Name: 低酸素環境下におけるヒトのマクロファージ偏光のプロテオーム解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 学ぶ低酸素環境下でのヒトマクロファージ偏光のプロテオーム解析法。ラベルフリー定量を用いて活性化状態をタンパク質レベルで評価し、免疫学研究に有用なデータを提供する。

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午前リーグ国立 contre le がんとラ財団アーク注ぐラ凝ったシュル ルがんラで若いグループ リーダー プログラム (ATIP/アベニール Inserm CNRS)、によって資金を供給します。生物学のプラットフォーム (UTECHS MSBIO、パスツール研究所、パリ) の質量分析からマリエット Matondo に感謝いたします。我々 はローレン ・ アンダーソン原稿の彼女の読書をありがちましょう。

ド識別、健康なドナーから血液サンプル (LRSC) は、承認されたプロトコル (CODECOH DC-2018-3114) の一部として EFS (フランス語国民の血サービス) から得られました。ドナーは、血液を使用するため署名された同意書を与えた。
1. メディアとバッファーの準備
<ol><li>[RPMI glutamax + 10 mM HEPES + 1 x 非必須アミノ酸 (NEAA)] マクロファージ媒体を準備し、37 ° C に温める</li>
	<li>マクロファージ中 + AB プラズマ (SAB) から 10% 血清を準備、それ (0.22 μ m フィルター) をフィルタ リングし、37 ° C に温めて (マクロファージ中 + 10% と呼ばれる SAB 以下)。</li>
	<li>[リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) + 0.5% ウシ血清アルブミン (BSA) + 2 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) x 1] の並べ替えのバッファーを準備、フィルター (0.22 μ m フィルター)、および 4 ° C で維持</li>
</ol>2. 末梢血単核球 (PBMCs) Leukoreduction システム室 (LRSC) からの分離
<ol><li>密度勾配細胞分離液 15 mL を入れて (材料表参照) 50 ml 遠心チューブ、LRSC を受信する前に部屋の温度 (RT) に温めてくれるので。 注: 密度は温度に依存します。それは右に釣り合うことができますので、この手順必要があります事前に行われるこの製品は 4 ° C で保存、</li>
	<li>50 mL の遠心管に、LRSC を空、1 × PBS の最大 50 mL を加え、混ぜます。非常にゆっくりと準備段階 2.2 手順 2.1 の時にウォーム アップを密度勾配液の 15 mL の上にミックスの 25 mL を追加します。 注: このステップの間に段階を混在させないよう注意します。血液は、密度の勾配ソリューションのこのフェーズの妨害なしに追加する必要があります。</li>
	<li>遠心分離機の両方の遠心分離チューブ 700 x g 区切りなしで 25 分。 注: 先頭に下からレイヤー密度勾配遠心法末、: 赤血球および顆粒球のペレット、密度勾配ソリューション フェーズ、PBMCs とプラズマの層を形成します。</li>
	<li>、ピペットを使い、それを吸引せずにプラズマ相を通過し、新しい 50 mL 遠心チューブに PBMC 層を収集します。洗浄工程と 300 x g で 10 分間遠心 PBMCs に 50 mL の 1x PBS までを追加します。</li>
	<li>上清を吸引し、マクロファージ中の 40 mL にペレットを再懸濁します。</li>
</ol>3. 磁気ラベリングと CD14 の分離+細胞 (単球)
<ol><li>マラッセ室 PBMCs をカウントします。PBMCs (通常 100 ~ 300 × 106セル) の実験を行なうために必要な量を撤回は、遠心分離の管の 300 x g で 10 分間遠心します。</li>
	<li>上清を吸引し、10 ごとの 1.3 のステップ中に準備した並べ替えバッファーの 80 μ L でペレットを再懸濁します7 /10 CD14 マイクロ ビーズの PBMCs。 追加 20 μ l7 PBMCs ミックスも、一定の攪拌下の 4 ° C で 15 分間インキュベートします。</li>
	<li>洗浄工程と 300 x g. で 10 分間遠心、上清を吸引し、500 μ L の 108 PBMCs あたりバッファーの並べ替えでペレットを再懸濁します 107 PBMCs あたりバッファーの並べ替えの 1 つの mL を追加します。</li>
	<li>区切り文字の磁気フィールドに列を配置します。バッファーの並べ替えの 3 mL と洗浄によって列を準備します。</li>
	<li>列に細胞懸濁液を適用します。列に分離する細胞の数によって異なります (ここでは、最大 109 PBMCs の LS の列が使用されます)。フローを含むラベルのない細胞を収集します。 注意: からこのステップでは、すべてのチューブ (正と負の選択) は、フローサイトメトリーによる別の手順のチェック後に保持されます。</li>
	<li>3 x 3 ml のバッファーの並べ替えの列を洗います。3.12 のステップから同じチューブを通る細胞を収集します。追加の並べ替えバッファーして洗浄手順を実行、列が乾燥しないよう注意してください。列の下のコレクション チューブを置き、区切り文字から削除します。</li>
	<li>バッファーを列に並べ替えの 5 mL のピペットします。しっかりと列にプランジャーを押すことにより磁気標識細胞をすぐにフラッシュします。CD14 の純度を高めるため+ 2 番目の列にセル、溶出画分が濃縮されています。</li>
	<li>新しい列に 3.7 3.4 の手順を繰り返します。</li>
</ol>4. 単球へのめっき
<ol><li>マラッセの商工会議所の球をカウントします。CD14 の純度+フローサイトメトリーによる細胞します。実験に必要な単球の量を撤回し、遠心分離の管の配置します。</li>
	<li>300 x g 吸引上清中に 10 分間遠心し、マクロファージの中で単球ペレットを再懸濁します。細胞をプレートし、分化誘導に SAB + 25 ng/mL 大食細胞のコロニー刺激要因を (M-CSF) 1 h 50 分培地を吸引し、マクロファージ中 + 10% にそれを置き換えるを我慢させます。</li>
</ol>5. 6 日目でのマクロファージの偏光
