Name: 単一分子イメージングの表面上の光駆動の分子モーター (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: 学ぶ光駆動分子モーターの単一分子イメージング法。石英表面へのグラフトと回転挙動の可視化手法を確立し、分子マシンの設計・合成・観察に重要な指針を提供します。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この仕事は科学研究 (NWO CW)、欧州研究評議会 (ERC; 高度なグラント号 694345 B.L.F.)、文部省、文化と科学のためにオランダの組織によって財政上支え (引力プログラム no。024.001.035)。

注: 有機合成は、このプロジェクトの主要なコアです。図 1は、重要な手順とターゲット分子を取得する方法を示しています。
1. 1 b の準備
注意: 溶剤分析グレードで購入しました。
<ol><li>
ケトン (3) の合成 注: 最初に、ヨード グループで 5 人メンバー リング ケトン2は官能基化反応です。この反応はアルゴン雰囲気下で行われます。<ol>
<li>2 (640 mg、2.3 ミリ モル) を含んでいる密封された管 (100 mL)、CuI (219 mg, 1.1 モル) と NaI (3.44 g、23 モル) 追加 1, 4-ジオキサン (50 mL) と N, N'-ジメチル エチレンジアミン (202 mg、2.3 ミリ モル)。</li>
		<li>反応温度を 140 ° C に設定し、24 時間かき混ぜます。</li>
		<li>部屋の温度 (RT) 混合物を冷却、減圧下で溶媒を削除およびフラッシュのクロマトグラフィーによる残りの材料を浄化: SiO2 (40 g);溶離液: ペンタン: エチル = 10:1 (合計 550 mL を =)。製品を入手して、黄色、粘着性オイル (642 mg, 91%) としてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
モータ 5 の合成 注: は、中央の二重結合を形成するのにバートン ケロッグ反応を使用します。この反応は、アルゴンの下で行われます。<ol>
<li>50 mL の丸底フラスコに、ローソン試薬 (415 mg, 1.1 モル)、ケトン3 (219 mg、0.68 モル)、トルエン (10 mL) を追加します。</li>
		<li>2 時間還流下で混合物を加熱し、その後溶剤を蒸発します。</li>
		<li>フラッシュの列で残渣を浄化: SiO2 (24 g)、溶離液: ペンタン: 酢酸エチル = 30: 1 (合計 = 155 mL) はその後 20 mL の thf 青色の溶液を生成するために再溶解する対応するチオケトンを取得します。</li>
		<li>青色の溶液にジアゾ化合物4 (476 mg, 1.37 mmol) の THF 溶液 (20 mL) を加え、一晩 50 ° C で新しく混合液をかき混ぜます。 注: これは全体の合成の最も重要なステップです。ジアゾ化合物およびチオケトン ソリューションは新鮮なする必要があり、反応する前に行う必要があります。</li>
		<li>溶媒は蒸発し、クロマトグラフィーによる残留物を浄化: SiO2 (24 g)、溶離液: ペンタン: CH2Cl2 = 10:1 (合計 = 220 mL) モーター 5 (250 mg, 50%) を生成するには赤い固体です。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
モーター 6 の合成 注: 中央の二重結合が形成されるときは、アセチレン部位によってヨード基を交換してください。<ol>
<li>20 mL シュレンク管操作管に追加3 (165 mg、0.26 ミリ モル)、Pd (PPh3)2Cl2 (2.5 モル %)、CuI (5 モル %)。THF (10 mL) を加えますと (私・ Pr)2NH (2 mL) を 10 分前にアルゴンを放置します。</li>
		<li>10 分間常温混合物をかき混ぜます。Triisopropylsilyl アセチレン (42 mg、0.27 ミリ モル) を追加します。</li>
		<li>15 h の混合物を攪拌し、水溶液飽和 NH4Cl ソリューション (25 mL) にそれを注ぐ。</li>
		<li>CH2Cl2 (3 x 20 mL) との混合物を抽出します。飽和食塩水と乾燥した有機層をさらに洗う (Na2SO4)。</li>
		<li>溶媒を除去し、残渣をフラッシュ クロマトグラフィーによる浄化: SiO2 (12 g)、溶離液: ペンタン: CH2Cl2 = 10:1 (220 mL) 茶色のオイル (171 mg, 99%) として8は降伏します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
モーター 8 の合成 注: この反応はアルゴンの下で行われます。<ol>
