Name: ナノ粒子追跡によるひと血中の細胞小胞単一の急速な蛍光特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶナノ粒子追跡分析法による人血中細胞外小胞の単一蛍光特性評価。遠心分離と蛍光染色を用いた迅速な分離・解析プロトコルで、高い再現性と多様なサンプルへの適応性を実現し、細胞外小胞生物学研究の可能性を広げます。

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著者は、部分的にこの作品の出版費用をカバーするため粒子メトリックス GmbH をありがとうございます。

デュッセルドルフ大学の機関の倫理委員会が本作で示した実験を承認 (参照数: 3381)。
1. EV ひと全血から分離
<ol><li>エキソソーム降水量ソリューションで Ev を分離します。<ol>
<li>静脈穿刺による血清分離管 (SST) のひと全血の 2 mL を収集し、凝固が完了するまでに 15 分間室温 (RT) のチューブを孵化させなさい。</li>
		<li>血清から細胞を分離し、血清 1 mL を反作用の管を 1.5 mL に転送する RT で 10 分の 1,700 x gで SST を遠心します。多血小板血漿 (PRP) を血小板を削除し、血小板貧しい血しょう (PPP) の 100 μ L を新しい 1.5 mL の反応管に転送 4 ° C で 15 分間 3,000 × gで遠心分離機します。</li>
		<li>エキソソーム降水量ソリューション (4 部 PPP、1 パーツ エキソソーム降水量ソリューション) と渦の 25 μ L を徹底的に追加します。氷の上で 30 分間サンプルをインキュベートします。チューブを直立した保つと回転か潜伏期間中にチューブをミックスします。</li>
		<li>EVs のペレットへの 4 ° C で 30 分間 1,500 × gのサンプルを遠心します。遠心分離後、EVs は、容器の底にベージュや白いペレットとして表示されます。上清を吸引し、1,500 × g 4 ° C で 5 分間のサンプルを遠心分離</li>
		<li>流体のすべてのトレースを削除し、再上下によくピペッティングによるリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 100 μ L でペレットを中断します。分析をすぐに実行しない-80 ° C で EV サスペンションを格納します。 注: プラズマから EVs を隔離するときフィブリノゲン、フィブリン妨げることができる効率的な回復と巻き上がりは重く、時間がかかります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>超遠心法で EVs を分離します。<ol>
<li>冷蔵庫やクールなダウンの使用前に遠心から予冷ローター (TLA 55 固定角度) を取る。</li>
		<li>キャップに適した 1.5 mL 遠心チューブに 1.25 mL (1.1 の手順で準備) PPP を転送し、4 ° C で 90 分 110,000 x gでサンプルを遠心分離開始する前にローター負荷バランスがとれていることを確認します。</li>
		<li>上清をデカントと場所管逆さま 2 分のペーパー タオルの上 500 μ L の PBS でペレットを再停止や、90 分の 4 ° C で 110,000 x gでサンプルを遠心</li>
		<li>上清を吸引し、50 μ L の PBS でペレットを再停止します。 注: は、ローターと超遠心機、使用するために設計されたアクセサリーのみを使用します。回転子の管は、ロット間の管の強度が異なるために、水を使用して事前にテストします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. サンプルの染色
<ol><li>PKH67 試料を染色します。<ol>
<li>50 μ L の希釈 C (キットに付属) を PKH67 エタノール色素溶液の 1 μ L の追加によっての染色液を 1.5 mL の反応管とミックスで徹底的に準備します。</li>
		<li>染色液の 10 μ L を反応管に EV 停止 (1.1 の手順で準備) の 20 μ L に転送、混和、暗闇の中で室温で 5 分間インキュベートします。</li>
		<li>15 mL の反応管内の水を 2.5 mL の蒸留水でステンド グラスの EV の懸濁液 50 μ L を希釈、徹底的に、ミックス、粒子計測のこの最終的な懸濁液を使用します。 注: それは他の希釈剤 (例えばPBS) 測定を損なうことができるので EV サスペンションの希釈剤として水を使用する重要です。EV 懸濁液を保存を使用して、氷のサンプルを解凍し、染色する前に徹底的に混ぜます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>特定の抗体のサンプルを染色します。<ol>
<li>徹底的に 50 μ L の純水 1.5 mL の反応管とミックスの EV 懸濁液 (1.1 の手順で準備) の 10-20 μ L を希釈します。</li>
		<li>反応管に特異的抗体 (表 1) の 2.5 5 μ L を追加、徹底的に、ミックス、暗闇の中で室温で 30 分間インキュベートします。</li>
		<li>2.5-10 mL の反作用の管を 15 mL の蒸留水 (表 1) にステンド グラスの EV 懸濁液 50 μ L を転送、徹底的に、ミックス、粒子計測用のこの最終的な懸濁液を使用します。 注: いくつかの状況下で使用される抗体の集中する必要があります (表 1) を調整します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. サンプルの処理
注: このメソッドの基本広く記述されていた以前とプロトコル焦点を当てて下蛍光標識 EVs14の分析に必要な具体的な手順。
<ol><li>スタートアップ プロシージャを実行します。<ol>
<li>蛍光フィルターを顕微鏡とカメラの光路に押し込みます。プログラムを起動し、自動実装の画面の指示に従います。</li>
		<li>蛍光測定用「細胞チェック」のタブ (セル定義) で正しい携帯番号 (Z158_C1149_Fluor) を選択します。光学顕微鏡とレーザでは、共通のフォーカス (レーザー、顕微鏡をこの位置に自動的に移動) を確認するための参照位置を選択します。</li>
		<li>蒸留水 10 ml 注射器でセルのチャネルをフラッシュします。測定セルを気泡の自由ことを確認し、システムに空気の泡を挿入しません。</li>
		<li>粒子を含む均一 200 nm サイズの蛍光標識されたポリスチレン表面にカルボキシル基を持つ校正の懸濁液を準備します。990 μ の粒子の希薄の 10 μ L の蒸留水。必要な濃度を取得する蒸留水 10 mL で 15 mL チューブにこの粉液の 10 μ L を希釈しています。</li>
