Name: In Vitro 逆に HIV 転写、スプライシングのエージェントの待機時間の高スループット (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-22T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 学ぼう、HIV潜伏化逆転薬剤がmRNA処理に与える影響をin vitroで評価する高スループットプロトコル。デュアルカラーリポーター構造体を用いて、転写とスプライシング効果を同時に測定し、ウイルス再活性化と潜伏貯蔵庫の除去に関する知見を提供する。

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この作業は、プロジェクト助成金 APP1129320 とオーストラリアの NHMRC からのプログラム助成金 APP1052979 によって支持されました。この仕事の成功の不可欠な構成要素とアドバイスを提供するため博士アダム ウィートリー、博士マリーナ アレクサンダー、ジェニー l. アンダーソン博士とミシェル Y. リーに感謝します我々 はまた、彼らのアドバイスや本研究で使用される流れの cytometer を維持するために寛大な支援の DMI の流れ施設スタッフを感謝します。

注:クローン作成手順については、変換とシーケンスは、18,19を別の場所で説明します。本プロトコルは哺乳動物発現ベクター (図 3) の導入から開始します。
1. デュアル カラー記者と HEK293T 細胞のトランスフェクションを構築します。
<ol><li>ダルベッコ変法イーグル培地 (DMEM) 10% (v/v) ウシ胎児血清 (FBS)、ペニシリン (100 U/mL)、37 ° C で 5% CO2インキュベーターでストレプトマイシン (100 μ g/mL) を添加した HEK293T 細胞を養う解凍後、トランスフェクションでそれらを使用する前に 2-3 回通過 HEK293T 細胞実験します。これは解凍の手順から回復する細胞の時間を与えるでしょう。 注意:細胞培養のマイコ プラズマ汚染深刻な問題として残っています。よい実験室の練習および細胞培養の定期試験は、マイコ プラズマ汚染のリスクを減らすし、拡散20を避けるために不可欠です。</li>
	<li>1:2 1 日播種前にセルを分割し、新鮮な DMEM 培地にそれらを転送します。37 ° C で 5% CO2インキュベーターで 24 h の細胞を養う</li>
	<li>トランスフェクション、前日吸引によりフラスコからメディアを取り出して、ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) ソリューションのカルシウム (Ca2 +) とマグネシウム (Mg2 +) 無料でセルを洗浄して血清のトレースを削除します。</li>
	<li>培養容器にトリプシン-EDTA 溶液 (0.05% - PBS で 10 mM) 5 mL を分注、2 〜 5 分の 5% CO2インキュベーターで 37 ° c に置きます。</li>
	<li>セルを取り外したら、さらに細胞に損傷を与えるトリプシン活性を阻害する 10% (v/v) FBS 添加 DMEM の 5 mL を追加します。</li>
	<li>上下を千切ってに細胞懸濁液をピペットで優しく再懸濁します。</li>
	<li>トリパン ブルー染色 (0.4%) で、セル 1:10 を希釈します。</li>
	<li>占有しないトリパン ブルー顕微鏡 (対物レンズ 10 倍) と、haemocytometer を使用して生きているセルをカウントします。</li>
	<li>トリパン ブルー色素の希釈係数 (1:10) で染色し、細胞数の平均を取ることと、10,000 を掛け合わせることによって 1 ミリリットルあたりの生菌数を計算します。</li>
	<li>2 x 10 の4セル 10 %dmem 培の 100 μ l をプレート 24 h の 96 ウェル平底プレートに抗生物質がない政府短期証券。</li>
	<li>各ウェルの希釈 400 pLTR.gp140/EGFP の ng。RevD38/下流 20 pCMV RevNL4.3の 100 ng pCMV Tat101AD8の ng-50 μ L の血清の自由な媒体でフラグ DNA。優しく混ぜます。Tat なし実験、マッチの空 Tat ベクトル pcDNA3.1 (-) を使用します。 注:エンドトキシン フリーの DNA を使用することを強くお勧めします。そのため、midi や maxiprep 核酸精製キットを用いたエンドトキシン フリー DNA を準備します。1.7 と 1.9 間べき 260/280 OD の比率を測定することによって DNA の純度を決定します。</li>
	<li>使用前に軽く脂質試薬をミックスし、50 μ L の血清の自由な媒体で 0.65 μ L を希釈します。穏やかに混合し、室温で 5 分間インキュベートします。</li>
	<li>希薄化後の脂質試薬と希釈した DNA を組み合わせます。</li>
	<li>穏やかに混合し、室温で 20 分間インキュベートします。曇り、ソリューションが表示されます。 注:1.15 のステップへ進みます。30 分以内</li>
	<li>セルの上に drop-wise 脂質試薬・ DNA 錯体のウェルあたり 100 μ L を分注します。</li>
	<li>ロッキング プレートを前後で軽く混ぜます。</li>
	<li>
37 ° C で 5% CO2加湿インキュベーターで 5 h 用プレートを孵化させなさい
	<ol>
<li>各反作用の組合せは単一の井戸 (96 ウェル) の transfection のために十分です。量とピペッティング バリエーションのアカウントと薬と、テストされる組み合わせの数に従ってコンポーネントのボリュームを調整します。すべての条件は通常トリプリケートでテストされます。</li>
		<li>100 追加の井戸を transfect 補償目的のための CMV 駆動の EGFP とした DsRed エクスプレス DNA プラスミドの ng。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Transfected HEK293T の治療細胞遅延剤を反転
注:各試験の前に細胞増殖アッセイと薬物の線量の高低に暴露後、細胞の生存率を測定することにより各 LRA の生理学的条件を決定します。
<ol><li>各 LRA 培地で適切な使用濃度に希釈 (例えば、 JQ1(+)) の 1 μ M。 注意:10 mM の濃度に適切な溶媒と凍結乾燥医薬品を再構築します。シングルユース因数 (各 5 μ L) 繰り返し凍結融解サイクルを避けるためにすべて株式 LRAs-80 ° c に格納します。</li>
	<li>慎重にマルチ チャンネルでトランスフェクション培地を吸引し、100 μ L の培適切な LRA (表 1) に置き換えます。デタッチ transfected HEK293T 細胞培養プレート面から簡単にデタッチするのには知られているを避けるために井戸の壁と一緒に非常に優しく中を追加します。</li>