<li>1、4dioxane を6 (161 mg, 0.24 ミリ モル)、ピナコール エステル7 (240 mg、0.71 モル)、K3PO4 (300 mg、1.44 モル) と Pd (PPh3)4 (98 mg、0.096 mmol) の混合物をかき混ぜなさい (20 mL) で 50 mL 16 Schlenk 管 90 ° Ch。</li>
		<li>RT に混合物を冷却、酢酸エチル (30 mL) に薄めて、ガラス フィルターでろ過を行います。</li>
		<li>溶媒を削除します。フラッシュ カラムクロマトグラフィーによる残留物を浄化: SiO2 (12 g)、溶離液: ペンタン: CH2Cl2= 1:6 (合計 = 122 mL) 茶色のオイル (156 mg, 56%) としてエステル8は降伏します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
モーター 9 の合成
	<ol>
<li>20 mL シュレンク管操作管 0 ° C での THF (10 mL) の8 (120 mg、0.13 ミリ モル) のソリューションに TBAF (0.1 mL) を追加します。</li>
		<li>1 h の 0 の ° C で混合物を攪拌し、水飽和 NH4Cl 液 (20 mL) を注ぎ。</li>
		<li>CHCl3 (3 x 10 mL) を抽出、飽和食塩水と乾燥した有機層を洗う (Na2SO4)。</li>
		<li>溶媒を除去し、残渣をフラッシュ クロマトグラフィーによる浄化: SiO2 (12 g)、溶離液: ペンタン: 酢酸エチル = 1:3 (124 mL) の暗い赤色の油 (116 mg, 95%) として9は降伏します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
モータ 12 の合成 注: この反応はアルゴンの下で行われます。<ol>
<li>20 mL シュレンク管操作管追加モーター 9 (75 mg、0.10 ミリ モル)、PBI 11 (68 mg、0.10 ミリ モル) Pd (PPh3)2Cl2 (2.5 mol %)、CuI (5 mol %)。THF (10 mL) を加えますと (私・ Pr)2NH (2 mL) を 10 分前にアルゴンを放置します。</li>
		<li>混合物を一晩攪拌し、水飽和 NH4Cl ソリューションにそれを注ぐ。</li>
		<li>CHCl3 (3 x 20 mL) を抽出、飽和食塩水と乾燥した有機層を洗う (Na2SO4)。</li>
		<li>溶媒を除去し、残渣をフラッシュ クロマトグラフィーによる浄化: SiO2 (12 g)、溶離液: CHCl3 (100 mL) (66 mg, 57%) 暗赤色固体としてモーター 12は降伏します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
モーター 1 b の合成 注: エステル化合物を取得すると、最終的なターゲット分子を作ることを加水分解します。<ol>
<li>50 mL のフラスコでエステル12 (90 mg、0.038 モル)、THF (5 mL)、メタノール (5 mL)、水酸化ナトリウム(水槽) (1 M、5 mL) を溶解し、75 ° C、16 h のために混合物を熱する。</li>
		<li>RT に混合物を冷却し、5 mL の水を追加します。回転蒸発によって THF とメタノールを削除します。</li>
		<li>茶色の沈殿物を形成する 1 の pH に達するまで HCl(水槽) (1 M) との混合物を滴定しなさい。混合物を濾液洗い冷水 (10 mL) と茶色の固体と真空中で乾燥します。この茶色の固体とはターゲット分子1b (55 mg、85%) です。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 運動機能性単分子膜 MS 1 b の準備
<ol><li>ピラニア ソリューションでそれらを浸すことによってきれいに石英スライド (30% H2O2 H23:7 の比率など4) 1 h. リンスおびただしく二重蒸留水で 3 x、洗い流し MeOH で 90 ° C で。表面改質する前にストリームの N2の下でスライドを乾燥させます。</li>
	<li>Silanize ピラニア洗浄水晶は 12 h. リンスおびただしくトルエンとメタノールの RT で新鮮な蒸留トルエン 3-アミノプロピル (ジエトキシ) メチルシランの 1 mM の溶液中に浸漬してスライドします。</li>
	<li>最初、トルエン、メタノール、水晶を超音波し、アルゴンの流れの下でそれらを乾燥します。</li>
	<li>1 b (10-4 M) RT で 12 h の DMF 溶液でアミン コーティング スライドを浸します。</li>
	<li>洗浄は DMF、水、メタノールと滑るし、アルゴンの流れの下でそれらを乾燥します。乾燥後、スライド使用の準備が整いました。</li>
</ol>