		<li>セルのチャネルで希釈された粒子溶液 2.5 mL を注入し、「フォーカスを最適化する」をクリックして、カメラを調整します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>サンプルを測定します。<ol>
<li>各試料の測定前に蒸留水 10 ml 注射器で複数回のセルのチャネルをフラッシュします。セルのチャネルにステンド グラスの EV の懸濁液 (ステップ 2 で作成) を挿入します。</li>
		<li>必要な (表 2)、ソフトウェアの「セル チェック」タブで以下の主なカメラ パラメーターを調整します。基準位置を使用するか、パラメーターを調整する 0.41193 を配置します。<ol>
<li>感度、最適な感度の範囲を見つける「粒子対感度の番号」ボタンをクリックして各画面別の感度レベルの測定粒子曲線を表示します。 メモ:</li>
			<li>シャッターは、カメラが断固としたな間隔を通過する光を可能にする時間の期間を調整します。</li>
			<li>買収後パラメーター選択 20、20 の最小サイズの最小の明るさ nm、および 500 の最大サイズ測定の nm。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ディスプレイからの視野でカウント検出されたパーティクルの数に注意してください。散乱バーは、オレンジ色の範囲 (50-300 粒) に緑でなければなりません。散乱のバーが赤の場合、散布図は個々 の粒子を融合し、彼らが偽の結果につながる 1 つの単一粒子としてカウントされます。このような場合は、さらに粒子の重複を避けるためにサンプルの希釈や感度を下げます。</li>
		<li>測定を開始する前に「セル チェック」タブで「0 V で粒子ドリフトをチェックする」をクリックしてします。ドリフトが 5 μ m/s 以上の場合、サンプル測定を続行するフローが停止するまで待ちます。 注: 測定の始めでドリフトが大きすぎる場合繰り返し測定できます異なるし、結果を高度化します。NTA の原則により関連するドリフトは、ソフトウェアによって計算された、断固とした粒径に影響を与えるをかもしれません。</li>
		<li>「計測」タブで「ビデオ集録の実行」をクリックしては、実験 (3-5) の数とそれら (0 分) 間の遅延時間を選択します。</li>
		<li>(個々 の subvolume-) (11) の位置の数と粒子を分析し、各測定位置でサイクル (測定) (10) の数を定義します。</li>
		<li>フォルダーを選択、新しいファイル名を作成し、測定を開始する"OK"をクリックします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 結果の解釈
<ol><li>「分析」タブで測定後結果とパラメーターを表示します。セルのチャネルをクリーニングする前に解析した後次のパラメーターをチェック: 位置、トレースされた粒子および粒子濃度、粒子 (x10、x50、x90 値) の分布幅の合計数あたり粒子の数の平均値の値平均と標準偏差。必要な場合は、サンプルの測定を繰り返します。 注: 結果も .pdf ファイルまたは .txt ファイルとして保存されます。</li>
	<li>サイズにより検出された粒子の分布を示します測定後計算グラフを表示する"分析] タブをクリックします。「分析」タブの「表示」をクリックして、アイコン使用調整し、特定の要件のグラフの設定を変更します。</li>
</ol>5. 西部にしみが付くことによって検出を介してEV 検証
<ol><li>RIPA 溶解し抽出バッファーで EV ペレット (ステップ 1 で作成) を解散、徹底的にピペットし、ライセートを明確にし、上清を新しいチューブに転送する氷上で 30 分間 4 ° C で 10 分間遠心する 8,000 の x gでサンプル間加温します。</li>
	<li>Lowry 蛋白質の試金キット総蛋白を測定します。RIPA バッファーの 49 μ L の分離 EV 懸濁液 1 μ L を希釈し、トリプリケートで 5 μ L を使用して、分析のため。EV 懸濁液 2 μ g/μ L と 95 ° C で 10 分間の熱の最終濃度 2 x Laemmli 読み込みバッファーを希釈します。</li>
	<li>ウェルあたり蛋白質の 20 μ g をロードします。分離し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動とタンクの標準的なプロトコルによるとしみが付くことによって蛋白質を転送します。</li>
	<li>常温 1 時間牛のミルク パウダー (5%) を膜 (0.2 μ m ポリフッ化ビニリデン二フッ化) をブロックし、4 ° C で一晩特定の一次抗体 (CD9 や CD63、ビメンチン) と膜をインキュベート 注: 一次抗体は、縮尺の希釈に使用されます。</li>
	<li>Tbst 膜を洗浄する 3 × 5 分西洋ワサビペルオキシダーゼ (HRP) の膜をインキュベートし、-共役二次抗体 (1:20, 000 TBST) 室温 60 分</li>
	<li>Tbst 膜を洗浄する 3 × 5 分と化学発光イメージング システムの感度が高い基板ソリューションによって蛋白質を検出します。 注: CD63 抗原は広範囲で、必ずグリコ、分子量は異なるが、40-65 kDa 間バンドを表示できるので。</li>
</ol>

<ol><li>Ibrahim, A., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+Fundamental+Biology+and+Roles+in+Cardiovascular+Physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Exosomes: Fundamental Biology and Roles in Cardiovascular Physiology.</a> Annual Review of Physiology. 78, 67-83 (2016).</li>
<li>Su, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+exosome-mediated+intercellular+communication+in+vascular+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Emerging role of exosome-mediated intercellular communication in vascular remodeling.</a> Oncotarget. 8 (15), 25700-25712 (2017).</li>