	<li>37 ° C で 5% CO2加湿インキュベーターで 48 h 用プレートを孵化させなさい</li>
</ol>3 フローサイトメトリー解析のため修正可能な生存染付 Transfected セルの染色
注意:死んだ細胞および残骸の取り外しは、偽陽性を排除し、最高品質の結果を得ることが不可欠です。
<ol><li>軽くピペッティング上下 (~ 5 回)、マルチ チャンネルとメディアの泡を回避しながら、ウェルあたりリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 100 μ L を使用してメディアにセルをデタッチします。必要な場合は、トリプシン EDTA 溶液 (0.05% - PBS で 10 mM) の井戸あたり 35 μ L を使用し、血清を含む培地で中和前に 37 ° C で 5 分間の培養皿からセルをデタッチします。</li>
	<li>96 ウェル V 底プレートにセルを転送します。</li>
	<li>4 ° C で 500 × gで 5 分間細胞をスピンし、細胞に触れることがなく媒体/PBS を慎重に吸引します。</li>
	<li>セルを洗浄して 200 μ L の血清タンパク質/無料 PBS で少なくとも 1 時間。</li>
	<li>4 ° C で 5 分間 500 × gで遠心分離し、プレートを傾斜およびセルに触れることがなく洗浄バッファーを削除して上澄みを廃棄します。</li>
	<li>タンパク質/血清無料 PBS で生存率染料 1: 1000 希釈することによって修正可能性色素の実用的なソリューションを準備します。50 μ L/ウェル希薄化後染色の準備をします。 注:性染料は、青、赤、紫のレーザーでの使用に適した色の範囲で利用できます。凍結乾燥の染料 (コンポーネント A) 50 μ L 無水 DMSO (コンポーネント B) の 1 つのバイアルを再修正可能性色素の原液を準備します。単一使用分注 (1 μ L 各)、-20 ° C でストアを光から保護。</li>
	<li>希釈性色素の 50 μ L を各ウェルに追加し、マルチ チャンネルの上下にピペッティングにより細胞をミックスします。</li>
	<li>光から保護、4 ° C で 10-15 分の汚れ。</li>
	<li>洗浄バッファー (1% ウシ血清アルブミン、2 ミリメートルの EDTA と PBS) の 150 μ L で 1-2 回を洗ってください。</li>
	<li>500 x gで 4 ° C で 5 分間遠心上清を捨てます。</li>
	<li>暗闇の中で 4 ° C で 10-15 分の洗浄バッファーの作りたての 1% のホルムアルデヒドの 100 μ L でセルを固定します。 注意:ホルムアルデヒドは非常に有毒であります。手袋と保護のための安全メガネを着用しながら吸入を避けるために発煙のフード 1% ホルムアルデヒド溶液を準備します。</li>
	<li>洗浄バッファーの 100 μ L に 1-2 回細胞を洗浄します。</li>
	<li>500 x gで 4 ° C で 5 分間遠心上清を捨てます。</li>
	<li>洗浄バッファーの 70 μ l 細胞ペレットを再懸濁します。 注:プロトコルはここで一時停止することができます。流れの cytometer で次の日分析のため暗闇の中で 4 ° C で固定セルを格納できます。</li>
</ol>4. EGFP とした DsRed フローサイトメトリーとデータ解析による測定
注:流れの cytometer で HIV 転写 (EGFP %) と選択的スプライシング (% した DsRed) を分析します。70 μ m の細胞ストレーナーまたはノズル目詰まりを避けるために 100 μ m ナイロン メッシュを実行する前にサンプルをフィルター処理します。
<ol><li>Cytometer とコンピューターが少なくとも起動ウォーム アップ レーザーをように使用する前に 10 分。</li>
	<li>サンプルを実行して、データ集録を開始、する前に 0.9% 食塩水で鞘タンクを記入し、廃棄物のタンクに次亜塩素酸ナトリウム タブレットが追加されていることを確認します。</li>
	<li>空気の泡のためのフロー ・ セルを確認します。</li>
	<li>探知器およびフィルターの実験に適していることを確認します。 注:EGFP、青色レーザーの使用 (488 nm) および 530/30 バンドパス、下流エクスプレスが黄色のレーザーを使用して検出された最適中 (561 nm) および 610/20 バンドパス。青色レーザー (488 nm)、610/20 帯域通過はした DsRed 発現を検出するも使用できます。</li>
	<li>キャリブレーション ビーズを実行することによって検出器全体の cytometer 性能と感度を確認します。</li>
	<li>転送を調整 (FSC A) と側 (SSC-A) 散布電圧無染色、主要な人口が画面に表示されるサンプルと明確に識別できます。 注:FSC (前方散乱光)、光計測 SSC (側散乱の場合光)、セル (セル面積またはサイズ) のボリュームに依存する平らな角度に回折に比例している右の角度で光の回折の測定セルの粒度と内部の複雑さ。</li>
	<li>EGFP + した DsRed 検出器と逆に人口の波及を最小限を確保する単染色サンプルを使用して、手動または自動補正を実行します。 注意:補償目的のためには、それぞれ単独で修正可能性色素で染色細胞と同様、単一の色蛍光タンパク質を発現する細胞のサンプルを使用します。分光特性の異なるため EGFP と下流の蛍光タンパク質補償の FITC と PE の補償ビーズを使用しないでください。補正コントロールは、正と負の人口の解決に十分に明るいする必要があります。</li>
	<li>プロットの作成し、蛍光マイナス 1 つ (FMO) コントロールを使用してゲートを設定します。</li>
	<li>取得し、サンプルあたりの 10,000 の生菌イベントの最小を記録します。レーザー迎撃を通過のダブレットを避けるために中または低速でサンプルを実行します。パルス ジオメトリ ゲートなどを使用して、SSC のダブレットを排除するために SSC H 対。安定性を確認 SSC A 対時間をプロットすることによって実行して、どのようにも流れが実行中にします。</li>
	<li>実行の最後に、きれいに濃縮洗浄剤と流れの cytometry 流体工学、5 分のための水します。</li>
	<li>シャット ダウン システム、廃棄物を破棄し、再取得後鞘のタンクを埋めます。</li>
	<li>流れ cytometry データ解析ソフトウェアを使用してデータを分析します。細胞の残骸や塊 (ダブレット) 前方と側面の散布図に基づく除外し、生存率染料染色を使用して死んだ細胞を排除する (負の人口生きているセルを =)。スプライシング製品下流の割合だけでなく、EGFP とした DsRed (図 4) を発現している細胞を識別する/(DsRed + EGFP) (図 5)。</li>
	<li>HIV 転写、スプライシング未処理細胞および個人または LRAs (図 5) の組み合わせにさらされる細胞を比較することによって、LRA の効果を決定します。</li>
</ol>