<ol><li>Berg, J. M., Tynoczko, J. L., Styer, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBerg%2C+JM+%22Biochemistry+5th+ed%22">Biochemistry 5th ed</a>. , W.H. Freeman. New York. (2006).</li>
<li>Erbas-Cakmak, S., Leigh, D. A., McTernan, C. T., Nussbaumer, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+Molecular+Machines%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Artificial Molecular Machines.</a> Chemical Reviews. 115, 10081-10206 (2015).</li>
<li>Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Art+of+Building+Small%3A+From+Molecular+Switches+to+Motors%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%3A+International+Edition%22%5BJournal%5D)">The Art of Building Small: From Molecular Switches to Motors.</a> Angewandte Chemie: International Edition. 56, 11059-11078 (2017).</li>
<li>Stoddart, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Machines%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular Machines.</a> Accounts of Chemical Research. 34, 410-411 (2001).</li>
<li>Kinbara, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+Intelligent+Molecular+Machines%3A+Directed+Motions+of+Biological+and+Artificial+Molecules+and+Assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Toward Intelligent Molecular Machines: Directed Motions of Biological and Artificial Molecules and Assemblies.</a> Chemical Reviews. 105, 1377-1400 (2005).</li>
<li>Kay, E. R., Leigh, D. A., Zerbetto, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Molecular+Motors+and+Mechanical+Machines%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%3A+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Synthetic Molecular Motors and Mechanical Machines.</a> Angewandte Chemie: International Edition. 46, 72-191 (2007).</li>
<li>Kottas, G. S., Clarke, I. L., Horinek, D., Michl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+Molecular+Rotors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Artificial Molecular Rotors.</a> Chemical Reviews. 105, 1281-1376 (2005).</li>
<li>Watson, M. A., Cockroft, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Man-made+Molecular+Machines%3A+Membrane+Bound%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Man-made Molecular Machines: Membrane Bound.</a> Chemical Society Reviews. 45, 6118-6129 (2016).</li>
<li>Kassem, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+Molecular+Motors%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Artificial Molecular Motors.</a> Chemical Society Reviews. 46, 2592-2621 (2017).</li>
<li>Sauvage, J. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSauvage%2C+JP+%22Molecular+Machines+and+Motors%22">Molecular Machines and Motors</a>. , Springer. Berlin. (2001).</li>
<li>van Delden, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unidirectional+molecular+motor+on+a+gold+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Unidirectional molecular motor on a gold surface.</a> Nature. 437, 1337-1340 (2005).</li>
<li>Noji, H., Yasuda, R., Yoshida, M., Kinosita, K. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+the+rotation+of+F1-ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of the rotation of F1-ATPase.</a> Nature. 386, 299-302 (1997).</li>
<li>Hutchison, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surface-bound+molecule+that+undergoes+optically+biased+Brownian+rotation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">A surface-bound molecule that undergoes optically biased Brownian rotation.</a> Nature Nanotechnology. 9, 131-136 (2014).</li>
<li>Krajnik, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defocused+Imaging+of+UV-Driven+Surface-Bound+Molecular+Motors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Defocused Imaging of UV-Driven Surface-Bound Molecular Motors.</a> Journal of the American Chemical Society. 139, 7156-7159 (2017).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