<li>Lasser, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+saliva%2C+plasma+and+breast+milk+exosomes+contain+RNA%3A+uptake+by+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human saliva, plasma and breast milk exosomes contain RNA: uptake by macrophages.</a> Journal of Translational Medicine. 9, 9(2011).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+RNA+content+of+the+exosomes+derived+from+blood+serum+and+urine+and+its+potential+as+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+The+Royal+Society+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Analysis of the RNA content of the exosomes derived from blood serum and urine and its potential as biomarkers.</a> Philosophical Transactions of The Royal Society B Biological Sciences. 369 (1652), (2014).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+novel+biomarkers+for+clinical+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Scientific+World+Journal%22%5BJournal%5D)">Exosomes: novel biomarkers for clinical diagnosis.</a> The Scientific World Journal. 2015, 657086(2015).</li>
<li>Properzi, F., Logozzi, M., Fais, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+the+future+of+biomarkers+in+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarkers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Exosomes: the future of biomarkers in medicine.</a> Biomarkers in Medicine. 7 (5), 769-778 (2013).</li>
<li>Thery, C., Zitvogel, L., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+composition%2C+biogenesis+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Exosomes: composition, biogenesis and function.</a> Nature Reviews Immunology. 2 (8), 569-579 (2002).</li>
<li>De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+exosomes+in+normal+and+pathological+conditions%3A+new+insights+for+diagnosis+and+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications.</a> Frontiers in Immunology. 6, 203(2015).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 3 Unit 3 22 (2006).</li>
<li>Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+for+the+analysis+of+extracellular+vesicles+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li>
<li>Wu, Y., Deng, W., Klinke, D. J. 2nd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+improved+methods+to+characterize+their+morphology%2C+RNA+content%2C+and+surface+protein+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Exosomes: improved methods to characterize their morphology, RNA content, and surface protein biomarkers.</a> Analyst. 140 (19), 6631-6642 (2015).</li>
<li>Bianco, N. R., Kim, S. H., Morelli, A. E., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+immune+response+using+dendritic+cell-derived+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modulation of the immune response using dendritic cell-derived exosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 380, 443-455 (2007).</li>
<li>Conde-Vancells, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+comprehensive+proteome+profiling+of+exosomes+secreted+by+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization and comprehensive proteome profiling of exosomes secreted by hepatocytes.</a> Journal of Proteome Research. 7 (12), 5157-5166 (2008).</li>
