Name: 緑色蛍光タンパク質-表現する拡張を使用するマウス腹腔マクロファージの貪食能を評価するために大腸菌 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: 学ぶマウス腹腔マクロファージの貪食能評価法。EGFP発現大腸菌を用いて若齢と高齢マウスの貪食活性を比較し、自然免疫機能の加齢変化を解析する簡便で再現性の高いプロトコルです。

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中国の国家自然科学基金 (第 31800046)、遼寧省 (第 20170540262) の自然科学の基礎は、この仕事を支えた。この作品は、第 2 病院の大連医科大学科学研究センターの研究所で達成されました。著者は、小琳、フローサイトメトリーによる彼女の援助のために歌ったとボ クとビデオの生産に彼らの支援のための東傳陽に感謝したいと思います。

ケアと実験動物の使用のため国家機関の健康の指針の下ですべての手順を行ったし、プロトコルは、動物愛護と大連医科大学の使用委員会によって承認されました。16 ヶ (30-35 g の体重) と、8 週齢 (20-25 g) SPF (特定病原体フリー) 男性 c57bl/6 マウスは大連医科大学の SPF 動物センターから得られました。すべてのマウスは、食糧および水の自由にアクセスで動物飼育で保管されました。20-24 ° C に保たれた温度、湿度は 40% から 70% に、照明は暗いの 12 h 光/12。動物は、実験前に少なくとも 7 日間環境に適応する許されました。
1. ペット相撲 EGFP プラスミドとの EGFP 発現誘導の建設
<ol><li>EGFP 遺伝子のフラグメントを合成 (カスタム遺伝子合成サービスによって合成 717 bp シーケンスには、シーケンスの材料表と補足ファイル 1が参照してください)、前方のプライマー (フラグメントを増幅5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') 逆プライマー (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3')、忠実度の高い Taq DNA ポリメラーゼを用いたします。</li>
	<li>ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) 製品が単一 3' 次のステップで TA のクローニングのためのオーバー ハング アデニンができるようにには、最後のサイクル (PCR 条件の補足のファイル 1を参照してください) の後に 72 ° C で 30 分拡張子を使用します。Agarose のゲルの電気泳動で PCR の製品を確認してください。</li>
	<li>ペット相撲ベクトルに PCR の製品をクローン (材料表参照) TA クローニング法5 T4 DNA リガーゼを使ってします。30 分間室温 (20-25 ° C) で反応を孵化させなさい。653 と 1 bp の 5 ' の各鎖に T オーバー ハングで 654 のヌクレオチドの間ベクトルが線形化されます。</li>
	<li>化学的に有能なエシェリヒア属大腸菌BL21(DE) ひずみに結紮製品を次のように変換: 5 μ L を追加 (100 ng) BL21(DE) 90 42 ° C で熱ショックによって有能なセルの 100 μ L に PCR の製品の s;3 分間氷の上の混合物を維持し、37 ° c、1 h 37 ° C で 120 rpm の振動予熱ホストゲノム スープ (LB) 媒体の 400 μ L を追加します。</li>
	<li>降伏 EGFP 式ひずみとインデューサ ラクトース (0.5 mmol/L)、LB カナマイシン (100 μ g/mL) プレートの表面に細菌の 100 μ L を接種します。37 ° C でプレートを一晩インキュベートします。 注: EGFP を表明正常にいくつかの植民地が暗闇の中で光る緑色の光として観察できます。<ol>
<li>DNA の配列によって挿入された EGFP フラグメントを検証するコロニーを選択します。DNA 塩基配列のプライマー: 前方、5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3';逆、5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'。</li>