このプロジェクトを含む大量の合成作業;したがって、最も重要なステップは、最終的な分子に向けた有機合成です。分子モーターの中央二重結合が形成される反応ですので、全合成の中では、バートン ケロッグ反応は重要なステップです。現在、これらのタイプの構造を形成するいくつかの方法が使用されています。ここでは、チオケトン ジアゾ カップリングを使用すると、および上部および下の半分およびチオケトン ジアゾ化合物としてそれぞれ用意されています。チオケトン、ジアゾ化合物は通常空気下で安定しました。したがって、反応は厳密に不活性雰囲気下での高速動作が必要です。
表面の分子モーターを閉じ込める方法で既存主、bipodal システムに基づいています。ただし、以前にデザインされた bipodal モータの異性化プロセスを分子間相互作用による妨害しました。さらに、いくつかの bipodal の例は添付ファイルの前に活性化をさらに必要です。現在のメソッドは、表面に十分な独立したスペースとモーターの堅牢な添付ファイルを提供する tetrapodal の方法でこれを実現します。
このメソッドの制限は蛍光タグの選択です。モーターの回転は 365 nm の波長によって誘発される、従っていないオーバー ラップする必要があります、特定の波長と染料だけが許可されます。さらに、ターゲット分子に向けた説明プロトコルで採用されている合成ルートでは、過酷な条件を反応の完了に必要ないくつかの手順が必要です。将来的より高度な分子の一分子イメージングが必要な場合より安易な合成デザインおそらく必要です。
結論として、デザインと高機能性光駆動の分子モーターの合成は、最初に説明します。合成の努力のいくつかの詳細にも説明がします。また、石英スライド面上のモーターを移植する方法が示されて、単一分子運動14の可視化のためさらにサンプルをテストできます。

生きている有機体、毎日の生活を維持するために機能豊富な分子モーターがあります。彼らは燃料の生産、輸送、移動、等1などのさまざまなタスクを実行することができます。自然のこれらの魅惑的な例のインスピレーションから描画、科学者が2分子レベルで制御された運動エネルギーの種類に変換する最後の数十年間人工分子モーターのシリーズを開発しました。,3,4,5,6,7,8,9,10です。 このフィールドの 3 つの先駆者に 2016 年に化学のノーベル賞が授与されました。ベン Feringa 賞を受賞のいずれかは、連続的な一方向回転運動を受けることができる光駆動の分子モーターを開発しています。
分子レベルでブラウン運動、分子衝突や振動などによるランダムな動きとして知られているが、通常これらの分子モーターのさらなる応用のための主要な障害。ブラウン運動は、任意の方向の運動を破壊できます。表面の分子モーターを拘束この問題を克服するためにオプションのいずれかがあります。により、他方の分子の 1 つの部分の相対的な回転は絶対に11の表面の相対的なローターの回転に変換されます。さらに、単一分子イメージング技術の使用は運動を視覚化を助けるかもしれない。したがって、この作業によって得られた結果は合成分子モーターにもっと洞察力を得るを助けます。
12,13吉田と木下 (図 2 a) の仕事を開拓、図 2 bに示すように、現在の仕事のデザインのためのインスピレーションとして務めています。光駆動の分子モーターの下半分は、固定子として機能するために表面に添付されます。ローター部は高剛性アームと蛍光ラベル機能です。2 つの異なる照射波長をシステムに適用すると、他は蛍光タグを刺激しながら、モーターの回転 1 つトリガーされます。原則として、ローター部の回転運動は、蛍光のグループの回転をトリガーします。そのため、多重ワイド フィールド蛍光顕微鏡による蛍光タグの回転を続くことができます。このメソッドは、最初の時間のため、分子モーターの相対的な回転を絶対回転角度、したがって合成モーターの回転を視覚化する方法に変換するメソッドを提供します。
この記事は、単一分子イメージングに使用される分子モーターの異性化研究設計・全合成・ ソリューションに関する詳細情報を提供します。分子の構造を図 3に示します。さらに、水晶表面の分子モーターを付ける方法を説明します。