<li>Mehdiani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+innovative+method+for+exosome+quantification+and+size+measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An innovative method for exosome quantification and size measurement.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), 50974(2015).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

追跡分析蛍光ナノ粒子の全血、特定の表面のマーカーの高速特性評価から EVs の隔離のための詳しいプロトコルを示します。実験を行った我々 は専ら血清試料から分離された EVs を使用されるが、このメソッドは、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、繊維素プラズマに適しても、唾液、母乳、尿などの体液にも拡張することができます。脳脊髄液と精液。さらに、このプロトコルは細胞培養上清から Ev の特性を調整できます。軽く 30 に至る粒子サイズによるとエクソソームと EVs を沈殿させる独自の高分子を含むエキソソーム沈殿試薬を用いる血清中の 100 μ L から生成された EV 停止このプロトコルで 200 nm nm という 10-20 μ LEVs の各表面マーカーの解析のために任命されました。残念ながら、(例えばアルブミンとグロブリン) の血清サンプル中のタンパク質の高額と背景と洗練された調査結果の高レベルの結果をプロシージャを汚す抗体と干渉するので、分離のステップは避けられない。さらに、サンプルでエクソソームの生物の可用性に基づいて、雇われた EV 懸濁液として処理する前に希釈の量必要があります調整する他の原料の。複数のサンプルを比較すると、一貫した取得パラメーター (感度、シャッター等)と同様に、サンプルの希釈のための標準化されたアプローチが必要です。もう一つの重要なポイントはドリフトが (私たちの手は、< 5 μ m/s) で低になるまでは、測定は開始されません。ドリフトは余りに高かった、試料の繰り返し測定が彼ら自身の中の高い標準偏差を得られたが、低ドリフトで結果のデータは極めて一貫して、高レベルの再現性を確認しました。選択した抗体が適切な螢光色素を持つことが重要です。FITC 写真漂白の高率を持っているので、抗体を Alexa Fluor 488 と共役する必要があります。おそらくより安定した fluophores が確かに安定につながる増加アッセイ、将来的に。多くの研究者が EVs.の希釈剤として PBS を使用して通常、このプロトコルでは、EV の懸濁液の希釈剤として蒸留水を使用することが重要です。測定を妨げることができます EVs が蛍光染料、高浸透圧、イオン濃度、PBS などの他の希釈剤と分類されるときにつながる変更結果。
EVs の分析方法は、最後の 10 年間でかなり改善されてきましたが、そこはまだ EVs.の分離とそのための標準化された方法フローサイトメトリー、EVs が頻繁にバインドされているビーズより大きい表面を提供するための主要な不利な点は多く EVs ドック10強いと検知信号を提供するために表面上にあります。SEM および TEM のサンプル準備は時間のかかる、EVs は、サイズおよび形態11でのみ区別できる短所があります。日付に、質的 (すなわち、生化学) の best-established と一般的に使用されるメソッド EV の特性は西部のしみが付くこと、特異抗体12,13とタンパク質を解析することができます。しかし、これらすべてのメソッドの欠点は、特定の表面のマーカーの 1 つの EVs を分析することができないことにあります。さらに、処理時間が長いと長い洗浄/分離のプロシージャの現在のプロトコルの多くで使用される手順は労働集約的、高いサンプル スループットと単一の EVs.の評価には適していませんように我々 のプロトコル CD63、CD9、ビメンチン、CD107a などの特定の表面マーカーと 1 台の EVs の迅速な分離と性質の完全なワークフローを提供しますの原因を特定する他の表面のマーカーの広いスペクトルのための拡張可能とリリースされた EVs.国税庁デバイスの永続的な技術進歩のため最新のアナライザーを持つメーカーとの連携では調査結果を確認しました。EV 生物学、特に、エクソソームをに関する研究の今後の進展に関係なくここに提示されるプロトコルは特定のマーカーと 1 台の EVs の特性に対する迅速かつ信頼性の高い方法を提供します。将来研究する必要があります EV 凝集を予防し、EVs.の蛍光ラベルの正確なサイズ測定を有効にする方法の開発に焦点を分離および汚損プロシージャ中に EVs の集計は今のところ避けられないので

エクソソームを含む細胞小胞 (Ev) が特殊な膜ナノ小胞 (20-150 nm) のような他の機能のゾル性細胞質の部品と同様、脂質、接着と細胞間シグナル分子の特定の組み合わせを含むマイクロ Rna (miRNA) と mRNA 細胞細胞コミュニケーション1,2の調節に重要な役割を果たして.EVs が多くの異なる種類の細胞、血管内皮細胞など、免疫細胞、腫瘍細胞から自分の環境で解放され、血清の精液、尿、母乳、唾液、または髄液3,などの体液で検出することができます。4. 研究の増加数は、EVs のいくつかの疾患の早期診断および/または疾患進行5,6の予測の潜在的なバイオ マーカーとしての多様な貢献を強調表示します。エクソソームは、関連付けられている具体的には、7からの派生セルの種類に関係なく分子の存在によって呼ばれます。たとえば、エクソソームは別 tetraspanins (CD63、CD9 CD81) を含む、主要な組織適合性の複雑なクラス私 (MHC 私) 分子、様々 な膜貫通タンパク質多胞体 (関与する典型的なゾル性細胞質蛋白質 (チューブリンとアクチン) 分子MVB) 生合成 (TSG101 とアリックス)、熱ショックタンパク質 (HSP 70、HSP 90) とに参加しているタンパク質シグナル伝達 (タンパク質キナーゼ)8。