<ol><li>Siliciano, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+follow-up+studies+confirm+the+stability+of+the+latent+reservoir+for+HIV-1+in+resting+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells.</a> Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).</li>
<li>Khoury, G., et al. Ch. 8. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKhoury%2C+G+%22HIV+vaccine+and+cure+-+The+Path+Towards+Finding+an+Effective+Cure+and+Vaccine%22">HIV vaccine and cure - The Path Towards Finding an Effective Cure and Vaccine</a>. 1075, Springer Nature. Adv Exp Med Biol (2018).</li>
<li>Van Lint, C., Bouchat, S., Marcello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transcription+and+latency%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transcription and latency: an update.</a> Retrovirology. 10, 67(2013).</li>
<li>Archin, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+Expression+Within+Resting+CD4%2B+T+Cells+After+Multiple+Doses+of+Vorinostat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">HIV-1 Expression Within Resting CD4+ T Cells After Multiple Doses of Vorinostat.</a> Journal of Infectious Diseases. 210, 728-735 (2014).</li>
<li>Elliott, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+HIV+Transcription+with+Short-Course+Vorinostat+in+HIV-Infected+Patients+on+Suppressive+Antiretroviral+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Activation of HIV Transcription with Short-Course Vorinostat in HIV-Infected Patients on Suppressive Antiretroviral Therapy.</a> PLoS Pathogens. 10, (2014).</li>
<li>Leth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effect+of+Vacc-4x%2C+recombinant+human+granulocyte+macrophage+colony-stimulating+factor+vaccination%2C+and+romidepsin+on+the+HIV-1+reservoir+%28REDUC%29%3A+a+single-arm%2C+phase+1B%2F2A+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+HIV%22%5BJournal%5D)">Combined effect of Vacc-4x, recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor vaccination, and romidepsin on the HIV-1 reservoir (REDUC): a single-arm, phase 1B/2A trial.</a> The Lancet HIV. 3, e463-e472 (2016).</li>
<li>Rasmussen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panobinostat%2C+a+histone+deacetylase+inhibitor%2C+for+latent-virus+reactivation+in+HIV-infected+patients+on+suppressive+antiretroviral+therapy%3A+a+phase+1%2F2%2C+single+group%2C+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+HIV%22%5BJournal%5D)">Panobinostat, a histone deacetylase inhibitor, for latent-virus reactivation in HIV-infected patients on suppressive antiretroviral therapy: a phase 1/2, single group, clinical trial.</a> The Lancet HIV. 1, e13-e21 (2014).</li>
<li>Søgaard, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Depsipeptide+Romidepsin+Reverses+HIV-1+Latency+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">The Depsipeptide Romidepsin Reverses HIV-1 Latency In Vivo.</a> PLoS Pathogens. 11, (2015).</li>
<li>Bartholomeeusen, K., Xiang, Y., Fujinaga, K., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bromodomain+and+extra-terminal+%28BET%29+bromodomain+inhibition+activate+transcription+via+transient+release+of+Positive+Transcription+Elongation+Factor+b+%28P-TEFb%29+from+7SK+small+nuclear+ribonucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Bromodomain and extra-terminal (BET) bromodomain inhibition activate transcription via transient release of Positive Transcription Elongation Factor b (P-TEFb) from 7SK small nuclear ribonucleoprotein.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 36609-36616 (2012).</li>
<li>Boehm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BET+bromodomain-targeting+compounds+reactivate+HIV+from+latency+via+a+Tat-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">BET bromodomain-targeting compounds reactivate HIV from latency via a Tat-independent mechanism.</a> Cell Cycle. 12, 452-462 (2013).</li>
<li>Contreras, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suberoylanilide+hydroxamic+acid+reactivates+HIV+from+latently+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Suberoylanilide hydroxamic acid reactivates HIV from latently infected cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (11), 6782-6789 (2009).</li>
<li>Rasmussen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+HDAC+inhibitors+in+clinical+development%3A+effect+on+HIV+production+in+latently+infected+cells+and+T-cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+%26+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Comparison of HDAC inhibitors in clinical development: effect on HIV production in latently infected cells and T-cell activation.</a> Human Vaccines & Immunotherapeutics. 9 (5), 993-1001 (2013).</li>
<li>Wei, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+deacetylase+inhibitor+romidepsin+induces+HIV+expression+in+CD4+T+cells+from+patients+on+suppressive+antiretroviral+therapy+at+concentrations+achieved+by+clinical+dosing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Histone deacetylase inhibitor romidepsin induces HIV expression in CD4 T cells from patients on suppressive antiretroviral therapy at concentrations achieved by clinical dosing.</a> PLoS Pathogens. 10 (4), e1004071(2014).</li>
<li>Blazkova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+histone+deacetylase+inhibitors+on+HIV+production+in+latently+infected%2C+resting+CD4%28%2B%29+T+cells+from+infected+individuals+receiving+effective+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Effect of histone deacetylase inhibitors on HIV production in latently infected, resting CD4(+) T cells from infected individuals receiving effective antiretroviral therapy.</a> Journal of Infectious Diseases. 206 (5), 765-769 (2012).</li>
<li>Bullen, C. K., Laird, G. M., Durand, C. M., Siliciano, J. D., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+ex+vivo+approaches+distinguish+effective+and+ineffective+single+agents+for+reversing+HIV-1+latency+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">New ex vivo approaches distinguish effective and ineffective single agents for reversing HIV-1 latency in vivo.</a> Nature Medicine. 20 (4), 425-429 (2014).</li>
<li>Yukl, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+latency+in+isolated+patient+CD4%2BT+cells+may+be+due+to+blocks+in+HIV+transcriptional+elongation%2C+completion%2C+and+splicing%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">HIV latency in isolated patient CD4+T cells may be due to blocks in HIV transcriptional elongation, completion, and splicing.</a> Science Translational Medicine. 10, (2018).</li>
<li>Lassen, K. G., Ramyar, K. X., Bailey, J. R., Zhou, Y., Siliciano, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+retention+of+multiply+spliced+HIV-1+RNA+in+resting+CD4%2BT+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Nuclear retention of multiply spliced HIV-1 RNA in resting CD4+T cells.</a> PLoS Pathogens. 2, 0650-0661 (2006).</li>
<li>Alexander, M. R., Wheatley, A. K., Center, R. J., Purcell, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transcription+through+an+intron+requires+the+binding+of+an+Sm-type+U1+snRNP+with+intact+stem+loop+II+to+the+splice+donor%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Efficient transcription through an intron requires the binding of an Sm-type U1 snRNP with intact stem loop II to the splice donor.</a> Nucleic Acids Research. 38, 3041-3053 (2010).</li>