<ol><li>培地を吸引します。マクロファージ中 + 10% に置き換える様々 な刺激と SAB。たとえば、10 ng/mL インターフェロン γ (INFγ) + 1 ng/mL リポ多糖 (LPS) M1 偏光を取得するまたは 20 ng/mL のインターロイキン 4 (IL4) + M2 偏波 20 ng/mL インターロイキン 13 (IL13) を追加します。 メモ: 24 と 48 他のテストに進む前に h の刺激を実行できます。</li>
	<li>デタッチ ソリューションまたは細胞スクレーパーを使用してセルを収穫します。</li>
</ol>6. 低酸素条件下で培養
<ol><li>手順 4 から始まって、単球や、低酸素の状態分析を行う酸素制御環境でマクロファージを維持します。実験中に必要な酸素分圧下で細胞を維持するために低酸素症ワーキング ステーションを使用します。 注意: 低酸素分圧下で作業する場合、すべてのメディアと駅下洗浄バッファーを準備し、液体で正しい圧を得るに十分に待つ重要です。たとえば、10 mL の PBS で 60 mm のペトリ皿 (我々 がファイバー光学酸素センサーを用いた測定) 大気圧から始まって O2分圧 25 mmHg に到達する約 2 時間が必要です。多くの低酸素ステーションまたはインキュベーター、酸素分圧は大気圧の割合として設定されます。精密測定が必要な場合は、直接 mmHg の酸素分圧を設定するを許可するステーションを使用することをお勧めします。</li>
</ol>7. 換散およびゲルの消化力 (プロトコル 1)
注:次のセクションでは、ペプチドを取得し、クロマトグラフィー-タンデム質量分析を実行するために使用する 2 つのプロトコルを説明します。プロトコル 1 セル換散およびゲルの分別と消化を説明し、プロトコル 2 続いてソリューションで消化と等電点焦点法による分画溶液セル換散を説明します。
<ol><li>塩化物イオンとバッファー [234 mM トリス-HCL (pH 6.8) 7.5 %sds、37% のグリセロール、33.3% (v/v) β-メルカプトエタノール、ブロモフェノール ブルー 0.2 %w/v] のセル換散を実行します。4-12% ビス トリス アクリルアミドゲルの各サンプルの 300,000 の細胞のタンパク質と同等をロードします。</li>
	<li>図 3に代表されるゲル 6 バンドに分割する各蛋白質のサンプルを許可する電気泳動の移行の期間を制御します。</li>
	<li>(30% エタノール + 20 分の 7.5% 酢酸)、定着液とゲルを修正し、染色液 (R-250 Coomassie 青い 45 分) を追加します。(30% エタノール + 7.5% 酢酸バンドが表示されるまで) 脱染め色液を追加をきれいなメスのタンパク バンドを切除する前に。</li>
	<li>サイコロ各 500 μ L 管の導入の前にバンドを摘出しました。きれいなガラス表面はケラチン (脱イオン水で 5 %sds の溶液は表面をきれいにする使用ことができます) との汚染を避けるために保証されます。</li>
	<li>200 μ L の重炭酸アンモニウム 25 mM 25 mM 重炭酸アンモニウムとアセトニ トリル (50 %v/v) でワンウォッシュ続いて 37 ° C で 20 分間で 3 回のゲルのスライスを洗浄します。10 分間 100% アセトニ トリル 200 μ L 入りは、ゲルを脱水します。</li>
	<li>10 mm DTT (ジチオトレイトール) 56 ° C (200 μ L) の 45 分の重炭酸アンモニウム 25 mM の室温暗闇の中で 35 分 25 mM 重炭酸アンモニウム (200 μ L) で 55 mM ヨードアセトアミド続いて各ゲル部分を孵化させなさい</li>
	<li>アルキル化を停止し、インキュベートした洗浄で 10 分の重炭酸アンモニウム 25 mM で 10 mM DTT の 200 μ L で各ゲル部分 25 mM 重炭酸アンモニウム、200 μ L のゲル部分 10 分間 100% アセトニ トリル 200 μ L で脱水します。</li>
	<li>製造元の指示に従ってトリプシン/Lys-C ミックス 37 ° C で一晩蛋白質を消化します。</li>
	<li>15 分後、15 分間 5% ギ酸の 50 μ L の 50% アセトニ トリル 50 μ L と 100% アセトニ トリル 15 分プールの最後に、50 μ L の追加によってゲル部分から生成されるペプチドを抽出し、ペプチドの吸着を抑える低吸収管に各画分を乾燥し、サンプルの損失。さらに詳しい分析まで-80 ° c のサンプルを格納します。</li>
</ol>8. 蛋白質の抽出とソリューションの消化 (プロトコル 2)
<ol><li>次の換散バッファーの 150 μ L でセル換散 (2 x 10 の6セル) を実行します。<ol>
<li>7 M 尿素、チオ尿素 2 M、40 mM、トリスとプロテアーゼ阻害剤 (完全なミニ ・ EDTA 無料プロテアーゼインヒビター カクテル) を添加した 4% チャップス。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Thermoshaker と常温 30 分のためのソリューションをホモジナイズしてください。20 分 RT 13,800 × g で遠心し、上清を保ちます。</li>
	<li>2 D のクリーン アップ キットに汚染物質を削除します。<ol>
<li>キットには、沈殿ソリューション、共同鉛塩法ソリューション、洗浄バッファー、および洗浄添加剤が含まれています。</li>
		<li>沈殿溶液 300 μ L を加え、よく混ぜます。鉛塩法共同ソリューションの 15 分追加 300 μ L の氷の上を孵化させなさい。チューブを (少なくとも) 5 分間 12,000 × g で遠心分離機します。小さなペレットが見えるはずです。巻き上がりやペレットの分散を避けるために次のステップへ急速に進みます。ペレットを乱すことがなく上澄みを削除します。</li>
		<li>キャップ ヒンジとペレットが管の底に残りの液体をもたらす外向きで再びチューブを遠心します。短いパルスで十分です。必要がありますいないチューブの液残りの表示。</li>
		<li>ペレットを妨げないで、鉛塩法共同ソリューションの 40 μ L を追加します。5 分 5 分の遠心分離機のための氷の上に座るを削除し、破棄、洗浄チューブをしましょう。25 μ L の脱イオン水を追加します。各渦管 5-10 s。ペレットは、分散、水には溶けません。</li>
		<li>1 mL の洗浄バッファー (-20 ° C で少なくとも 1 時間冷蔵前) と洗浄添加剤の 5 μ L を追加します。渦ペレットを完全に分散するまで。20-30 秒毎 10 分の少なくとも 30 分渦の-20 ° C でチューブを孵化させなさい 注: チューブは-20 ° C で最小限のタンパク質分解または変更と 1 週間まで保存できます。</li>