多くの異なる方法は、EVs9の特性について記載されています。EV 分析に使用される最も一般的で普及している方法は、流れ cytometry10、走査電子顕微鏡 (SEM) と透過電子顕微鏡 (TEM)11です。EV コンテンツの生化学的特性に対する best-established と一般的に使用される方法は、ウエスタンブロット12,13です。SEM および TEM 全体サイズ スペクトルにわたって EVs の検知を可能にする、特定の表面蛋白質の非常に限られた身分証明書はこれらのメソッドの特定の不利な。対照的に、フローサイトメトリーは特定の EV 表面マーカーを識別するための強力なツールが、このメソッドのしきい値制限 500 より大きいサイズで EVs に分析 nm。したがって、特定の表面マーカーの検出と分離の EVs の分析は現在これらの 3 つの確立されたメソッドのいずれかを介してアクセス可能ではありません。以前別高感度可視化ナノ粒子追跡分析を行う (NTA)14EVs の解析法について述べる。簡単に、このメソッドは、2 つの異なる物理原則を組み合わせます。まず、粒子はレーザー光線で照射し、ブラウン運動、として知られている第二の原則は、液体の懸濁液の異なる粒子の拡散のサイズに反比例することを意味したとき光が散乱します。液体試料の半自動デスクトップ ナノ粒子解析装置は、粒子追跡ソフトウェア ベースの分析では、アナライザー単一粒子からの散乱光のデジタル画像が記録される場所で構成されます。粒子と粒子の動きはビデオ カメラとレーザ散乱顕微鏡で検出されます。レーザー光線の向きが垂直、光軸は水平で満ちているサンプル セルのチャネルに焦点を当てたです。散乱光のスポットのプロットと運動の速度によって提供されるデータは、全粒子数とサイズ分布の決定を有効にします。レーザーを照射後、粒子散乱は光顕微鏡14デジタル ビデオ カメラで記録。私たち前者への進歩はレーザーの間 500 nm ロングパス波 (LWP) カット フィルターの挿入 (波長 488 nm) および蛍光標識粒子 (図 1) の直接分析を可能にするセルのチャネル。我々 のプロトコルなど、彼らの親の起源によると、EVs が 1 の高速特性評価のためのこの分野で多くの研究者の共通の要求に対処します。このプロトコルでは蛍光を用いたナノ粒子追跡によるひと全血から Ev の急速な隔離と特定のマーカーの高速特性評価のための完全なワークフローを説明します。EVs は、特定の exosomal マーカーなどCD63、CD9、およびビメンチンと同様 PKH67、一般的な細胞膜リンカーとの汚損によって検出できます。我々 のプロトコルは、EDTA とクエン酸のプラズマと同様、他の体液と細胞培養上清に適していますも。

<table><tbody><tr><td>血清分離チューブ</td><td>BD</td><td>366882</td><td>BD Vacutainer</td></tr><tr><td>Ampuwa 水</td><td>Fresenius Kabi</td><td>10060</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate-buffered saline</td><td>Sigma</td><td>56064C</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tube, 15 mL</td><td>Greiner Bio One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tube, 50 mL</td><td>Greiner Bio One</td><td>227270</td><td></td></tr><tr><td>微量遠心分離機チューブ、1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td>超遠心分離用特殊チューブ</td></tr><tr><td>スナップオンキャップ付きチューブ 1.5 mL</td><td>ベックマン・コールター</td><td>357448</td><td></td></tr><tr><td>ポリビーズ マイクロスフィア 0.2 & マイクロ;m</td><td>Polysciences, Inc. (英語)</td><td>7304</td><td>アライメント ソリューション</td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG カルボン酸マイクロスフェア ビーズ 0.2 & マイクロ;m</td><td>Polysciences, Inc. (英語)</td><td>09834-10</td><td>アライメント溶液</td></tr><tr><td>シリンジ、2 mL</td><td>Braun</td><td>4606027V</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ、10 mL</td><td>Braun</td><td>4606728V</td><td></td></tr><tr><td>Exoquick</td><td>SBI</td><td>EXOQ20A-1</td><td>EV 沈殿液</td></tr><tr><td>Laemlmli サンプルバッファー (2x)</td><td>BioRad</td><td>1610737</td><td></td></tr><tr><td>DC Protein Assay Kit II</td><td>BioRad</td><td>5000112</td><td>Lowry prtein Assay</td></tr><tr><td>PKH67 緑色蛍光細胞リンカーキット</td><td>Sigma</td><td>PKH67GL-1KT</td><td>一般メンブレンラベリング用</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗ヒト CD107a 抗体</td><td>BioLegend</td><td>328609</td><td>リソソーム関連膜タンパク質-1 (LAMP-1)</td></tr><tr><td>ヒト CD9-Alexa Fluor 488</td><td>R&Dシステム</td><td>FAB1880G</td><td></td></tr><tr><td>抗CD9抗体SBI</td><td></td><td>EXOAB-CD9A-1</td><td></td></tr><tr><td>CD63-Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>MA5-18149</td><td></td></tr><tr><td>FITC抗ヒトCD63抗体</td><td>BioLegend</td><td>353005</td><td></td></tr><tr><td>CD63.抗体、ポリクローナル</td><td>SantaCruz</td><td>Sc-15363</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 抗ビメンチン抗体</td><td>BioLegend</td><td>677809</td><td></td></tr><tr><td>抗ビメンチン抗体</td><td>SBI</td><td>EXOAB-VMTN-1</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス IgG + IgM</td><td>ジャクソン免疫</td><td>315-035-048</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギ IgG</td><td>Dianova</td><td>111-035-003</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Femto最大感度 基板</td><td>サーモフィッシャー</td><td>34094</td><td></td></tr><tr><td>ゼータビュー</td><td>粒子測定機</td><td>PMX 100, タイプ</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td>オプティマ MAX-XP</td><td></td></tr><tr><td>化学発光イメージャー</td><td>GE ヘルスケア</td><td>アマシャム イメージャー 600</td><td></td></tr></tbody></table>