<table><tbody><tr><td>NMR分光計</td><td>Varian</td><td>AMX400</td><td>陽子線NMR研究用</td></tr><tr><td>有機反応用試薬</td><td></td><td></td><td>シリ</td></tr><tr><td>カゲル シリカゲル</td><td>メルク</td><td>230-400メッシュASTM</td><td>フラッシュクロマトグラフィー&nbsp;</td></tr><tr><td>溶剤</td><td>アクロス</td><td>分光光度グレード&nbsp;</td><td>フラッシュクロマトグラフィー&nbsp;</td></tr><tr><td>UV-vis照射用</td><td>UVランプ</td><td>ENB</td><td>280C</td></tr><tr><td>UV-vis吸収分光光度計</td><td>JASCO</td><td>V-630&nbsp;</td><td>UV-vis測定</td></tr></tbody></table>

単一分子イメージングの表面上の光駆動の分子モーター

Light-driven Molecular Motors on Surfaces for Single Molecular Imaging

デザインと表面の単一分子レベルで合成回転モーターの直接可視化を目指した合成システムの合成を示します。この作品には、入念な設計、合成力、適切な分析が必要です。1H NMR と紫外可視吸収分光法による溶液中分子モーターの回転運動が表示されます。さらに、アミン コーティング石英にモーターを移植する方法を説明します。このメソッドは、分子機械にもっと洞察力を得るために役立ちます。

紫外光を用いた分子モーターの照射が実行されます (λmax = 365 nm)。照射時に、中央の二重結合のまわりの光誘起E-Z異性化が発生します。この過程で、不安定な異性体分子が安定したから変形しました。次に、分子全体の歪みを解放する熱活性らせん反転ステップ。これは、結果、元の安定した状態。1(図 4 a) のロータリーのプロセスを評価する H NMR 分光法が採用されます。サンプルの溶液を調製して、NMR チューブ、そして紫外線のランプ (λmax = 365 nm) チューブの横に置きます。照射の 2 h は後、 1H NMR スペクトルに明確な変化を見つけることが。これらの変更は、不安定な 1 b (図 4 b) と見なされます新しい異性体の生成を示します。2.9 ppm (ダブレット) から 3.3 ppm (ダブル ダブレット) に H、シフト1H NMR 分光法に見られます。1.4 ppm 信号はメチル基の吸収として割り当てることができ、それは敵陣を 1.6 ppm 1.4 ppm から移動します。サンプルは、暗闇の中で室温で一晩保管は、元のスペクトルがすることができます (図 4 a) を回復しました。1b 不安定を安定 1 b に変換する熱らせん反転のプロセスを示します。
1 b モーターの回転運動を考察するために表面、表面接続型のモーター アセンブリ MS 1b (MS = 表面上モーター) を用意しています。石英スライドがアミン修飾最初と。この手順の後水晶は一晩 RT 1 b の DMF 溶液 (10-4 M) に没頭です。合成石英は、DMF、水、メタノールと洗浄です。準備された石英スライドは、紫外/可視研究を送信します。MS-1b (実線) の紫外・可視吸収スペクトルを図 5bに示します。スペクトルに見られるように、主要な吸収バンドと吸収プロファイルは、ソリューション (図 5 a) の観察に似ています。それはまたモーターの特性吸収を示しています (420 nm) と PBI (456 nm、490 nm, 524 nm)。これらのピークは、アミン塗装面にモーター 1 b の接続の成功をお勧めします。さらに、石英スライドを 15 分間照射し、スペクトルの変化が不安定な MS 1 b の発生を示すソリューションのような観察されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58750/58750fig1.jpg"> 図 1: ターゲット分子 1 b の準備に向けて合成スキーム。スキームでは、各ステップで試薬、溶媒、および使用する反応条件を示しています。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58750/58750fig2.jpg"> 図 2:(、) F0F1の構造の模式図-atp アーゼ (許可12で再現) 一方向の回転の可視化のための表面に移植しました。光駆動分子モーターを合成表面結合の概念設計 (b)、単一分子イメージングのため。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58750/58750fig3.jpg"> 図 3: モーターのコアと PBI ラベルの間硬直長い腕を軸受の表面結合分子モーターの 1b 構造。 
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58750/58750fig4.jpg"> 図 4:の脂肪族地域、1モーター 1 b の H-NMR スペクトル (CD2Cl2、-20 ° C、c = 10-3 M)照射前に、(、) の安定した 1b (365 nm)。照射後写真静止状態 (b) 混合物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58750/58750fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58750/58750fig5v2.jpg"> 図 5: 紫外・可視吸収スペクトル。(、) のモーターの 1 b の紫外・可視吸収スペクトル (CH2Cl2, 0 の ° C)、安定した異性体 (実線) と PSS で不安定な異性体 (破線)。(b) MS-1b (石英, 4 ° C) (実線) の前に (破線) 照射後。