		<li>遠心分離機管 (少なくとも) 12,000 × g で 5 分は慎重に削除し、上澄みを廃棄します。白いペレットが見えるはずです。(再懸濁しますが困難になるが、余りに乾燥ペレットの場合) 5 分以上センサーにペレットを許可します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>8 M 尿素と 0.1 M 炭酸水素アンモニウムの 300 μ L で蛋白ペレットを再懸濁します。1 分強の渦は、比色定量法を用いたタンパク質濃度を決定します。</li>
</ol>9. ソリューション消化 (プロトコル 2)
<ol><li>700 mM DTT 水溶液 5.1 μ L を追加することによってジスルフィドを減らす (最終濃度 12.5 mM) 8.4 をステップから再懸濁の蛋白質と、thermoshaker で 30 分の 37 ° C で孵化させなさい。700 mM ヨードアセトアミド水溶液の 20.3 μ L を追加することによってシステイン残基をアルキレート (最終濃度 40 mM) と 25 の ° c、thermoshaker で暗闇の中で 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>0.1 M 炭酸水素アンモニウムの 990 μ L をサンプルに追加します。トリプシン/Lys-C ミックス (酵素: 基板の比 1: 100 w/w) の対応するボリュームを追加します。37 ° C、thermoshaker で一晩で孵化させなさい。</li>
</ol>10. クリーン アップ カートリッジ (プロトコル 2)
<ol><li>メタノールの 1 列-ボリューム (1 mL) のカートリッジを濡れています。1 列-水量 (1 mL) 80% アセトニ トリル/HPLC グレードのカートリッジをクリーニングし、流れを破棄します。0.1% ギ酸/HPLC グレードの水の 4 列-ボリューム (4 mL) とカートリッジを平衡させ、流れを破棄します。</li>
	<li>10% ギ酸の ph (酸塩基指示薬と pH チェック) 2-3 水 90 μ L 試料を酸性化します。酸性のサンプルを読み込むし、流れを収集します。(ない保持ペプチッドを含んでいる) 流れを再読み込みします。6 列-水量 (6 mL) 0.1% ギ酸/HPLC グレードのカートリッジを洗ってください。</li>
	<li>0.1% ギ酸 acid/50% アセトニ トリル/HPLC グレードの水の 1 列ボリューム (1 mL) のカートリッジからペプチドを溶出します。1.5 mL 遠心チューブに転送します。真空濃縮 (150 x g, 160 mBar で真空) を使用してサンプルを集中します。</li>
</ol>11. 等電集中 (プロトコル 2) による分別
注: ペプチドは、3 から 10 までの pH 範囲をカバー 13 cm 帯のゲルを分留を使用して彼らの等電点に従って分かれています。(以下に要約) サプライヤーによって提供される次のプロトコルを使用しました。
<ol><li>次のソリューションの準備: ソリューション (グリセロールの解決、60 μ L OFFGEL バッファーの超純水の 4.34 mL 600 μ) とソリューション (ソリューション a 1.776 mL) と純水の 444 μ B。</li>
	<li>IPG のストリップ、フレーム、および製造元の指示に従って電極を組み立てます。</li>
	<li>1.8 ml の液を各ウェルと B のソリューション * 追加 40 μ L のサンプルを再懸濁します。各ウェルに 150 μ L のサンプルをロードします。</li>
	<li>ペプチドの既定の方法を選択: OG12PE00 (ペプチド 3100 OFFGEL 低い解像度キット、pH 3-10、12 ウェル フレームで使用するための既定の方法を OFFGEL。このメソッドが完了した (~ 20 h) になるまで待ちます。正しくラベル付けされたチューブの分画を収集します。</li>
</ol>12. クリーンアップ ハーバード装置列逆 C18 ポスト IEF (プロトコル 2)
<ol><li>徐々 に 1% の時に数 μ L を追加サンプルを酸性化する各画分をイオン交換水で TFA。Ph 試験紙、pH は 3 程度以下を使用してチェックします。</li>
	<li>次のソリューションの準備: ソリューション (アセトニ トリル 5 mL、10 のギ酸の μ L、純水の 4.99 mL) 1 と解決方法 2 (0.5 mL のアセトニ トリル、ギ酸、純水の 9.49 mL の 10 μ L)。</li>
	<li>事前解決策 1 の 150 μ L とスピン列を濡れています。遠心分離 90 x g と流れを破棄 750 s。ソリューション 2 の 150 μ L とスピン列を洗います。遠心分離 90 x g と流れを破棄 750 s。</li>
	<li>列を端数を渡します。遠心分離 90 x g と流れを破棄 750 s。ソリューション 2 の 150 μ L で洗浄します。遠心分離 90 x g と流れを破棄 750 s。</li>
	<li>解決策 1 の 50 μ L の割合を溶出します。遠心分離 90 s 750 x g にはこれらの手順をもう一度繰り返します。</li>
	<li>(150 x g、真空 160 mBar) 真空濃縮を使用してドライ分数、-80 ° C で保存</li>
</ol>13. プロテオーム データおよび生物情報学の18の解析
<ol><li>ナノ LC MS によって得られるデータを分析/MS 質量 MaxQuant (バージョン 1.5.2.8) など定量化ソフトウェアとアンドロメダの検索エンジンを使用しています。</li>
	<li>タンパク質とペプチドとアミノ酸 7 の最小の長さの両方の 1% に虚偽の発見率 (FDR) を設定します。C ターミナルとして酵素特異性を設定 Arg とリス。プロリン債で 2 逃した劈開を許可します。変数の変更として固定変更および N 末端タンパク質アセチル化およびメチオニン酸化としてシステインの carbamidomethylation を選択します。</li>
	<li>さらに統計解析ソフトウェアを使用してデータを分析します。FunRich ソフトウェア (www.funrich.org/) を使用して機能性濃縮分析を実行します。デビッド ・ ソフトウェア (https://david.ncifcrf.gov/) を使用して遺伝子オントロジー濃縮分析を実行します。</li>
</ol>