ナノ粒子追跡によるひと血中の細胞小胞単一の急速な蛍光特性評価

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

エクソソームを含む細胞小胞 (Ev) が体液恒常多くのセル型から解放され、細胞間コミュニケーションとの多様な範囲の調節に重要な役割を果たすことは、特殊な膜性ナノサイズ ベシクル生物学的プロセス。電気自動車の特性のための多くの異なる方法が記載されています。ただし、これらのメソッドのほとんどは、作製とサンプルの評価が非常に時間がかかる、それはサイズが小さいため、離散の不足のための興味の特定のマーカーを分析する非常に困難欠点を持っています。集団。EVs の分析方法は、最後の 10 年間でかなり改善されてきましたが、ないまだある 1 つの EVs.の特性に対する標準化された方法ここでは、蛍光を用いたナノ粒子追跡による 1 台の EVs の特性に対する半自動化された方法を示します。提示プロトコルこの分野で多くの研究者の共通の問題に対処、EVs とキャラクタリゼーション PKH67、一般的な細胞膜リンカーとともに、このような特定の表面マーカーの急速な隔離のため、完全なワークフローを提供しますCD63、CD9、ビメンチン、リソソーム膜蛋白質 1 (ランプ-1) として提示を示した高レベルの再現性、西部にしみが付くことなど、他の方法によって確認されました。実験を行った我々 は専らひと血清試料から分離された EVs を使用がこのメソッドは、プラズマやその他の体液に適しても、細胞培養上清から Ev の特性に合わせて調整できます。EV 生物学に関する研究の今後の進展に関係なくは、ここに提示されるプロトコルは、特定のマーカーと 1 台の EVs の急速な特性に対する迅速かつ信頼性の高い方法を提供します。

EVs は全血から分離され、ナノ粒子蛍光試薬と分析の追跡によって特徴付けられます。実験中に 70% の範囲に無染色の粒子の測定に最適な感度は識別されました。調整と測定の校正に使用される蛍光のビーズは、感度は 85% (図 2 a) で最適な設定を示した。感度は 70% と 90% の間粒子の数は再ドロップ粒子径分布の悪化につながることができますさらに感度を増加させる検出されたパーティクルの数が急速に増加。カメラの設定は (図 2 b) シャープな画像を表示され、繰り返し測定低標準偏差 (図 2) を示した。限り、すべての測定値が同じ設定 (表 2) で実施されるように、EVs のサンプルを処理するためのプロトコルが調整されました。分布幅は x 軸、x10、x50、x90 の 3 つの値によって定義されます。X50、または平均粒子径は、その人口の半分はこの値の下にある直径です。同様に、x10 と x90 では、10% と検出された粒子の 90% が報告されたサイズ下径を示します。感度との数の強い相関を示した長い脂肪族の尾を持つ緑色蛍光色素が細胞膜の脂質領域組み込ま蛍光細胞リンカーを含む PKH67 細胞リンカー キットと染色粒子の測定 (図 3 a)。PKH67 は拡散を監視するために用いられるが、また生体内で細胞が人身売買に関しては同様のエキソソームやリポソーム取り込みを監視するために役立っています。PKH67 の非特異的ラベリングによりさまざまな EVs をラベルし、検出できます。粒子の分布は、266 nm (x10) そして 1946 年 nm (x90) 857 で最大のピーク間の範囲 nm (x50) と測定間の低い標準偏差 (28.1 nm)。ランプ-1 として知られているリソソーム膜糖タンパク質 1 と CD107a に存在ライソゾーム膜を主に渡る。粒子の分布範囲 220 nm (x10) に 1145 nm (x90) 541 で最大ピークから染色、Alexa Fluor 488 ランプ 1 に対する特異抗体にラベルを付けて、nm (x50)、標準偏差は各々 11.7 nm (図 3 b)。EVs の特性評価、我々 は Alexa Fluor 488 共通 exosomal マーカーに対する抗体を標識を使用して西部にしみが付くことによって我々 の調査結果を確認しました。Alexa Fluor 488 標識 CD9 抗体で染色後粒子の分布範囲は 251 nm (x10) に 1139 nm (x90) 548 で最大ピークから nm と約 25 秒マイナー ピーク nm (図 4 a)。CD63 Alexa Fluor 488 染色ラベル (図 4 b) とビメンチン (図 4) 同様の結果が得られました。ウエスタンブロット分析では、ここで使用される抗体のための私達の肯定的な結果を実証しました。繰り返し測定では、このレポートで使用されるすべての抗体のため再現性のある結果を示した。コントロールとどこ PKH67 と LAMP1 事実上抗体ない EV 最大 100% に近い感度それぞれ抗体 (図 5 a) と小胞無料水を汚します。サンプルが本質的に自由粒子の場合でも、新たな工芸品の数の増加を高感度ビメンチンの例を使用するには。測定が開始されると、ドリフトまだ高すぎるかどうか (&gt; 5 μ m/s)、個々 の繰り返しはっきりと自身 (図 5 b) の間で逸脱。3 つの異なる抗体と表される、測定を開始する前にドリフトが可能な限り最小限が重要です。私たちの経験によると、正確かつ再現性のある FITC であるため急速な写真漂白 (図 5) になりやすい測定結果螢光色素としてかに (FITC) を使用します。したがって、排他的 Alexa Fluor 488 EV の特性評価のための抗体を標識の使用をお勧めします。このプロトコルで EVs はポリエチレング リコールを含むポリマー ベース エキソソーム降水量ソリューションにより分離しました。我々 の結果は応用分離法による虚偽のないことを確保するため、EVs を遠心分離後特徴付けられます。エキソソーム降水量ソリューション (図 6 a)、応用分離の結果、遠心分離でEVs (図 6B に匹敵する PKH67 と 2 つの異なった抗体 (CD63 とランプ 1) で表される、します。).