原稿では、合成および単一分子イメージングのための表面分子モーターを移植する方法について説明します。

The design and synthesis of a synthetic system that aims for the direct visualization of a synthetic rotary motor at the single molecule level on surfaces ...

このプロトコルは、単一分子レベルで人工光駆動分子モーターの回転を視覚化する最初の例を提供する。ここで使用される合成技術は、いくつかの官能基を持つ複雑な分子機械の合成を可能にするように設計されています。まず、アルゴン雰囲気の下で、ローター前駆体化合物2の640ミリグラム、ヨウ化銅219ミリグラム、および3.44グラムのヨウ化ナトリウムを、攪拌棒を備えた100ミリリットルのシュレンクチューブに入れます。密閉チューブをシュレンクラインに接続し、50ミリリットルの1、4-ジオキサン、トランス1、2-ジアミノシクロヘキサン263ミリグラムを加えます。臭素置換基をヨウ素と交換するために、140°Cで24時間混合物をかき混ぜます。その後、混合物を室温まで冷却させ、真空下で溶媒を蒸発させる。シリカゲルフラッシュクロマトグラフィーで化合物を精製し、揮発性物質を除去し、ヨウ素置換化合物3を粘着性の黄色油として得る。次に、ローソンの試薬415ミリグラムと、スターバーを装備したシュレンクフラスコに化合物3の219ミリグラムを置きます。フラスコをコンデンサーを介してシュレンクラインに接続し、アルゴンで3回パージします。トルエンを10ミリリットル加え、混合物を2時間還流して化合物3をチオケトンに変換する。溶媒を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィーによってチオケトンを精製する。純粋な分画から揮発性物質を取り除き、20ミリリットルのテトラヒドロフランで単離チオケトンを溶解する。次に、ステータージアゾ前駆体である作りたての化合物476ミリグラムをTHFの別の20ミリリットルに溶解する。化合物4の溶液をチオケトン溶液に加え、攪拌しながら16時間アルゴン下で混合物を還流させ、ロータとステータの間に二重結合を形成した。過剰な溶媒を蒸発させ、フラッシュクロマトグラフィーにより粗生成物を精製し、揮発性物質を除去し、モータ化合物5を赤色固体として得る。次に、165ミリグラムのモーター5、4.56ミリグラムのビス(トリフェニルホスフィン)塩化パラジウム、2.48ミリグラムのヨウ化銅を攪拌棒を装備した20ミリリットルのシュレンクチューブに加えます。チューブを密封し、シュレンクラインに接続します。10分間、THFの10ミリリットルとジイソプロピルアミンとバブルアルゴンの2ミリリットルを組み合わせます。その後、混合物をシュレンクチューブに移し、室温で反応混合物をアルゴンで10分間攪拌する。42ミリグラムのトリイソプロピルシルアセチレンを加え、15〜16時間攪拌を続け、ヨウ素をTIPSアセチレンに置き換えます。次いで、飽和した塩化アンモニウム水溶液の25ミリリットルに製品混合物を注ぎます。ジクロロメタンの3つの20ミリリットルの部分に製品を抽出し、飽和ブラインの50ミリリットルで結合有機層を一度洗います。洗浄した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させます。乾燥剤を除外し、余分な溶媒を除去します。