	</ol>
</li>
	<li>100 μ g/mL カナマイシンと LB 培地 5 mL に肯定的なコロニーを接種します。2 時間 120 rpm でインキュベーターを揺れ 37 ° C の孵化し、0.5 ミリ モル/L の最終的な集中にインデューサ乳糖を追加し、6 h、EGFP の発現を誘導するために振るを続行します。経験的に、6 h、600 の光学濃度の振動と nm (OD600) が 0.7 に達する可能性があります以上。</li>
	<li>スライドに細菌培養液の 10 μ L を加えて、coverslip でそれをカバー倒立蛍光顕微鏡下で EGFP の発現を調べる。EGFP 発現細菌は、数週間 2-8 ° C でメディアに格納できます。</li>
</ol>2. マウス腹腔マクロファージの分離と培養
<ol><li>チオグ リコール酸の 3.5 g を 100 mL の蒸留水とオートクレーブを使用する前に無菌性の混合物に追加します。マウス腹腔内注射用フードで 1 mL 滅菌注射器にチオグ リコール酸培地をポンプします。感染を避けるために注射器ごとの 1 つのマウスを使用します。チオグ リコール酸の使用は、マクロファージの数を増やすことができます。腹腔マクロファージは分離することができますマクロファージが得られますチオグ リコール酸がなくても低い。</li>
	<li>ローカル アニマル ・ ケアおよび使用委員会によって承認されたメソッドを使用してマウスを麻酔します。マウスの腹腔内に 23 G 針を用いて 1 mL 注射器 3.5% チオグ リコール酸培地 1 mL を注入します。 注: 麻酔を誘導することによって腹腔内注入が簡単に行えます、注入によって引き起こされる内部の臓器に傷害の危険を減らします。</li>
	<li>3 日間の水や食料の自由でマウスを維持します。動物の体の重量と食品の摂取量を毎日監視します。3 日以内に体重を 10% より大きい場合は、実験から動物を除外します。</li>
	<li>3 日後に、急速にクローズド ボックスでセボフルランによる麻酔を誘導した後頚部転位によってマウスを安楽死させます。また、マウスを安楽死地元の動物のケアおよび使用委員会によって承認されているメソッドを使用します。</li>
	<li>滅菌、75% エタノール (直径 10 cm) と皿にマウスを置くし、フードにすぐに転送。皿の上にマウスを置くし、マウスの位置を固定するボードに前足をピンします。</li>
	<li>20 G に接続されている 5 mL シリンジを使用して針を 30 ° ~ 40 ° の角度で針ベベルを配置する注入 5 mL 冷 (4-10 ° C) のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 下腹部にマウスの腹腔内腸を穿刺を避けること。腸 (または他の器官) をパンクすると場合、マウスおよびそのセルもはや使用できます実験、これは初代細胞培養に適していないセルをアクティブに可能性がありますと。</li>
	<li>マウスの腹部の両側に優しくマッサージを実行します。その後、静かにゆっくりと液体を吸い出しなさい。腹腔液を 50 mL の遠心管に分配します。次の手順は 2 倍または 3 倍を繰り返します。</li>
	<li>冷却遠心機 (4-8 ° C) で 400 × gで 10 分間の浮遊細胞を遠心します。上澄みを廃棄し、10% 牛胎児血清 (FBS) RPMI 1640 媒体で細胞ペレットを再懸濁します。セルをカウントします。経験的に、細胞密度は、セル培地 10 mL で再停止されるとき約 5 × 106セル/mL と同じです。</li>
	<li>流れの cytometry の試金の蛍光顕微鏡用 24 ウェル プレートによくあたり 5 x 10 の5セル 6 ウェル プレートの各ウェルに 5 x 10 の6セルを追加します。一晩で 5% CO2インキュベーター 37 ° C の細胞を培養します。これらのほとんどはリンパ球であるので非粘着性のセルを削除する 3 時間後、培養液を更新できます。付着性のセルは主にマクロファージ、組織文化処理プラスチックによく付着することができます彼ら。</li>
</ol>3 蛍光顕微鏡を用いたマクロファージ貪食能アッセイ
