッピングするためのプロトコルを記述します。また、BEDToolsを使用して、さまざまなゲノムアノテーションに対する統合部位の分布を定量化する手法についても説明します。...

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

この報告は、急性感染細胞の細胞質抽出物中のヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)プレインテグレーションコンプレックス(PIC)関連統合活性を測定するためのin vitroアッセイについて説明しています。PIC関連HIV-1...

の測定インビトロ HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動

潜在性の決定の増幅とフルレングス (そのまま、欠陥) HIV-1 の proviruses の近くの 1 つのシーケンスに効率的かつ高スループット方法を提供でき、フルレングス個々 プロウイルス シーケンス (反転)レプリケーション能力。反転は、潜在的な HIV 1...

次世代シーケンシングのフルレングスの HIV-1 Proviruses 近くの増幅

プロトコルは間違いが傾向があるPCRおよび逆の遺伝学を使用して完全長の突然変異体のRNAの統合の結合によって肝炎のウイルスのゲノムの制御可能な遺伝の多様性をもたらすための方法を記述する。この方法は、表現型選択のモデルを提供し、長さ10...

ポジティブセンスRNAウイルス変異体を改変するためのリバースジェネティクス

学ぶHIV-1感染細胞における一本鎖ウイルスDNAの3'末端マッピング法。ハイブリッドキャプチャーとディープシーケンスを用いて、逆転写産物の精密解析と宿主因子の作用機序を明らかにする。

決定の 3' 末端と HIV-1 の間に初期の一本鎖のウイルス DNA 分子のシーケンスを逆に感染細胞における転写

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