<li>Anderson, J. L., Johnson, A. T., Howard, J. L., Purcell, D. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Both+Linear+and+Discontinuous+Ribosome+Scanning+Are+Used+for+Translation+Initiation+from+Bicistronic+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+env+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Both Linear and Discontinuous Ribosome Scanning Are Used for Translation Initiation from Bicistronic Human Immunodeficiency Virus Type 1 env mRNAs.</a> Journal of Virology. 81, 4664-4676 (2007).</li>
<li>Nikfarjam, L., Farzaneh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+and+detection+of+Mycoplasma+contamination+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+J%22%5BJournal%5D)">Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture.</a> Cell J. 13 (4), 203-212 (2012).</li>
<li>Khoury, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+latency+reversing+agents+act+through+Tat+post+translational+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV latency reversing agents act through Tat post translational modifications.</a> Retrovirology. 15 (1), 36(2018).</li>
<li>Hakre, S., Chavez, L., Shirakawa, K., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+latency%3A+experimental+systems+and+molecular+models%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">HIV latency: experimental systems and molecular models.</a> FEMS Microbiology Reviews. 36 (3), 706-716 (2012).</li>
<li>Dahabieh, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+non-productive+HIV-1+infection+in+a+T-cell+line+is+driven+by+cellular+activation+state+and+NFkappaB%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Direct non-productive HIV-1 infection in a T-cell line is driven by cellular activation state and NFkappaB.</a> Retrovirology. 11, 17(2014).</li>
<li>Calvanese, V., Chavez, L., Laurent, T., Ding, S., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-color+HIV+reporters+trace+a+population+of+latently+infected+cells+and+enable+their+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Dual-color HIV reporters trace a population of latently infected cells and enable their purification.</a> Virology. 446 (1-2), 283-292 (2013).</li>
<li>Chavez, L., Calvanese, V., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+Latency+Is+Established+Directly+and+Early+in+Both+Resting+and+Activated+Primary+CD4+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">HIV Latency Is Established Directly and Early in Both Resting and Activated Primary CD4 T Cells.</a> PLoS Pathogens. 11 (6), e1004955(2015).</li>
<li>Hunninghake, G. W., Monick, M. M., Liu, B., Stinski, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoter-regulatory+region+of+the+major+immediate-early+gene+of+human+cytomegalovirus+responds+to+T-lymphocyte+stimulation+and+contains+functional+cyclic+AMP-response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The promoter-regulatory region of the major immediate-early gene of human cytomegalovirus responds to T-lymphocyte stimulation and contains functional cyclic AMP-response elements.</a> Journal of Virology. 63 (7), 3026-3033 (1989).</li>
<li>Reeves, M., Sinclair, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspects+of+human+cytomegalovirus+latency+and+reactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Aspects of human cytomegalovirus latency and reactivation.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 325, 297-313 (2008).</li>
<li>Sambucetti, L. C., Cherrington, J. M., Wilkinson, G. W., Mocarski, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappa+B+activation+of+the+cytomegalovirus+enhancer+is+mediated+by+a+viral+transactivator+and+by+T+cell+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">NF-kappa B activation of the cytomegalovirus enhancer is mediated by a viral transactivator and by T cell stimulation.</a> EMBO Journal. 8 (13), 4251-4258 (1989).</li>
<li>Kula, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+HIV-1+RNA+associated+proteome+identifies+Matrin+3+as+a+nuclear+cofactor+of+Rev+function%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the HIV-1 RNA associated proteome identifies Matrin 3 as a nuclear cofactor of Rev function.</a> Retrovirology. 8, 60(2011).</li>
<li>Kula, A., Marcello, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Post-Transcriptional+Regulation+of+HIV-1+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Dynamic Post-Transcriptional Regulation of HIV-1 Gene Expression.</a> Biology (Basel). 1 (2), 116-133 (2012).</li>
<li>Yedavalli, V. S., Jeang, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rev-ing+up+post-transcriptional+HIV-1+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Rev-ing up post-transcriptional HIV-1 RNA expression.</a> RNA Biology. 8 (2), 195-199 (2011).</li>
<li>Zolotukhin, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PSF+acts+through+the+human+immunodeficiency+virus+type+1+mRNA+instability+elements+to+regulate+virus+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">PSF acts through the human immunodeficiency virus type 1 mRNA instability elements to regulate virus expression.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (18), 6618-6630 (2003).</li>
<li>Laird, G. M., Rosenbloom, D. I., Lai, J., Siliciano, R. F., Siliciano, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+Frequency+of+Latent+HIV-1+in+Resting+CD4%28%2B%29+T+Cells+Using+a+Limiting+Dilution+Coculture+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring the Frequency of Latent HIV-1 in Resting CD4(+) T Cells Using a Limiting Dilution Coculture Assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1354, 239-253 (2016).</li>
<li>Cary, D. C., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+latent+reservoir+to+achieve+functional+HIV+cure%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Res%22%5BJournal%5D)">Targeting the latent reservoir to achieve functional HIV cure.</a> F1000Res. 5, (2016).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resting+CD4%2B+T+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29-infected+individuals+carry+integrated+HIV-1+genomes+within+actively+transcribed+host+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Resting CD4+ T cells from human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-infected individuals carry integrated HIV-1 genomes within actively transcribed host genes.</a> Journal of Virology. 78 (12), 6122-6133 (2004).</li>
<li>Laird, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+analysis+identifies+effective+HIV-1+latency+-+reversing+drug+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Ex vivo analysis identifies effective HIV-1 latency - reversing drug combinations.</a> Journal of Clinical Investigation. 125, 1901-1912 (2015).</li>
<li>Lenasi, T., Contreras, X., Peterlin, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+interference+antagonizes+proviral+gene+expression+to+promote+HIV+latency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Transcriptional interference antagonizes proviral gene expression to promote HIV latency.</a> Cell Host Microbe. 4 (2), 123-133 (2008).</li>
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著者が明らかに何もありません。