<ol><li>細胞生存率、細胞密度を評価する明視野顕微鏡で細胞を観察します。</li>
	<li>24 ウェル プレートから培養培地を削除します。新鮮な培養液を 100 μ l 添加と細菌懸濁液 (約 2 x 10 の7セル) の 10 μ L を各ウェルの表 1に示すように追加します。1 h 37 ° C、5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。</li>
	<li>Noninternalized 細菌を洗浄する井戸あたり 500 μ L 冷 PBS の x-5 3 x は水洗い。</li>
	<li>30 分間室温で PBS で 4% のホルムアルデヒドとセルを孵化させなさい。</li>
	<li>3 固定セルを洗浄して PBS の x (500 μ L/ウェル)。</li>
	<li>蛍光ファロイジン 633 を 200 μ l 添加色素共役実用的なソリューションを追加 (参照材料表) F-アクチンを染色します。60 分間室温で暗く、湿気の多い場所 (60%-80%) に保管のリンスの細胞 3 x PBS (500 μ L/ウェル) 任意の余分な電子を削除します。F-アクチンを染色によって細胞質を概観して内面化された細菌を区別するのに役立ちます。</li>
	<li>細胞核を染色し、室温で暗く、湿気の多い場所で 5 分間インキュベート DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) 使用液 (1 μ g/mL) 200 μ L を追加します。1x PBS で洗浄 (500 μ L/ウェル) と等量の蒸留水と 1 x。セルは、倒立蛍光顕微鏡下で観察の準備になります。</li>
</ol>4 フローサイトメトリーを用いたマクロファージ貪食能アッセイ
<ol><li>実験の誤差を最小限に抑えると結果の適切な解釈をする、グループを設定し、表 2に記載されている実験のための管を制御します。<ol>
<li>コントロール グループのする氷 (表2 グループ 4) に配置されます 6 ウェル プレートからメディアを取り出して、それを洗う PBS で 1 x。セルをデタッチし、流れの cytometry チューブに移して同様に 70 mM 冷たい EDTA の 1 mL を追加します。チューブの細菌懸濁液 50 μ L を追加、1 h の氷の上に置きます。</li>
		<li>他のグループは、培養培地を削除します。各ウェルに新鮮な媒体の 1 つの mL を追加します。表 2に説明されているようにグループの設定によると井戸に細菌懸濁液を 50 μ l 添加を追加します。その後、37 ° C、1 時間 5% CO2インキュベーターに 6 ウェル プレートを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Noninternalized大腸菌の蛍光を癒やす、井戸に 0.8% (CV) クリスタル バイオレット水溶液 200 μ L を追加しの表面に EGFP 発現大腸菌バインディングによって偽陽性の結果を回避するため、すぐに影響を与える、マクロファージ、内面が。3 セルを洗浄して任意の残留の CV を削除する PBS の x。</li>
	<li>セルをデタッチし、流れの cytometry チューブに移して同様に 70 mM 冷たい EDTA の 1 mL を追加します。</li>
	<li>400 x gで 5 分でチューブを遠心し、上澄みを廃棄します。</li>
	<li>細胞を再懸濁しますに PBS 100 μ L を追加します。グループの設定によると、チューブ、または使用 IgG2a PE アイソタイプに F4/80 PE 標識抗体 (マウスのマクロファージに発現する表面抗原) の 5 μ L を追加します。渦を簡単にし、暗闇の中で 5-10 分のための氷のサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>各管に 1 mL の PBS を追加し、400 x gで 5 分間遠心上清を破棄します。フローサイトメトリー解析のための PBS の 200-300 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。各チューブを実行し、F4/80+細胞の少なくとも 10,000 のイベント用のデータを取得します。</li>
</ol>