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<li>Liebler, D. C., Ham, A. -J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+filter-based+sample+preparation+for+shotgun+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Spin filter-based sample preparation for shotgun proteomics.</a> Nature Methods. 6 (11), 785-786 (2009).</li>
<li>Hubner, N. C., Ren, S., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+separation+with+immobilized+pI+strips+is+an+attractive+alternative+to+in-gel+protein+digestion+for+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.</a> Proteomics. 8 (23-24), 4862-4872 (2008).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Informed-Proteomics%3A+open-source+software+package+for+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Informed-Proteomics: open-source software package for top-down proteomics.</a> Nature Methods. 14 (9), 909-914 (2017).</li>
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<li>Lengner, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+pre-X+inactivation+human+embryonic+stem+cells+under+physiological+oxygen+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Derivation of pre-X inactivation human embryonic stem cells under physiological oxygen concentrations.</a> Cell. 141 (5), 872-883 (2010).</li>
<li>Sidoli, S., Kulej, K., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+proteomics+is+not+the+new+genomics+and+the+future+of+mass+spectrometry+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Why proteomics is not the new genomics and the future of mass spectrometry in cell biology.</a> Journal of Cell Biology. 216 (1), 21-24 (2017).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

プロテオミクスは全細胞または細胞レベル下コンパートメントからの異なった蛋白質の表現を勉強する強力なツールで、セル換散のプロトコルの最適化とタンパク質の消化は、多くの研究によって対処されています。ゲルの消化力 (ポリアクリルアミド ゲルのマトリックス蛋白の消化)17、ソリューション18とフィルター支援サンプル準備19消化を含むメソッドの 3 つの主要なクラスがあります。最初は普遍的ないわばこの最後の方法は、低再現性とフィルター20の蛋白質の損失の可能性を展示する報告されています。ゲル内消化は可能であれば消化の効率を評価することは容易ではないという点で時間がかかり、不利にすることができます堅牢なメソッドです。ソリューションで消化はこの可能性を提供していますが、消化、IEF 後サンプルのクリーニングが必要です。これら 2 つのメソッドは、同じサンプル間比較されます、IEF 分別のプロトコルとソリューションの消化はよりゲル消化<sup class="xre...