測定前のヴィヴォ ウイルス再活性化の難しさを考えると、モデルは、潜伏を含む HIV 待ち時間を研究するために時間をかけて開発された生体外で幅広い感染 T 細胞-ライン (J-ラッツ、ACH2、U1)、(の休息の潜在的な感染症の主要なモデルO ' doherty、レヴィン、グリーン、スピナ モデル) または事前活性化 cd 4 + T 細胞 (サフ、マリーニ、Planelles、Siliciano、カーン モデル) 単一のラウンドまたはレプリケーション主務記者ウイルス22。HIV 待機時間静止 cd4 陽性 T 細胞の生理学的条件をモデル化するには、デュアル蛍光レポーター系続いた LTR 駆動ギャグ eGFP マーカーと場所に CMV 駆動 mCherry イワン ・ サドースキーのグループによって開発された rgh 氏 (赤-緑-HIV) 記者などNef23。同じようなデュアル カラー記者ウイルス、デュオ-蛍光は EGFP の LTR 駆動式と EF1α プロモーター24によって駆動 mCher...

効果的な長期的な抗レトロ ウイルス療法にもかかわらず HIV は潜伏状態でメモリー cd4 陽性 T 細胞1の統合 provirus として保持します。HIV 1 5 のクロマチン構造 ' 長いターミナル繰り返し (方向 LTR) のプロモーターとエピジェネティック修飾ヒストンのメチル化、脱アセチル化ヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) し、DNA メチル基転移酵素 (DNMT) などにつながる重要なメカニズムは、転写抑制およびこうして統合後待機時間2,3。In vitro におけるウイルス産生を誘導するため待機時間逆転エージェント (LRAs) の大きい変化を調べたし、から生体内で潜在感染休憩 cd4 陽性 T 細胞4,5,6,7 ,8。LRAs 間テスト、HDACi (HDAC の抑制剤)、ベット ブロモ ドメイン阻害剤 (ベティス) クロマチン decondensation と正の転写伸長因子 b (P TEFb) のリリースをそれぞれ誘導する、転写の緩和以降につながる5' LTR の抑圧と HIV 式9,10、11,12,13の活性化。ただし、ex vivo14,15だけ細胞の, HIV mRNA (米国 RNA)、ウイルスの転写を示すものの緩やかな増加がみられたように、これら LRAs により再活性化量は限られていた。重要なは、これら LRAs も潜伏感染細胞の頻度の低下を誘導するために失敗しました。
HIV 式は、スプライシングは、乗算の HIV RNA (MS RNA)17の核外輸送の欠陥と同様、非能率的なスプライシング16によってさらに制限があります。したがってより強力なウイルス生産統合後の異なる側面に影響を与えることができます LRAs の識別の新しいクラスが必要です。さらに、効率的に待機時間を逆に最適な化合物の定義に役立つ新規アッセイの開発が必要です。
ここでは、プロトコルが表示され、HIV LTR 駆動転写、スプライシングの介入の影響の機能評価のための高スループット アプローチを利用します。簡単に言えば、新しい LTR 駆動のデュアル レポーター システム pLTR.gp140/EGFP を色します。RevΔ38/下流 (図 1) は、フローサイトメトリーによって hiv 感染の再活性化を評価するために使用されます。スプライシングは、mRNA (2 kb) の式はDiscosoma の sp赤 (下流) の蛍光蛋白質の表現につながるこの蛍光レポーターで, HIV mRNA (4 kb) の発現は強化された緑の蛍光蛋白質 (EGFP) 式に します。簡単に言えば、蛍光の Env EGFP の融合蛋白質は、gp140unc を使用しました。EGFP、EGFP のコーディング シーケンスが封筒 (Env) の非劈開と切り捨てられた形でフレームに配置された場所。Gp120 と gp41 EGFP、Env の解離を防ぐ胸の谷間サイトをアブレーションする可溶性の Env のアナログは、正しい折り畳みが容易になりますを作成する膜貫通ドメイン前 gp160 タンパク質を切り捨てるため、変更が導入されたとEGFP の発現。それが 4 kb のenvの核細胞質の輸出を仲介する核に局在する Rev セル内の式、時 rev 応答要素 (RRE) との相互作用を介して mRNA。Env の切り捨て gp120 と gp41、A7 3' スプライス部位のある RRE 妥協をしません。このシステムは、HIV - 1 選択的スプライシング ドナー 4 (SD4) をスプライスし、スプライスの受容体 7 (SA7) 結果は 2 kb の mRNA Rev の非機能性タンパク質アミノ酸 38 で切り捨てをエンコード融合した DsRed 蛍光蛋白質、RevΔ38 下流に。簡単に言えば、下流は重複延長18アミノ酸 38 で Rev の 2ndエクソンに挿入されました。MRNA の核輸出を容易にするには、エンコード Rev (pCMV RevNL4.3) 哺乳類発現ベクターは蛍光レポーター構成 (図 2) と co transfected だった。ここで説明したこのユニークな記者のコンス トラクターは、HIV 転写とウイルスのベクトルを使用することがなく、スプライシングの高スループット評価に便利です。