<ol><li>Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+peritoneal+macrophages+to+carry+out+gene+expression+analysis+upon+Toll-like+receptors+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52749(2015).</li>
<li>Iskander, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis%3A+multiple+abnormalities%2C+heterogeneous+responses%2C+and+evolving+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding.</a> Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).</li>
<li>Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+severe+sepsis+in+older+patients%3A+from+epidemiology+to+evidence-based+management%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management.</a> Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).</li>
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<li>Weingart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labels+influence+phagocytosis+of+Bordetella+pertussis+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils.</a> Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).</li>
<li>Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+flow+cytometric+method+to+evaluate+phagocytosis+of+pHrodo+BioParticles%28R%29+by+granulocytes+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species.</a> Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).</li>
<li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+fluorometric+technique+for+assessment+of+macrophage+phagocytosis+and+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52195(2014).</li>
</ol>

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このプロトコルの手順は非常にシンプルで簡単です。エシェリヒア属大腸菌の EGFP 発現を誘導するために重要な手順の 1 つです。通常、EGFP のような真核生物の遺伝子は大腸菌のような原核生物で表現する予定されている場合蛋白質のネイティブ構造と活性を変化する蛋白質が非アクティブな集計 (封入体) を形成、リスクがあります。ペット相撲ベクトルを使用し、ペット相撲 EGFP プラスミドを構築、EGFP 相撲融合タンパク質が正常に表現され、光信号が蛍光顕微鏡、フローサイトによって検出されるのに十分であった。
他の重要なステップは、ない大食細胞によって内面化された細菌の蛍光性を抑制することです。かに (FITC) の蛍光を癒やすためトリパン ブルーが示されているが-ラベル、熱殺された細菌、動作しませんでしたライブエシェリヒア属大腸菌のため。0.8% のクリスタル ・ バイオレット水溶液を使用して細胞表面に結合するエシェリヒア属大腸菌の蛍光性のほとんどを消すことができます。いくつかの文献を示唆するいると洗浄トリパン ブル...

マクロファージの食作用の試金は、自然免疫の研究に使われます。生得の免疫反応伝染への感受性があります。マクロファージ細胞は免疫学研究で広く使用されます。ただし、拡張通路遺伝子の損失を引き起こす可能性があります、これらの細胞免疫機能を侵害します。したがって、プライマリのマクロファージ、細胞機能1を研究するための理想的なオブジェクトです。
生得の免疫反応は、高齢者の体にそのままと思われたが貧食能が、年下でボディ2,3と比較して低下します。ここでは、若い (8 週齢) と EGFP 発現大腸菌、便利、迅速、かつ経済的に実現可能であるを使用して高齢者 (16 ヶ月歳) マウスの腹腔マクロファージの貪食能を評価する方法を示します。
EGFP 発現大腸菌株の使用は、これらの細菌は安定しており、マクロファージが 4% (w/v) パラホルムアルデヒドで固定後も強い蛍光信号が表示されないので、このアッセイの利点の 1 つです。また、EGFP 発現大腸菌を用いた研究者必要はありませんさらに染色細胞貪食は、時間を節約できます。さらに、マクロファージがエシェリヒア属大腸菌抗原、大腸菌の EGFP 発現菌類またはフルオレスセイン分類されたビーズを使用するよりも適して食作用の試金のためを作るための immunoresponsive です。
EGFP 発現大腸菌と食作用の試金、簡単に 2 h で達成し、両方流れフローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、研究者の目的に応じてで測定します。以来、このメソッドは、貪食能力を直接測定、結果、その他の間接的な方法よりも再現性。
このメソッドは、RAW264.7 細胞ラインで検証されている、ひと末梢血単核細胞の4。下のテキストはこの分析を実行する詳細な手順について説明し、ハイライト重要なステップが研究者が彼らの実験のニーズに合わせて変更。

<table><tbody><tr><td>BD FACSCanto II フローサイトメーター</td><td>BD Biosciences-Biotin</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>anti-mouse CD16/32 Antibody</td><td>Biolegend</td><td>Cat101303</td><td></td></tr><tr><td>Champion pET SUMO Protein Expression system</td><td>Invitrogen</td><td>K300-01</td><td></td></tr><tr><td>Custom Gene Synthesis Service</td><td>Takara Biotech.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>F4/80-PE FACS</td><td>Biolegend</td><td>Cat123110</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI3000 B&nbsp;倒立顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>PE ラット IgG2a, &κ;-アイソタイプコントロール</td><td>Biolegend</td><td>Cat400507</td><td></td></tr><tr><td>ファロイジン 633 蛍光色素 結合型作業溶液</td><td>AAT Bioquest</td><td>Cat23125</td><td></td></tr><tr><td>チオグリコール酸培地</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9032</td><td></td></tr></tbody></table>