残念ながら、遠心後の EVs の貧しい収率のためはっきりと高いエキソソーム降水量ソリューションを分離する分離のための血清の初期設定する必要があります比較します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58731/58731fig1.jpg"> 図 1: ナノ粒子追跡の分析の概略設定します。顕微鏡/ビデオの軸とレーザーのビームはセルで交差、互いに直交指向チャネルの断面。セルのチャネルと、顕微鏡と蛍光フィルターを設置します。粒子からの散乱光は、ソフトウェアの「ライブを見る」ウィンドウに表示されます。買収は、サイズ分布曲線座標系として結果が表示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58731/58731fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58731/58731fig2.jpg"> 図 2: 校正蛍光標識ビーズ。(A) 感度曲線と粒子数自動感度スキャン中に時間がある時点で 1 つの位置で粒子を表示されます。ライブビュー画面で粒子の可視化 (B)。(C) 粒子サイズの繰り返し測定後の分布。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58731/58731fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58731/58731fig3.jpg"> 図 3: 代表結果 PKH67 とランプ 1 染色後。粒子対感度曲線 (1) (3) PKH67 で染色後のライブビュー画面 (2) と粒度分布で粒子の可視化の数 (A) とランプ-1 (B)。鉛を検出した異物の似ていますが、まだ全く同一ではない変更に設定感度の変化しながら、粒子のようなサイズ分布を観察します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58731/58731fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58731/58731fig4.jpg"> 図 4: 代表結果 CD9、CD63、およびビメンチン ラベル Alexa Fluor 488 染色後。粒子対感度曲線 (1)、(4) の CD9 ライブビュー画面 (2)、粒度分布 (3) 2 つの異なる EV 懸濁液の代表的な西部のしみの粒子の可視化の数 ( A24-27 kDa) CD63 (26 kDaB) とビメンチン (54 kDa、 C)。粒子の遅い発生信号増加感度 (x 軸) に沿って西部の低い信号強度との相関のしみの分析、(例えばビメンチン対それぞれ粒子表面マーカーのより低い量を確認します。CD63)。高再現性 (3) を示す分析のすべてのマーカーに対して代表的な測定値のほぼ同じカーブに注意してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58731/58731fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58731/58731fig5.jpg"> 図 5: 代表が使用されるコントロールのエラー ソースの可能性結果します。(A) 小胞無料水染色 PKH67 (1) ランプ-1 (2) と (3) コントロールとしてビメンチン。ランプ-1 (1) CD63 と染色後 (B) 代表的な粒子径分布 (2) と CD9 (3) 懸濁液のドリフトがまだ高すぎると測定を行い。(C) 粒子対感度曲線 (1) および (2) CD63 の FITC 標識抗体で染色後の粒度分布の数徐々 に低い粒子数の結果、各測定後、漂白効果が観察されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58731/58731fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58731/58731fig6.jpg"> 図 6: EVs さまざまな分離法の比較。PKH67 で染色後エキソソーム降水量ソリューション (A) と (B) 遠心分離した EVs の粒度分布 (1) CD63 とランプ 1 (2) (3)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58731/58731fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>ランプ 1</td>
			<td>CD9</td>
			<td>CD63</td>
			<td>ビメンチン</td>
		</tr>
<tr>
<td>抗体 (μ L)</td>
			<td>5</td>
			<td>2.5-5</td>
			<td>2.5-5</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>EV 停止 (μ L)</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>H2O (μ L) 染色</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>最終巻 (mL)</td>
			<td>5-10</td>
			<td>2.5-5</td>
			<td>5</td>
			<td>10</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 使用される抗体の希釈サンプル範囲のサンプル リストです。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>集録パラメーター</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>感度 (%)</td>
			<td>85</td>
		</tr>
<tr>
<td>シャッター</td>
			<td>70</td>
		</tr>
<tr>
<td>分の明るさ</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>Max。サイズ (nm)</td>
			<td>500</td>
		</tr>
<tr>
<td>最小サイズ (nm)</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>極性</td>
			<td>否定的です</td>
		</tr>
<tr>
<td>電圧</td>
			<td>オフ</td>
		</tr>
<tr>
<td>0 V で粒子ドリフト (μ m/s)</td>
			<td>&lt; 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>位置</td>
			<td>11</td>