<table><tbody><tr><td>細胞培養</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293T細胞(ヒト胚性腎臓細胞)</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>SV40複製領域を持つベクターを複製します。</td></tr><tr><td>ダルベッコ修正イーグルス培地 (DMEM 1x + GlutaMAX-I)</td><td>Gibco</td><td>10569-010</td><td>+ 4.5 g/L D-グルコース + 110 mg/L ピルビン酸</td></tr><tr><td>ナトリウム ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td>原産地 オーストラリア</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Σ</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS)、カルシウム、マグネシウムなし</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルーステイン、0.4%</td><td>Gibco</td><td>15250</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.05%)、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>脂質トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>Opti-MEM I (1x) 還元血清培地</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>無血清培地</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi</td><td>Marcherey-Nagel</td><td>740414.50</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1プラスミド</td><td>Clontech(TaKaRa)</td><td>6085-1</td><td>哺乳類細胞におけるEGFPの発現、CMVIEプロモーター。</td></tr><tr><td>pDsRed-Express-N1</td><td>Clontech(TaKaRa)</td><td>632429</td><td>哺乳類細胞におけるDsRed-Expressの発現、CMVIEプロモーター。</td></tr><tr><td>pLTR.gp140/EGFPです。RevD38/DsRed</td><td>Addgene</td><td>115775</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-RevNL4.3</td><td>Addgene</td><td>115776</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-Tat101AD8-Flag</td><td>Addgene</td><td>115777</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td><td>Millipore</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>JQ1(+)</td><td>Cayman Chemical</td><td>11187</td><td>DMSO 中の 10 mM のストック; 使用濃度 1 &mu;M</td></tr><tr><td>JQ1(-)</td><td>ケイマンケミカル</td><td>11232</td><td>DMSO 中の 10 mM のストック; 使用濃度 1 &mu;M</td></tr><tr><td>ホルボールミリスチン酸酢酸 (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16561-29-8</td><td>100 &mu;DMSO中のg / mL;作業濃度 10 nM</td></tr><tr><td>Phytohaemagglutinin (PHA)</td><td>Remel</td><td>HA15/R30852701</td><td>Stock at 1 &mu;g/&mu;PBSのL。作業濃度 10 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>ボリノスタット (VOR)</td><td>ケイマン ケミカル</td><td>10009929</td><td>DMSO 中の 10 mM ストック; 使用濃度 0.5 &mu;M</td></tr><tr><td>Panobinostat (PAN)</td><td>TRC</td><td>P180500</td><td>DMSO 中の 10 mM のストック; 作業濃度 30 nM</td></tr><tr><td>CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay</td><td>Promega</td><td>63581</td><td></td></tr><tr><td>Venor GeM Classic</td><td>Minerva Biolabs</td><td>11-1100</td><td>マイコプラズマ検出キット、PCR ベース</td></tr><tr><td>名前</strong<></td><td>strong>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Flow cytometry 試薬</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSR Fortessa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow cytometer (4 レーザー - 青、赤、紫、黄)</td></tr><tr><td>LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>フローサイトメーター (3 レーザー - 青、赤、紫)</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 固定可能 Near-IR DeadCell Stain Kit</td><td>Life Technologies</td><td>L34976</td><td>Viability dye:633または635 nmの励起用、400アッセイ。コンポーネントAとBはどちらもキットに含まれています。</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Σ</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0.5M pH8</td><td>Gibco</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド溶液 37/10 (37%)</td><td>Chem-Supply</td><td>FA010</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Diva CS&T研究ビーズ</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>655050</td><td>キャリブレーションビーズ</td></tr><tr><td>Spheroレインボーキャリブレーション粒子(8ピーク)</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>559123</td><td>3.0 - 3.4 mm</td></tr><tr><td>シース溶液</td><td>Chem-Supply</td><td>SA046</td><td>90 g NaCl 10 L水</td></tr><tr><td>HAZ-Tabs</td><td>ゲストメディカル</td><td>H8801</td><td>消毒用塩素放出錠剤</td></tr><tr><td>Decon 90</td><td>Decon Laboratories Limited</td><td>N/A</td><td>フローサイトメーターの濃縮洗浄剤。作業溶液デコン90 5%。</td></tr><tr><td>次亜塩素酸ナトリウム(12-13%溶液)</td><td>Labco</td><td>SODHYPO-5L</td><td>フローサイトメーターの濃縮洗浄剤。作業溶液漂白剤1%。</td></tr><tr><td></td><td>7x MPBio</td><td>IM76670</td><td>フローサイトメーターの濃縮洗浄剤。作業溶液7x 1%。</td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>材料</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>組織培養フラスコ(75 cm2、傾いた首、キャップベント)</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>組織培養プレート(96ウェル平底)蓋付き)</td><td>Costar</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>組織培養プレート (96 ウェル V 底蓋なし)</td><td>Costar</td><td>3896</td><td></td></tr><tr><td>遠心チューブ (10 mL)</td><td>SARSTEDT</td><td>62.9924.284</td><td>100x16 mm</td></tr><tr><td>遠心チューブ (50 mL)</td><td>CellStar</td><td>227261</td><td>30x115 mm</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ (1.5 mL)</td><td>Corning Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Serologicalピペット(25 mL)、滅菌済み</td><td>Corning</td><td>CLS4489-200EA</td><td></td></tr><tr><td>血清学的ピペット(10 mL)、滅菌済み</td><td>Corning</td><td>CLS4488-200EA</td><td></td></tr><tr><td>血清学的ピペット(5 mL)、滅菌済み</td><td>Corning</td><td>CLS4487-200EA</td><td></td></tr><tr><td>試薬リザーバー(50 mL)、滅菌済み</td><td>Corning</td><td>CLS4470-200EA</td><td></td></tr><tr><td>5 mL丸底ポリスチレン試験管、セルストレーナーキャップ付き</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>12 x 75 mm スタイル、70 mm</td></tr><tr><td>ナイロン メッシュ</td><td>SEFAR</td><td>03-100/32</td><td>100 mm</td></tr><tr><td>タイターチューブ マイクロ試験管、バルク</td><td>BIO-RAD</td><td>2239391</td><td>マイクロファクトチューブ</td></tr><tr><td>5 mL 丸底ポリスチレン試験管、キャップなし</td><td>コーニング</td><td>352008</td><td>12x75 mm</td></tr><tr><td>試験管用スナップキャップ</td><td>コーニング</td><td>352032</td><td></td></tr><tr><td>カウンティングチャンバー、ノイバウアーはダブルネットルーリングを改善しました、ブライトライン(血球計算盤、LO-Laboroptik)</td><td>ProSciTech</td><td>SVZ4NIOU</td><td>1 mm2の3x3大きな正方形。奥行き0.100 mm;容量0.1mL;最小面積 0.0025 mm2</td></tr><tr><td>カバースリップ (Menzel-Gl&auml;ser)</td><td>Grale Scientific</td><td>HCS2026</td><td>20 x 26 mm</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ニコン TMS</td><td>310528</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機 5810R</td><td></td><td>5811000487</td><td>15/50 mLコニカルチューブ用アダプターを含むローター A-4-81 付き</td></tr><tr><td>FLUOstar Omega マイクロプレートリーダー</td><td>BMG Labtech</td><td>N/A</td><td>細胞増殖アッセイ用プレートリーダー。フィルター490nm。</td></tr><tr><td>名前<</td><td>strong>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Flow Cytometerデータ収集および分析プログラム、バージョン8.0.1</em</td></tr><tr><td>>FlowJo</td><td>FlowJo</td><td>FlowJo 10.4.2</td><td>Flow cytometerデータ解析プログラム、FlowJo Engine v3.05481</td></tr><tr><td>Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>FLUOstar multi-user reader control, version 5.11</em</td></tr><tr><td>>Omega - Data Analysis</td><td>BMG Labtech</td><td>MARS</td><td>FLUOstar data analysis, version 3.20R2</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>Excel:mac 2011</td><td>バージョン 14.0.0</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>Prism 7</td><td>バージョン 7.0c</td></tr></tbody></table>