緑色蛍光タンパク質-表現する拡張を使用するマウス腹腔マクロファージの貪食能を評価するために大腸菌

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

本稿では、貪食能の分析を実行するシンプルかつ再現可能な方法について説明します。このメソッドの最初の部分では、ペット相撲 EGFP ベクターの構築 (相撲 = 小さなユビキチン様修飾) と表現する緑色蛍光タンパク質 (EGFP)エシェリヒア属大腸菌(BL21DE)。37 ° C で 1 時間のマクロファージの EGFP 発現大腸菌を coincubated します。培養陰性対照グループは、時間の同量のため氷の上。その後、マクロファージは評価の準備ができています。この手法の利点は、そのシンプルでわかりやすい手順と貪食能は両方の流れの cytometer 蛍光顕微鏡で測定できます。EGFP 発現大腸菌が安定していると、マクロファージはパラホルムアルデヒドで固定後も強い蛍光信号が表示されません。このメソッドはマクロファージ細胞株あるいは体外プライマリ マクロファージの評価に適したが、末梢血単核細胞における顆粒球や単球の貪食能の評価にも適しただけではありません。若い (8 週齢) マウス腹腔マクロファージの貪食機能に高齢者 (16 ヶ月歳) マウスからマクロファージの細胞よりも高い結果を示す.要約すると、このメソッドは、マクロファージの貪食能を測定、生得の免疫組織の機能を勉強に適しています。

ペット相撲ベクターは、大腸菌でのネイティブ蛋白質の表現を許可する小さいユビキチンのような修飾子を利用しています。相撲の融合は、簡単に検出することができます、EGFP の溶解度を大きく向上できます。EGFP の発現は正常にラクトース誘発性、緑コロニーが (図 1 a) 暗闇の中で観察できます。EGFP 発現大腸菌を表し、緑のドットは、40 倍対物レンズ (図 1 b) を使用して蛍光顕微鏡下で観察できます。
顕微鏡による解析では、若者や高齢者のグループから腹腔内マクロファージの蛍光画像 (図 1) を示しています。図 1は、EGFP 発現大腸菌の蛍光グリーン、DAP...

ここでは、強化された緑色蛍光タンパク質発現大腸菌を用いたマウス腹腔マクロファージの貪食能を評価するためのプロトコルを提案する.