フラッシュクロマトグラフィーで残渣を精製し、真空下で揮発物を除去し、モータ6を褐色油として得る。攪拌棒を備えた50ミリリットルのフラスコに、PBI標識モーター12の90ミリグラム、THFの5ミリリットル、メタノール5ミリリットル、水酸化ナトリウム1モル水溶液5ミリリットルを組み合わせます。ステーターのエステルを加水分解するために6時間摂氏70度で混合物をかき混ぜます。次に、攪拌しながら混合物を室温まで冷却する。二重蒸留水を5ミリリットル加え、ロータリー蒸散により揮発性溶剤を除去します。混合物がpH1に達するまで水性の1モル水圧酸を加え、その時点でモータ1bが褐色固体として溶液から沈殿する。ろ過して固体を回収し、10ミリリットルの冷水で洗浄し、真空下で乾燥させます。次に、ピラニア溶液に石英スライドを90°Cで1時間浸します。5ミリリットルの二重蒸留水でスライドを3回、メタノールで1回リンスします。スライドを窒素ガスで乾燥させます。次いで、蒸留したばかりのトルエンに3-アミノプロピル(ジエトキシ)メチルシランの1ミリモル溶液を調製する。この溶液中のスライドを室温で12時間浸し、その後、トルエンとメタノールのそれぞれ5ミリリットルでシラナイズスライドを洗いすめます。スライドをトルエンとメタノールにそれぞれ2分間順に浸し、アルゴンガスの流れの下で乾燥させます。次に、各スライドに対してジメチルホルムアミド中のモータ1bの0.1ミリモル溶液を5ミリリットル調製する。1bの1bの水晶質のスライドを室温で12時間浸し、1bの単層で石英表面を機能させます。機能化したスライドをDMF、水、メタノールを順番に洗います。アルゴンガスでスライドを乾燥させ、アルゴンの下に密閉された容器に保管します。分子モータ1bは適度な収率で合成し、ロータのコアを蛍光タグに接続する硬直したフェニルエチニレンテトラマーアームを用いた。陽子NMRスペクトルは、HaとHcの間に有意な近傍結合を示さなかったが、これは、いずれも疑似赤道方向にあるHaおよびHcと一致している。この不安定な異性体に対して365ナノメートル光によるHbとHc.照射の間に軸赤道近傍結合が観察された。メチルシグナルのダウンフィールドシフトとHaとHcの間の近傍結合の発達は、いずれもメチル基が偽赤道であることを示した。化合物を室温で暗闇の中に保つと、熱らせん反転は、フルオレンを通り過ぎてナフタレンで分子の歪みを放出した。これは、対称フルオレンステータのために分子を元の構成に戻した。安定性および不安定異性体のUV/vis分光法は、硬質アームと蛍光タグの特性吸収領域にわずかな違いを示した。石英上のモータ1bの単層の組み立て成功は、UV/vis分光法によって確認された。この単層は、フォト静止状態で不安定な異性体に到達するのにわずか15分の照射を要した。ジアゾおよびチオケトン化合物がモータ5の合成を成功させるために作られたことを確認することが重要である。分子機械の研究分野は、複雑な分子機械の設計、合成、可視化に関する重要な指針となるため、この方法の恩恵を受けることができます。ピラニア溶液は、スライドをきれいにするために使用されます。この溶液は、高酸性であり、慎重に使用する必要があります。

light-driven-molecular-motors-on-surfaces-for-single-molecular-imaging

Research

JoVE Journal

Chemistry

化学

この記事では、我々は、自動走査型共焦点顕微鏡を用いて表面に固定化された個々のDNA分子からのトレースをFRETの取得方法について説明します。...