大食細胞は自然免疫系細胞の数組織の恒常性は、細胞外マトリックス1の改造とアポトーシス細胞の除去を含む感染病原体に応答に至る生理機能に関与します。これらの細胞は、多くの可能なアクティベーション状態、偏波とも呼ばれますに変換する強力な表現型可塑性2によって特徴付けられます。これらの各種偏波の精密分子説明が大食細胞生物学3の分野で優先されます。それはいわゆる M1 ・ M2 の二分法、M1 プロ炎症性を表し M2 マクロファージ炎症を使用してこれらの分極を分類するために提案されている.このモデルは、急性感染症、アレルギー、肥満4など様々 な病理学的状況で適合します。しかし、慢性的な炎症を起こしている組織やがん、それ実証されていますこの分類は特定セルラ環境5,6,に存在するマクロファージ幅広い表現レパートリーを把握することができます。7します。 現在のコンセンサスは、多次元モデルを使用して、特定のアイソレータケージ信号8を統合するマクロファージの偏波がよりよく記述されています。この結論は、M1 ・ M2 モデルが得られた偏波9の記述で効率的であることを示す人間の大食細胞のトランスクリプトーム解析により確認されています。
研究は、ヒトのマクロファージで各種偏波のプロテオームの署名を取得するためのプロトコルを提供することを目的を発表しました。我々 は様々 な酸素濃度の環境下でヒトのマクロファージを区別し、ラベル無料定量化を実行する全体のマクロファージ プロテオームからペプチドを取得する方法について説明します。この数量は、様々 なタンパク質の発現レベルの比較をできます。幹細胞の研究は、環境キー パラメーター10として酸素の重要性を明らかにしたと私たちはこの組織パラメーターができるヒトのマクロファージ偏波にどのように影響を与えるかを理解ましょう。酸素の分圧は、20% がおよそ (正確な値は約 18.6% 水の存在をしながら細胞文化のインキュベーターでよく使用されるものに、人間の体で 3 (合計の大気圧) の 20% からの範囲に発見されています。考慮)。
前作は、肺胞間質性マクロファージ機能とは異なる、これらの違いが部分的に露出12が異なる酸素濃度のためおそらくビュー11の形態のポイントを示しています。さらに、骨髄由来マクロファージは、細菌12低酸素環境にさらされたときを phagocytize する能力の増大を示します。THP1 区別ヒトマクロファージ13、反対の効果が発見されているが、これらの結果は、大食細胞生物学のレギュレータを酸素には、人間の大食細胞の分子レベルでこの役割を明らかにする必要の考えを支持します。以前の研究では、これらの問題に対処するためのプロテオミクス手法を用いています。たくさんの蛋白質の発現量を同時に測定することにより我々 は偏波上の酸素の影響を強調表示され、新しい分子マーカーのリストを提供します。また、いくつかのマクロファージ機能にこれらの結果を関連することができた。特に、IL4 IL13 偏極マクロファージ、プロテオーム解析14によって明らかにされた ALOX15 のアップレギュレーションにリンクされていた」アポトーシス細胞の貪食能の率は増加したが分かった。本研究で我々 はこのような分析を実行する方法をについて説明します。