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

このプロトコルは、EGFP発現大腸菌を用いたマクロファージの貪食能力を評価する簡単で、生産可能な方法を実証した。こんにちは、大連医科大学第二病院のジュンユーといいます。今日、私たちはあなたに簡単に示し、2時間以内に簡単に行うことができるマクロファージ食細胞症を評価する方法を視覚化するつもりです。この方法は、自然免疫機能の研究で広く使用された。高齢者の自然免疫機能はそのまま残っていると考えられています。そこで今日、私たちは、高齢者と若いマウスから腹膜マクロファージを分離し、これら2つのグループの貪食能力を見るつもりです。さて、始めましょう。まず、EGFP遺伝子断片を合成し、高忠実度のTaq DNAポリメラーゼを用いてフラグメントをクローン化する。次に、PCR産物をpET SUMOベクターにリゲートします。第三に、ライゲーション製品を大腸菌株に変換し、乳糖で発現するEGFPを誘導する。これらのEGFP発現大腸菌は、食性細胞化アッセイのマーカーとして役立った。次に、マウス腹腎マクロファージを単離し、培養した。その後、EGFP発現大腸菌を37センチで1時間マクロファージでコインキュベージした。クエンチステップの後、マクロファージは蛍光顕微鏡とフローサイトメーターの両方による評価の準備が整いました。EGFP遺伝子断片を合成し、高忠実度のTaq DNAポリメラーゼを使用して、前方および逆プライマーで断片を増幅する。PCR 製品が次のステップで TA クローニング用に単一の 3 エンド アデニン オーバーハングを持っていることを確認するには、最後のサイクルの後に 72 センチグリーで 30 分の延長が推奨されます。アガロースゲル電気泳動によりPCR産物を確認します。フラグメントが正しく増幅された場合、717 bpバンドがゲル上で観察される。TAクローニング法をT4 DNAリガーゼで使用してPCR産物をpET SUMOベクターにクローン化します。反応を室温で30分間インキュベートする。5マイクロリットルのPCR産物をBL21コンピテントセルの100マイクロリットルに加えます。42度のセンチグリーで細胞に90秒間熱ショックを与え、その後、混合物を氷の上に3分間保ちます。LB培地400マイクロリットルを加える, 37センチグリーで予熱.37度のセンチグリーと120rpmで1時間揺れる。1ミリリットルカナマイシンあたり100マイクログラムでLBプレートの表面に細菌を接種し、ベクター変換された大腸菌をスクリーニングします。37度のセンチグリーオーブンで一晩プレートをインキュベートします。翌日、陽性コロニーを5ミリリットルのLB培地に接種し、1ミリリットルのカナマイシン当たり100マイクログラムを使用する。37度センチグリーで120rpmでインキュベーターを2時間インキュベートする。次に、インデューサーラクトースを1リットル当たり0.5ミリモルの最終濃度に加え、6時間揺れ続け、EGFP発現を誘発する。経験的に、6時間揺れると、OD600は0.7以上に達する可能性があります。最後に、蛍光顕微鏡を用いて、EGFP発現の程度を検証した。10マイクロリットルの細菌培養培地をスライドに加える。その後、カバースリップで覆います。蛍光顕微鏡下でのEGFPの発現を調べる。蒸留水100ミリリットルにチオグリコールレートの3.5グラムを追加します。使用前にオートクレーブで殺菌する。チオグリコール酸培地をボンネットの1ミリリットルの滅菌注射器に吸引する。感染を避けるために注射器あたり1つのマウス。23ゲージ針を用いてマウス腹腔に3.5%チオグリコール酸ミドの1ミリリットルを注入し、3日間水と食品添加物でマウスを維持します。3日後、閉じた箱の中でセボフルランによって麻酔を急速に誘発した後、子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。その後、無菌に75%エタノールで皿にマウスを入れて、すぐにフードに移します。マウスをプレートに置き、ボードの前足を固定してマウスの位置を固定します。20ゲージの針を持つ5ミリリットルの注射器を使用して、下腹部の5ミリリットルの冷たいPBSをマウス腹腔に注入し、腸の穿刺を避ける。マウス腹部の両側に優しいマッサージを行います。その後、腹部の液体を穏やかにゆっくりと吸引します。腹膜液を50ミリリットルの遠心管に分配する。これらの手順を 2~ 3 回繰り返します。4〜8摂氏で400gで10分間、懸濁細胞を遠心分離する。上清を捨て、10%の胎児ウシ血清でRPMI 1640培地中の細胞ペレットを再懸濁する。フローサイトメトリーアッセイ用の6ウェルプレートの各ウェルに500万個の細胞を加え、1ウェルあたり500,000個の細胞を蛍光顕微鏡用の24ウェルプレートに追加します。