表面固定化生体分子の単一分子蛍光測定のための自動化システム

ここでは、二枚の光学トラップされたマイクロスフェアの間に懸架単一のDNA分子と相互作用する単一の蛍光標識タンパク質分子を検出するための機器および方法が記載されている。...

タンパク質-DNA相互作用の研究のための単一分子マニピュレーションとイメージングを組み合わせる

シングルフルオロフォアはFIONAを使用して、ナノメートルの精度で定位させることができる。ここでFIONA技術の概要が報告され、そしてどのようにFIONA実験を実施する方法について説明する。...

ワンナノメートルの精度で蛍光イメージング（FIONA）

タンパク質官能基化平面ガラス支持脂質二重膜の調製、タンパク質内のタンパク質移動度の決定、およびタンパク質密度の測定がここに示されている。ノイズを低減した全反射顕微鏡を構築するためのロードマップが概説されており、これにより、高い時空間分解能で単一の二重層常在蛍光色素を視覚化できます。...

平面支持された二分子層​​上の単一分子蛍光顕微鏡

高解像度のクーロン爆発イメージングセットアップを使用して、分子回転波パケットのリアルタイムムービーを作成するためのプロトコルを提示します。...

レーザー駆動の超高速分子回転のダイレクトイメージング

表面付着キネシン モーター蛋白質が色素標識微小管を推進分子シャトルを構築するためのプロトコルを提案します。表面とキネシンの弱い相互作用は、それへのリバーシブルの愛着をできます。これは、動的アセンブリとそのコンポーネントの機能を維持しながら分解を表わすナノスケール...

キネシンを添付可逆的アトス分子シャトルの組み立て

ここで提示されるミオシン5aを発現および精製する手順は、その特徴付け、アンサンブルおよび単分子の両方を用いて蛍光顕微鏡ベースのアッセイ、およびこれらの方法を非筋筋筋筋2bの特徴付けのためにどのように修飾することができるかである。...

インビトロ蛍光顕微鏡ベースの運動アッセイのミオシン特異的適応

S. cerevisiae細胞から精製された双方向キネシン-5 Cin8の一分子およびクラスターの運動性

本研究では、キネシン-3ファミリーのメンバーであるKIF1A(1-393LZ)をSf9-バキュロウイルス発現系を用いて精製する。これらの精製モーターの in vitro...

Sf9精製超加工キネシン-3ファミリーモーターの1分子解析

マイクロ流体チャンバーを介して研究される視覚的な単一分子生化学は、ガラスバレル、気密シリンジ、チューブとフローセルへのチューブの安定した接続、およびシリンジとチューブの間に切り替えバルブを配置することによる気泡の除去を使用して大幅に促進されます。このプロトコルは、DNAトランザクションと分子間相互作用の視覚化を可能にするデュアルオプティカルトラップを記述します。...

1分子研究のためのデュアル光ピンセットとマイクロ流体工学の使用

本記事では、固体支持脂質二重層における単一タンパク質追跡用のサンプル作成方法を詳しく説明します。また、単一分子感度と高速フレームレートを持つシンプルな蛍光顕微鏡の説明もします。最後に、単一タンパク質の軌跡抽出手順を概説します。...

蛍光顕微鏡を用いた脂質二重層中の単一タンパク質の追跡

学ぶ光駆動分子モーターの単一分子イメージング法。石英表面へのグラフトと回転挙動の可視化手法を確立し、分子マシンの設計・合成・観察に重要な指針を提供します。

単一分子イメージングの表面上の光駆動の分子モーター

さらに動画を探す