		</tr>
<tr>
<td>サイクル</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>複数の買収</td>
			<td>3-5</td>
		</tr>
<tr>
<td>遅延時間 (分)</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2:ナノ粒子追跡の分析のパラメーターを取得します。

このプロトコルでは蛍光を用いたナノ粒子追跡によるひと全血から細胞小胞の迅速な分離と特定のマーカーの特性の完全なワークフローを説明します。結果が発表される高レベルの再現性を示し細胞培養上清に調整することができます。

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

この方法は、現場で共通の問題に対処し、関心のある特定のマーカーを持つ単一の細胞外小胞を迅速に分離し、特性を定める完全なワークフローを提供します。ナノ粒子追跡解析は、半自動化された方法です。これは、光散乱とブラウン運動の特性を利用して、細胞外小胞のサイズ分布を分析します。この手順のデモンストレーションは、当研究室の博士課程の学生、ベラ・シュミットです。細胞外小胞を単離するために、ヒト全血の2ミリリットルサンプルを血清分離管に集めた後、遠心分離によって細胞を血清から分離する前に、試料を室温で15分間凝集させる。各サンプルから1ミリリットルの血清を個々の1.5ミリリットル反応チューブに移して遠心分離して血小板を除去し、血小板不良血漿の100マイクロリットルを新しい1.5ミリリットル反応チューブに移します。次に、25マイクロリットルのエキソソーム沈殿液をプラズマに加え、試料を完全に渦液に加えます。氷上で30分間のインキュベーションの後、遠心分離によって細胞外小胞を採取する。ペレットはベージュまたは白色で表示されます。上清を吸引し、再び遠心分離機を用いた。その後、液体のすべてのトランスを除去し、PBSの100マイクロリットルでペレットを再懸濁します。小胞の細胞膜を染色するには、EV懸濁液の10マイクロリットルを、調製したPKH67エタノール染料溶液の50マイクロリットルに加え、十分に混合します。暗闇の中で室温で5分後、染色された細胞外小胞懸濁液の50マイクロリットルを15ミリリットルの円錐形チューブに2.5ミリリットルの蒸留水で希釈し、完全に混合する。抗体でベシクルを標識するには、1.5ミリリットルの反応チューブに50マイクロリットルの蒸留水を含む未染色細胞外小胞懸濁液の10〜20マイクロリットルを徹底的に混合して希釈する。暗い室温で30分間インキュベーションするために、徹底的な混合で、対象となる抗体の2.5〜5マイクロリットルを反応管に加えます。次に、標識ベシクルの50マイクロリットルを、蒸留水の適切な実験量を含む15ミリリットルの円錐管に移し、完全な混合を行い、表に示されるようにする。染色または標識された細胞外小胞を分析する前に、まず蛍光フィルターを顕微鏡とカメラの光学経路に移動し、自動実装のための画面の指示に従ってプログラムを開始します。[セルチェック]タブで、蛍光測定用の正しいセル番号と光学系の基準位置を選択し、レーザーと顕微鏡が共通の焦点であることを確認します。シリンジを使用して、10ミリリットルの蒸留水で細胞チャネルを洗い流し、測定セルに気泡がなく、気泡がシステムに注入されないことに注意してください。次に、蒸留水990マイクロリットルで200ナノメートルサイズの蛍光標識ポリスチレン粒子を10マイクロリットル希釈し、この粒子懸濁液の10マイクロリットルを10ミリリットルの蒸留水を含む15ミリリットルのチューブに加える。次に、最初の希釈粒子溶液を2.5ミリリットルのセルチャネルに注入し、「フォーカスを最適化」をクリックしてカメラを調整します。サンプルを測定するには、10ミリリットルの蒸留水で細胞チャネルを複数回洗い流し、染色された細胞外小胞懸濁液を注入する。参照位置を使用して、表に示すように、[セルチェック]タブで適切な取得パラメータを調整します。最適な感度範囲を特定するには、[パーティクル数との対]をクリックします。感度は、異なる感度レベルに対して画面上当たりの測定粒子の曲線を表示する。Shutter パラメーターでは、カメラが指定した間隔でライトを通過できる時間間隔を調整します。[取得後パラメータ]では、最小輝度 20、最小サイズ 20 ナノメートル、最大測定サイズ 500 ナノメートルを選択します。ディスプレイの視野で検出されたパーティクルの数に注意してください。散乱バーは緑色からオレンジ、50〜300粒子の範囲でなければなりません。[ゼロボルトでパーティクルドリフトをチェック]をクリックし、[計測]タブを開きます。[ビデオの取得を実行] をクリックし、[実験の数] を 3 ~ 5 に設定し、[実験の間隔] を 0 分に設定します。個々のサブボリューム位置の数を 11 に設定し、測定サイクルの数を、パーティクルを分析する各測定位置で 10 に設定します。次に、フォルダーを選択し、新しいファイル名を作成し、[問題] をクリックして測定を開始します。解析の最後に、[解析]タブを開いて結果を確認します。次に、1位置あたりの平均粒子数、粒子の総数と粒子濃度、粒子の分布幅、平均値、標準偏差などを確認する。測定の調整および口径測定に蛍光ビーズを使用すると、85%の最適な設定感度を与えるこれらの設定を使用して、カメラはシャープな画像を表示し、測定を繰り返し低標準偏差を示します。緑色蛍光色素を長持ちする蛍光色素を含む蛍光細胞リンカーキットで染色すると、細胞膜の脂質領域に脂肪族の尾が入り込み、測定された粒子数と感度との間に強い相関関係が明らかになる。細胞外小胞染色抗体は、目的のタンパク質に対して、ピーク最大サイズ541ナノメートルの220〜145ナノメートルの粒子分布を示す。細胞外小胞は、コントロール小胞を含まない水の抗体染色後に検出されず、100%に近い感度までドリフトが毎秒5マイクロメートルを超える場合に測定が開始されると、個々の反復は明確な偏差を示す。このフルオロフォアは急速な光漂白を起こしやすいので、フルオロクロムとしてフッ素イソチオシアネートを使用すると不正確で再現性の高い測定が行われなくなります。このプロトコルは、特定のマーカーを使用して、単一の細胞外小胞の迅速な特性評価のために、この分野の多くの研究者の主要な需要に対処します。過去10年間に、方法が大幅に改善されたにもかかわらず、単一の細胞外小胞の分析のための標準化されたプロトコルはまだありません。この方法は、細胞外小胞生物学に関する研究の今後の進展に関係なく、特定のマーカーを用いた単一の細胞外小胞の特徴付けに対して、迅速かつ信頼性の高いプロトコルを提供する。現在のプロトコルは処理時間が長く、作業負荷のかかるステップも必要としないため、高いサンプルスループットにも適しています。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

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