<table><tbody><tr><td>低酸素ワーキングステーション</td><td>オックスフォードオプトロニクス</td><td>Hypoxylab</td><td></td></tr><tr><td>C6 フローサイトメーター</td><td>BD</td><td>Accuri C6</td><td></td></tr><tr><td>尿素</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-6435</td><td></td></tr><tr><td>ギ酸 (FA)</td><td>ARISTAR</td><td>450122M</td><td></td></tr><tr><td>R-250 Coomassie blue</td><td>Biorad</td><td>1,610,436</td><td></td></tr><tr><td>リポ多糖類、大腸菌 (LPS)</td><td>Calbiochem</td><td>437627</td><td></td></tr><tr><td>2D クリーンアップ キット</td><td>GE Healthcare</td><td>80-6484-51</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium, glutamax supplement</td><td>Gibco</td><td>61870044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) Solution 100X</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>ハーバード 装置カラム リバース C18 マイクロスピンカラム</td><td>ハーバード装置</td><td>74-4601</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5 M, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td><td>Life Technologies</td><td>SAS NP0321 BOX</td><td></td></tr><tr><td>CD14 Microbeads ヒト</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>MACS 分離カラム LS</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>マクロファージコロニー刺激因子 (M-CSF)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-485</td><td></td></tr><tr><td>Interleukin 4 (IL4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-917</td><td></td></tr><tr><td>Interleukin 13 (IL13)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-410</td><td></td></tr><tr><td>インターフェロンガンマ (INF&γ;)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-482</td><td></td></tr><tr><td>CD14-FITC (クローン T&Uuml;K4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-701</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix チューブ ローテーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>トリフルオロ酢酸 (TFA)</td> <td>Pierce</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/Lys-C ミックス</td><td>PROMEGA</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>コンプリート ミニ、EDTA-フリー プロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>ロシュ</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>密度勾配溶液 (Histopaque 1077)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7089-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ヒト男性AB血漿(SAB)からのヒト血清</td><td>Sigma</td><td>Aldrich H4522-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)溶液 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9576-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Trisma-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-メルカプトエタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>Sigma Aldrich</td><td>114405</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) 20%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5030</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸アンモニウム</td><td>Sigma</td><td>Aldrich 9830</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34888</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>ヨードアセアミド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57670</td><td></td></tr><tr><td>チオ尿素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ BCA アッセイキット</td><td>ThermoFisher</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 滅菌プラスチックピペット</td><td>VWR</td><td>612-1685</td><td></td></tr><tr><td>サーモミキサー C エッペンドルフ</td><td>VWR</td><td>460-0223</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 逆相カートリッジ、100 mg</td><td>ウォーターズ</td><td>WAT036820</td><td></td></tr></tbody></table>

低酸素環境下におけるヒトのマクロファージ偏光のプロテオーム解析

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

大食細胞は自然免疫系細胞数感染病原体に応答から組織恒常性に至るまでの生理機能に関与します。これらの細胞の様々 な機能のアクティブ化の状態、また偏光と呼ばれる関連しています。これらの各種偏波の精密分子説明が大食細胞生物学の分野で優先されます。それは現在環境信号により偏光を制御する方法を説明する必要がある、多次元的なアプローチを認められています。本報告では、ヒトのマクロファージで各種偏波のプロテオームの署名を取得するためのプロトコルについて述べる.このプロトコルは、ゲル分別と Lys C/トリプシン消化細胞換散コンテンツから得られる大食細胞タンパク質発現のラベル無料数量に基づいています。またプロトコルに基づいてソリューションの消化との代替として使用する分画を中心に等電点を提供します。酸素濃度は、組織に関連する環境パラメーターは、このプロトコルを使用してどのように大気組成を探索するまたは低酸素環境マクロファージ偏波の分類に影響を与えます。

差動遠心分離によって得られた末梢血単核球 (PBMCs) から始まって、プロトコルにより、CD14 の人口の取得+単球フローサイトメトリー (図 1) で 98% 以上の純度の評価。これらの単球は第二各種偏波 (図 2) に区別されます。ゲルの分別を選択、SDS ページのゲルの移行が目的のバンド数を取得する適応とバンドを切除 (図 3)。消化は第二のゲルの摘出のバンドで実行されますし、ペプチドを抽出します。ペプチドはナノ LC (液体クロマトグラフィー) を使用して分析-タンデム質量分析計。MS/MS スペクトルは、知られていたペプチッド (図 4 a) のスペクトルの注釈によると様々 な蛋白質のアイデンティティを与えます。豊富なタンパク質の定量は、公開されたソフトウェアとデータベース<sup class="xre...