in vitro 逆に hiv 転写、スプライシングのエージェントの待機時間の高スループット

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

Hiv 感染細胞の貯水池、港湾の免疫システムには見えないままで、現在の抗レトロ ウイルス療法 (カート) では対象にならないウイルスの安定性と潜在的なフォームの存在により不治のまま。転写・ スプライシングは、静止 cd4 陽性 T 細胞の hiv-1 潜伏を補強するために示されています。「衝撃と殺す」アプローチにおける待機時間逆転剤 (LRAs) の使用による潜時の逆転この貯水池をパージする試みで広く研究されているが、ない十分な小型の開発の欠乏のための臨床試験にも成功を示しているこれまでのところ分子を効率的にこの貯水池を混乱させることができます。ここで提示されたプロトコルは、確実かつ効率的に HIV 転写待ち時間逆転エージェント (LRAs) の評価と選択的スプライシングのメソッドを提供します。このアプローチは、フローサイトメトリーによる転写、スプライシング、LRA の効果を同時に測定することができます LTR 駆動のデュアル カラー記者の使用に基づいています。ここで説明されているプロトコルは付着性のセルとして懸濁液の細胞に適しています。高スループットのシステムで多数の薬をテストするために便利です。シンプルに実装してコスト効果の高い方法は技術的にあります。また、フローサイトメトリーの使用セル実行可能性の評価を可能にし従って同時に毒性の薬物。

HIV-1 の式 (EGFP), こさと次のブロモ ドメイン阻害剤 JQ1 による治療 (下流) 製品の代表的な結果は図 5のとおりです。JQ1(+) と Tat 大幅 EGFP を発現する細胞の割合を増加させた (DMSO を 2.18 と 4.13 FC それぞれ; n = 3), 成績証明書を示す。また、Tat と似たようなレベルにスプライシング製品 (DMSO 上 7.37 FC) の割合だけでなく、下流 (DMSO に 46.6 FC) を発現する細胞の割合の増加に大幅 JQ1(+) (59.6 と 5.83 FC、DMSO をそれぞれ) JQ1(+) の能力を確認します。HIV 転写、スプライシングに。その一方で、立体制御 JQ1(-) による治療は HIV 転写、スプライシング、プロトコルの成功を確認 JQ1(+) 効果を廃止します。
最近の出版物、RNA 解析 HIV の蓄積ス...

HIV の効率的な再活性化の機能評価および潜在的な proviruses のクリアランスのための高いスループット プロトコル説明および HIV 転写の介入の影響をテストおよび選択的スプライシングによって適用しました。LTR 駆動の転写に対するエージェントの逆転と融着接続の遅延の効果の代表的な結果を提供しています。

In Vitro 逆に HIV 転写、スプライシングのエージェントの待機時間の高スループット

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

この手順の全体的な目標は、in vitro、HIV mRNA処理に対する遅延逆転剤の影響を評価することです。このプロトコルは、HIV転写およびスプライシングに対するLRAの効果を同時に評価するための、簡単で効率的で信頼性の高い方法を提供します。この技術は、潜伏貯留層のウイルス再活性化およびクリアランスを誘導するLRAの能力に関する洞察を提供した。細胞を培養した後、そのうちの20,000をDMEM培地の100マイクロリットルに入れ、10%FBSを補充し、96ウェルの平らな底板の井戸に抗生物質を24時間入れます。翌日、デュアルカラーレポーターの構成を希釈します。50マイクロリットルの無血清培地でタットDNAとレヴDNAを、穏やかに混ぜます。脂質試薬を軽く混ぜ、その後、血清遊離培地の50マイクロリットルで反応ごとに0.65マイクロリットルを希釈します。やさしく混ぜ、室温で5分間インキュベートします。希釈した脂質試薬と希釈したDNAを組み合わせ、軽く混ぜます。室温で20分間インキュベートします。次いで、この脂質試薬DNA複合体の100マイクロリットルを、各ウェルの細胞の上に、微小に滴下する。プレートを軽く前後に揺らし、混ぜます。加湿インキュベーターでプレートを5%の二酸化炭素で摂氏37度で5時間インキュベートします。この後、CMV駆動EGFPおよびDsRedの100ナノグラムで追加のウェルをトランスフェクトし、補償目的でDNAプラスミドを発現させる。開始するには、各遅延反転剤を、成長培地を使用して適切な作業条件に希釈します。マルチチャネルパイプヘッドを用いて、トランスフェクション媒体を慎重に吸引し、適当なレイテンシ反転剤を含む培地100マイクロリットルに交換する。加湿インキュベーターで37%摂氏で5%の二酸化炭素を48時間インキュベートします。細胞の染色を開始するには、マルチチャネルパイプヘッドを使用して、各ウェルに100マイクロリットルのPBSを追加します。頭を上下に約5回軽くパイプします。メディアに細胞を取り外すために泡立つのを避けるようにしながら。次に、細胞を96ウェルVボトムプレートのウェルに移します。500倍の重力で遠心分離機、摂氏4度で5分間。培地とPBSを細胞に触れずに吸引する。タンパク質と血清を含まないPBSの200マイクロリットルで、細胞を少なくとも1回洗浄してください。500倍の重力で遠心分離機、摂氏4度で5分間。プレートを傾けて上清を捨て、細胞に触れることなく洗浄バッファーを取り除きます。この後、タンパク質および血清遊離PBS中の固定生生存性染料を1〜1000の割合で希釈した後、働く溶液を調製した。希釈した染料50マイクロリットルを各ウェルに加え、ヘッドを上下にパイプで混ぜます。摂氏4度でインキュベートする。10〜15分間ホイルを使用して光から保護しながら。その後、150マイクロリットルの洗浄バッファーで細胞を1〜2回洗浄します。その後、500倍の重力で遠心分離し、5分間摂氏4度で上清を捨てます。細胞を固定するには、100マイクロリットルの作りたての1%ホルムアルデヒドと洗浄バッファーを加えます。そして、10〜15分間光から保護しながら、摂氏4度でインキュベートします。この後、100マイクロリットルの洗浄バッファーで細胞を1〜2回洗浄します。500倍の重力で遠心分離機、摂氏4度で5分間。上清を捨て、細胞ペレットを70マイクロリットルの洗浄バッファーに再懸濁する。キャリブレーションビーズを実行してサイトメーターの設定性能と感度を確認した後、主母集団が画面上にあり、はっきりと識別できるように、染色されていないサンプルで前方および側の散乱電圧を調整します。単一の染色されたサンプルを使用して手動または自動補償を行い、EGFP陽性母集団のDsRed検出器への流出を最小限に抑え、その逆も可能です。蛍光から1つのコントロールを引いたものを使用して、プロットを作成し、ゲートを設定します。次に、主母集団が画面上にあり、はっきりと識別できるように、順方向および側面の散乱電圧を染色されていないサンプルで調整します。サンプルごとに最低 10,000 個の実行可能なセル イベントを取得して記録します。その後、フローサイトメトリーデータ解析ソフトウェアを用いて、テキストプロトコルに概説されているようにデータを解析する。HIV-1の発現に関する代表的な結果は、非スプライシングおよびスプライシングされた製品が、ブロモドメイン阻害剤JQ1で処理した後、JQ1陽性およびTatの両方が、EGFPを発現する細胞の割合を有意に増加することを示す。これは、非スプライシングされたトランスクリプトを示しています。JQ1陽性もまた、DsRedを発現する細胞の割合を有意に増加させることが分かる。そして、Tatと同様のレベルにスプライスされた製品の割合を増やします。これは、Hivの転写およびスプライシングをオンにするJQ1陽性の能力を確認する。しかしながら、立体異性体対照JQ1陰性での治療は、HIV転写およびスプライシングに対するJQ1陽性作用を廃止する。一度マスターすると、この方法は、個別に、または組み合わせて薬物を使用して行うことができる。効率的に相乗効果を発揮する能力をテストする。これは、薬物と毒性の低用量につながるだろう.各開発の後、この技術は、ex vivo患者サンプルにおける待ち時間の一次モデルにおける効率的な薬剤の組み合わせをテストする道を開いた。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