一晩5%の二酸化炭素インキュベーターで37度センチグリーで細胞を培養する。培養培地は、これらのほとんどがリンパ球であったため、非接着細胞を除去するために3時間後にリフレッシュすることができる。明視野顕微鏡下で細胞を観察し、細胞の生存率と細胞密度を評価します。ここに示す画像は、一次セルの正常な状態であった。通常、マクロファージ細胞密度は高くなく、腹膜細胞の主要な部分がリンパ球であったためである。24ウェルプレートから培養液を取り出します。100マイクロリットルの新鮮な培養培地と10マイクロリットルの細菌培地を加えます。その後、5%の二酸化炭素インキュベーターで37度のセンチグリーでプレートを1時間インキュベートします。非内在性細菌を洗い流すために、ウェルあたり500マイクロリットルの冷たいPBSを3〜5回やさしく洗います。室温で4%ホルムアルデヒドを用いて細胞を室温で30分間インキュベートする。PBSで細胞を3回洗います。F-アクチンを染色するために、ファロイジン633コンジュゲート作業溶液を添加します。暗くて湿度の高い場所に室温で60分間保管してください。DAPIの働く溶液を加えて、細胞核を染色し、室温の暗い場所で5分間インキュベートします。PBSで1回、蒸留水で同じ体積で1回リンスします。緑色に表示されたEGFP発現大腸菌は、食道細胞症のマーカーとして役立った。実験エラーを最小限に抑え、結果を適切に解釈するために、表2に示すように実験用のグループと制御チューブをセットします。氷の上に置かれる対照群の場合は、6ウェルプレートから培地を取り出し、PBSで1回洗浄します。その後、細胞を取り外し、フローサイトメトリーチューブに転送するためにウェルに1ミリリットルの冷たいEDTA 1リットルあたり70ミリモルを追加します。50マイクロリットルの細菌懸濁液をチューブに加え、氷の上に1時間置きます。他のグループについては、培養培地を取り出し、各ウェルに1ミリリットルの新鮮な培地を加える。表2に記載されているグループ設定に従って、50マイクロリットルの細菌懸濁液をウェルに加えます。その後、6ウェルプレートを37度のセンチグリー5%の二酸化炭素インキュベーターに1時間置きます。非内在性大腸菌の蛍光を消光するには、0.8%の結晶紫色水溶液の200マイクロリットルを井戸に加え、まもなく揺れます。このステップは、マクロファージの表面に結合するEGFP E.coliによる偽陽性結果を避けることを意図したが、内部化されていない。PBSで細胞を3回洗浄し、残留した結晶を除去します。その後、細胞を取り外し、フローサイトメトリーチューブに転送するためにウェルに1ミリリットルの冷たいEDTA 1リットルあたり70ミリモルを追加します。チューブ2,000rpmを5分間遠心分離し、上清を捨てる。100マイクロリットルのPBSを加え、細胞を再懸濁する。グループ設定に従って、F4 ATPコンジュゲート抗体を5マイクロリットルチューブまたはアイソタイプに加えます。渦を短時間、暗闇の中で5〜10分間氷上のサンプルをインキュベートします。各チューブと遠心分離機2,000 rpm 5分間に1ミリリットルPBSを加えます。上清を捨てます。細胞ペレットを200~300マイクロリットルのPBSで再懸濁し、フローサイトメトリー解析を行います。各チューブを実行し、F4/80陽性細胞の少なくとも10,000個のイベントのデータを取得します。ここでは、若年のグループからの腹膜マクロファージの蛍光画像です。赤色蛍光はF-アクチンを表す。緑はEGFP発現大腸菌を表し、青色はDAPIによって染色された核を表す。これらの画像は、若いマウスからのマクロファージが老化したマウスのものよりも貪食能力が強いことを示唆している。F4/80陽性およびEGFP陽性細胞は、マクロファージの貪食能力を示した。これらの結果は、蛍光顕微鏡結果の傾向と一致している。さて、先天性免疫細胞の数は老化したマウスに保存されるかもしれませんが、食細胞能力は若いマウスに比べて有意に低下しました。マクロファージ食道を評価するために多くの方法が採用されている。ここでは、便利で迅速かつ経済的に実現可能な改善された方法を示します。EGFP発現大腸菌を使用すると、研究者の好みにより、フローサイトメーターと蛍光顕微鏡の両方で食細胞化アッセイを簡単に行い、測定することができます。またこの方法は、貪食能力を直接測定する。結果は他の間接的な方法よりも再現性が高い。

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Research

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緑色蛍光タンパク質-表現する拡張を使用するマウス腹腔マクロファージの貪食能を評価するために大腸菌

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