人間の大食細胞のプロテオーム署名を取得し、これをマクロファージ偏波に低酸素環境の影響の定量に適用するためのプロトコルを提案します。

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

したがって、この方法は、タンパク質レベルで様々な環境下での活性化の状態を特徴付ける方法など、マクロファージ生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、標識のない定量法を用いてヒトマクロファージにおける多くのタンパク質の発現を異なる方法で得る機会を提供することです。手順を実証することは、私の研究室からマリー・マリアーとマガリ裁判所になります。まず、15ミリリットルの密度勾配細胞分離溶液を2つの50ミリリットル遠心分離チューブのそれぞれに加え、LRSCを受ける前に溶液を室温まで温めることができます。密度は温度に依存するので、これは不可欠です。LRSCを50ミリリットルの遠心チューブに空にします。1x PBSを50ミリリットルまで加え、混ぜます。次に、非常にゆっくりと、平衡密度勾配溶液の15ミリリットルの上にミックスの25ミリリットルを追加します。この手順では、フェーズを混在させないように注意してください。血液は、この段階の妨害なしに密度勾配溶液に追加する必要があります。遠心分離チューブは、25分間、700Gで破断なし。密度勾配遠心分離の終わりに、下から上までの層は赤血球および顆粒球であり、ペレット、密度勾配溶液相、PBMCsの層、および希釈プラズマを形成する。ピペットを使用して、プラズマ相を吸引せずに通過します。次いで、PBMC層を新しい50ミリリットルの遠心チューブに集める。300 G.吸上機で10分間、PBMCに最大50ミリリットルの1x PBSを加え、上清を吸引し、40ミリリットルのマクロファージ培地でペレットを再中断します。マラセズチャンバーでPBMCsをカウチした後、実験を行うために必要な量のPBMCsを遠心チューブに移します。300 G.吸蔵で細胞を10分間遠心し、1000万PBMCsあたり80マイクロリットルの選別バッファーでペレットを再懸濁する。次に、1,000万PBCsあたり20マイクロリットルのCD14マイクロビーズを加えます。よく混ぜ、一定の攪拌の下で摂氏4度で15分間インキュベートします。インキュベーションに続いて、洗浄工程として1000万PBMCsにつき1ミリリットルの仕分けバッファーを加え、遠心分離機を以前のように加えます。その後、上清を吸引し、1億PBMCsあたり500マイクロリットルの仕分バッファーでペレットを再懸濁する。次に、セパレータの磁場に列を配置します。3ミリリットルの仕分けバッファーで列をすすいで準備します。セルのサスペンションを列に適用します。次に、必要に応じて、その後の染色のためにラベルなし細胞を含む流れを収集します。3ミリリットルの仕分けバッファーでカラムを3回洗います。柱を乾かさないで注意してください。次に、列の下にコレクション チューブを配置し、セパレータから取り外します。洗浄後、5ミリリットルの選別バッファーをカラムにピペットします。プランジャーをしっかりと柱に押し込み、磁気標識されたセルを直ちに洗い流します。最後に、単球をめっきし、テキストプロトコルに記載されているようにマクロファージ偏光を実行する前に、新しい列でこれらの手順を繰り返します。酸素制御環境で単球とマクロファージを維持し、低酸素状態解析を行います。実験中に所望の酸素分圧下の細胞を維持するために低酸素ワーキングステーションを使用してください。低酸素圧下で作業する場合、ステーションの下にすべての媒体と洗浄バッファーを準備し、液体中の正しい分圧を得るために十分に待つことが重要です。適合フードの下のバッファーで細胞のライシスを行います。4-12%ビストリスアクリルアミドゲルに各サンプルに300,000細胞の同等のタンパク質をロードします。電気泳動の持続時間を制御して、各タンパク質サンプルを6つのゲルバンドに分割できるようにします。テキストプロトコルに記載されているように固定して染色した後、きれいなメスでタンパク質バンドを切除します。500マイクロリットルチューブに入れる前に、切除されたバンドをダイスします。今度は、25ミリモルの重炭酸アンモニウム200マイクロリットルで3回、摂氏37度で20分間ゲルスライスを洗浄し、各ステップの間に重炭酸アンモニウムを捨てます。25ミリモル炭酸アンモニウムとアセトニトリルで1回の洗浄でこれに従ってください。次いで、100%アセトニトリル200マイクロリットルでゲル片を10分間脱水する。10ミリモルDTTと25ミリモル炭酸アンモニウムを56°Cで45分間インキュベートします。次に、DTTを廃棄し、室温で暗闇の中で25ミリモル重炭酸アンモニウム中55ミリモルヨウドアセトアミドでゲル片をインキュベートします。アルキル化を止めるには、使用した溶液を廃棄し、25ミリモル重炭酸アンモニウムで20ミリモルDTTの200マイクロリットルの各ゲル片を室温で10分間インキュベートします。25ミリモルの重炭酸アンモニウムの200マイクロリットルでゲル片を洗います。その後、100%アセトニトリルの200マイクロリットルで10分間脱水する。メーカーの指示に従ってトリプシン/Lys-Cミックスで摂氏37度で一晩タンパク質を消化します。得られたペプチドをゲル片から、低吸収チューブで50%アセトニトリル50マイクロリットルを15分間添加して抽出する。50マイクロリットルの5%のギ酸を15分間加えた後、100%アセトニトリルの50マイクロリットルを15分間加える。低吸収チューブで各画分を引っ張って乾燥させて、ペプチドの吸収とサンプル損失を制限します。テキスト プロトコルで詳しく説明されているように、さらに分析が行われるまで、サンプルを摂氏 80 度で保存します。ここに示されている代表的な純度は、CD14陽性単球の磁気ビーズ選択に続くフローサイトメトリーによって評価される。分化されたヒトマクロファージの位相コントラスト画像は、9日間培養した後の2つの異なる分極に対して得られた形態の不均一性を示す。銀染色SDSページゲルを用いたオフゲル消化の例を示す。細胞溶解および溶液内消化後のタンパク質の評価は、溶解中の分解の欠如と消化の効率を示す。ここに示す、正の2の電荷を有するMSスペクトル上の質量電荷比597.29で見られるペプチドの衝突誘発解離スペクトルの例を示す。このスペクトルから、対応する配列を決定した。解析後の最終結果は、微分発現タンパク質を使用するすべての偏光状態の階層的クラスタリングを表すヒートマップです。分析は、3%酸素状態のすべての分極で過剰発現するタンパク質のクラスターを明らかにします。この手順を試みる際には、プロトコルを適合させるために、新しいサンプルに対してどのような分数を実行するかを最初に決定する必要があることを覚えておく必要があります。この研究を用いたプロテオミクスアプローチは、マクロファージ生物学の偏光研究の分野で最後の年に使用されてきたゲノムアプローチと相補的である。その開発後、この技術は、免疫学の分野の研究者がヒトおよび他の哺乳類における免疫細胞の活性化のさまざまな状態を探求する道を開きます。DTTを使用することは危険である可能性があるので、この手順を行うには、適応されたフードの下で作業する必要があることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