脱殻は、HIV - 1のライフサイクルの初期段階に必須の工程であるとカプシド殻の分解とウイルスリボ核タンパク質複合体（vRNP）のリリースとして定義されています。ここで、我々はHIV -...

HIV - 1コアのin vitroでの脱殻で

Source: Scarborough, R. J., et al. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates a reverse transcriptase (RT) assay to assess the effect of a test RNA on virus-like particle (VLP) production. Cells are co-transfected with plasmids, and RT activity is measured as a quantitative indicator of VLP output. A decrease in RT activity reflects suppression of viral gene expression by the test RNA.

Reverse Transcriptase Activity as a Marker for Virus-Like Particle Production

ここでは、細胞毒性を説明し、化合物の迅速かつ正確なスクリーニングを可能にする単一ラウンド感染性アッセイは、それらの細胞傷害性（CC 50）を決定し、WTおよび薬物耐性HIV-1に対するIC 50値を示す。...

HIV逆転写酵素及びインテグラーゼ阻害剤の迅速なスクリーニング

HIV-1の病因は、ウイルスの特性と宿主の遺伝的要因の両方によって定義されます。ここでは、gag遺伝子配列の変異がウイルスのin...

評価するために制限酵素ベースのクローニング方法<em&gt;インビトロ</em&gt; HIV-1サブタイプC Gag特異MJ4キメラウイルスの複製能力

感染した細胞のゲノムDNAからレトロウイルス統合部位を増幅し、増幅されたウイルス-宿主ジャンクションを配列決定し、次にこれらの配列を参照ゲノムにマッピングするためのプロトコルを記述します。また、BEDToolsを使用して、さまざまなゲノムアノテーションに対する統合部位の分布を定量化する手法についても説明します。...

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

HIV-1複製サイクルの統合後のステップを標的とするRNA分子の有効性と毒性を評価する方法が説明されています。これらの方法は、新しい分子をスクリーニングし、既存の分子のフォーマットを最適化するのに役立ちます。...

遺伝子または薬物療法で使用するためのHIV-1産生を標的RNAの有効性および毒性の評価

この報告は、急性感染細胞の細胞質抽出物中のヒト免疫不全ウイルス1型(HIV-1)プレインテグレーションコンプレックス(PIC)関連統合活性を測定するためのin vitroアッセイについて説明しています。PIC関連HIV-1...

の測定インビトロ HIV-1プレインテグレーション複合体の統合活動

HIV 1 融合を介して流れ cytometry または蛍光顕微鏡による検出可能な緑の蛍光蛋白質の表現を報告する細胞に基づく試金を記述します。無料のセル、セルを感染システムでウイルスのエントリ (特にの融合手順)...

高スループットの Cre Lox 活性化ウイルスの膜融合アッセイの HIV-1 ウイルス膜融合阻害剤を識別するために

このプロトコルは、ひと造血幹細胞の放射線-調節された新生児 NSG マウス注入肝を介してヒト化マウス (胡 NSG) を確立するためのメソッドを提供します。胡 NSG マウス HIV 感染および組合せの抗レトロ ウイルス療法 (カート) に敏感であるし、HIV...

ヒト NOD/SCID/IL2rγ のnull (胡 NSG) マウスは、HIV 複製の遅延研究のモデルします。

初期 3' 末端の公平な測定だけでなく、単一座礁させた DNA の分子の変異プロファイルを提供するディープ シーケンス アプローチをご紹介します。メイン アプリケーションは、初期のレトロ ウイルス相補的 Dna (Cdna)、レトロ...

決定の 3' 末端と HIV-1 の間に初期の一本鎖のウイルス DNA 分子のシーケンスを逆に感染細胞における転写

ここでは、特にHIV-1感染に重点を置いて、小胞体(ER)ストレスとアンフォールデッドタンパク質応答(UPR)の活性化を決定するためのいくつかの確立された方法について説明します。この記事では、ER ストレス/UPR が HIV-1...

HIV-1感染T細胞における小胞体ストレスとアンフォールドタンパク質応答の測定とHIV-1複製におけるその役割の解析

学ぼう、HIV潜伏化逆転薬剤がmRNA処理に与える影響をin vitroで評価する高スループットプロトコル。デュアルカラーリポーター構造体を用いて、転写とスプライシング効果を同時に測定し、ウイルス再活性化と潜伏貯蔵庫の除去に関する知見を提供する。

In Vitro 逆に HIV 転写、スプライシングのエージェントの待機時間の高スループット

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