記事は容易に簡単に適応を説明...

骨髄由来マクロファージを用いたマクロファージ分極の調査

単球由来のマクロファージは自然免疫系の重要な細胞である。ここでは、使用して簡単に説明する...

不定冠詞<em&gt;インビトロ</emヒトマクロファージの分化と偏光の不均一性を研究するために&gt;モデル

マクロファージは、宿主の病原性に関与する重要な細胞です。マクロファージは、プロテオミクス解析によって分析および検出できる表現型および機能的多様性を示します。この記事では、M1またはM2表現型に分化したヒトマクロファージの初代培養物の2D電気泳動を行う方法について説明します。...

2D電気泳動によるマクロファージのプロテオームプロファイリング

代謝リプログラミングは、M1およびM2マクロファージの分極のための特性的かつ前提条件です。この原稿では、マウス骨髄由来マクロファージにおける解糖系とミトコンドリア機能の基本パラメータを測定するためのアッセイについて説明します。このツールは、特定の要因がマクロファージの代謝と表現型にどのように影響するかを調査するために適用できます。...

リアルタイム細胞外フラックス分析を用いた偏光M1、M2の骨髄由来マクロファージの代謝特性評価

このプロトコルにより、研究者を分離し、特徴付ける組織居住者様々 なマクロファージ...

肥満に関連する炎症によって影響を受ける組織のマクロファージの精製と性質、分離

このプロトコルは、ヒトM1-またはM2偏光マクロファージにおける 結核...

ヒト単球由来M1とM2の分極化と 結核 菌感染時のフローサイトメトリーによる解析

M2様腫瘍関連マクロファージ(TAM)は、がんにおける腫瘍の進行および予後不良に関連している。このプロトコルは、14日以内にTHP-1単球様細胞をM2様マクロファージに再現的に分化し、偏光するための詳細なガイドとして機能します。このモデルは、腫瘍微小環境内におけるTAMの抗炎症効果を調べる基礎となる。...

ヒト単球様THP-1白血病細胞株を用いたM2様表現型へのマクロファージ分化と分極化

ここでは、 in vitroでのインプラント表面の免疫調節能力を評価するための詳細なプロトコルを提示し、現在のプロトコルの信頼性と再現性を向上させ、さらなる研究を促進することを目的としています。血中単球由来マクロファージを用いて分泌性サイトカインプロファイル、mRNA発現、細胞表面マーカーをモニターし、チタン上に培養されたマクロファージの分極を調べました。...

インプラント表面上のM1およびM2ヒト単球由来マクロファージの分極と特性評価 

単球とマクロファージは、健康と病気に不可欠な非常に可塑的で再プログラム可能な免疫細胞です。彼らは、特定の分化プログラムと表現型を採用することにより、幅広い刺激を感知し、反応します。私たちは、マクロファージの分極とリプログラミングを研究するためのin-vitroモデルを標準化し、研究に貴重なツールを提供しています。...

In-vitroアッセイのためのヒト単球由来マクロファージのリプログラミングモデル

ここでは、骨髄、脾臓、梗塞性心筋からマクロファージを抽出し、その後、生細胞の代謝フラックスを評価する方法を詳しく紹介します。...

脾臓および心臓マクロファージおよび骨髄単球における ex vivo 代謝フラックスの解析

学ぶ低酸素環境下でのヒトマクロファージ偏光のプロテオーム解析法。ラベルフリー定量を用いて活性化状態をタンパク質レベルで評価し、免疫学研究に有用なデータを提供する。

低酸素環境下におけるヒトのマクロファージ偏光のプロテオーム解析

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