式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製
2019年1月7日
このプロトコルは、バキュロ ウイルス システムを効率的に最小限の労力と毒性、蛋白質の抽出、精製、哺乳類細胞の遺伝子を表現するために使用を含むクライオ電子顕微鏡によるイオン チャネルの構造を決定するために使用方法をについて説明します品質チェック、サンプル グリッドとスクリーニングと同様、データ収集と処理。
このプロトコルは、重要な、しかし研究されたイオンチャネルの家族のメンバーであるヒトTRPC3の構造を解決することを可能にしました。この技術の主な利点は、構造と機能の両方の研究のために、様々なタンパク質を発現し、精製するために適用することができる高効率です。この方法は、タンパク質の生化学や生物理学の研究に使用するための効率的なタンパク質発現および精製システムを提供し、多種多様なイオンチャネルおよび他の膜タンパク質に適用することができる。
まず、ウイルス産生培養物のサンプル中のウイルスのGFP蛍光を見て、相対的なウイルス発現を確認する。十分なサイズのバッフル底アーレンマイヤー培養フラスコでは、HEK293哺乳動物細胞懸濁液培養液の望ましい体積を調製し、1ミリリットル当たり35〜380万個の細胞を発現培地中で、1%無菌FBSを添加する。調製されたP2ウイルスストック溶液の体積%を加え、摂氏37度と135 RPMでオービタルシェーカーにインキュベートします。
感染後12〜18時間で10ミリモルのナトリウムブタイレートを加えて、最適なタンパク質発現に必要な時間を摂氏30度でインキュベートする。この後、細胞を収穫するために2、880倍の重力で遠心分離を行った。収穫した細胞の1リットル当たり約100ミリリットルのTBSで細胞を洗浄し、再懸濁させる。
20分間2、880倍の重力で再び遠心分離機を、細胞ペレットを採取する。また、様々な時点で小さな1ミリリットルの細胞ペレットの収穫を収集し、異なる洗剤および/または添加物の存在下で攪拌して摂氏4度で2時間可溶化します。235,000倍の重力で、摂氏4度で10分間超遠心分離することにより、これらの小さな全細胞可溶化サンプルを明確にします。
次に、SECクロマトグラフィーカラムで30マイクロリットルのサンプルとして実行し、発現に最適な時間と最適な可溶化条件を決定します。採取した細胞の1リットル当たり100ミリリットルのバッファーでペレットを解凍します。細胞が解凍されたら、ピペットまたは攪拌して溶液が均質であることを確認します。
細胞を攪拌バーでかき混ぜながら2時間氷に浸したビーカーに摂氏4度で可溶化させます。次に、重力235,000倍、摂氏4度で1時間超遠心分離して細胞デブリを取り除きます。HPLCによるSCCカラム上に30マイクロリットルの上清サンプルを実行し、タンパク質量を確認し、GFBシグナル出力により標的タンパク質を可視化します。
可溶化したタンパク質を含むコバルト親和性樹脂結合上清を重力カラムに塗布し、流量を収集する。SCCカラムでフロースルーの30マイクロリットルサンプルを実行し、タンパク質が樹脂に結合しているかどうかを確認します。その後、10カラムのバッファーで樹脂を洗浄する。
SCCカラムで洗浄の30マイクロリットルサンプルを実行し、タンパク質の損失を確認します。緩衝液を用いて、樹脂結合ヒトTRPC3を溶出する。SSCカラムで1~100個希釈した溶出液の90マイクロリットルサンプルを実行して、タンパク質が溶出していることを確認し、標的タンパク質サイズに対応する位置にGFPシグナルの存在を確認します。
1〜20モル比でトロンビンを追加し、溶出したサンプルにEDTAの10ミリモルを追加します。摂氏4度で3時間インキュベートします。この後、溶出剤を15ミリリットルの遠心フィルターチューブに移します。
チューブを2、800倍の重力、摂氏4度で5分刻みで回転させ、溶出液を500マイクロリットル以下に濃縮します。スピン間のタンパク質溶液を上下にピペットしてタンパク質を再中断し、濃縮を防ぎます。バッファー内の SSC 列に集中をロードします。
高速タンパク質液体クロマトグラフィーを実行し、300マイクロリットルの分画を収集します。次に、UV吸光度信号で視覚化されたTRPC3四トラマーを含むピーク画分を組み合わせます。そして、ミリリットル当たり少なくとも5ミリグラムの最終濃度に再び濃縮する。
ヒトTRPC3は、0.01~20マイクロモルの臨界ミセル濃度を有する様々な洗浄剤で全細胞可溶化し、バッファを含むDDM/CHSで実行した。DDM/CHSはヒトTRPC3の溶解度が最も高いが、ピーク位置が大きすぎて四量体ヒトTRPC3に見えない。細胞全体を可溶化した後、細胞溶解デブリを取り除き、可溶化したタンパク質をSSCカラムにロードし、DDM/CHS洗剤含有緩衝液中のHPLC上で実行し、TRPM4コントロールに対して異なる条件下でヒトTRPC3の絶対溶解度とピーク量を比較する。
異なる洗剤の可溶化TRPC3サンプルはすべて、ヒトTRPC3の四量体形態が正のヒト制御TRPM4よりも分子量が小さいため、11.9ミリリットル前後のピーク位置を示しています。DDM/CHSとデジトニンを含む2つの異なる可溶化および実行中のバッファがテストされます。ジクトンニンを含むバッファーで実行されるタンパク質は、陽性対照に対して妥当な位置で最高のピークを生み出す。
細胞の25ミリリットルを使用して小規模な精製はいくつかの広いピークを示すが、タンパク質は陰性染色による2D分類における単一の四量体ヒトTRPC3チャネルの特徴を示す。添加剤は、ヒトTRPC3の生理学的特徴に基づいてスクリーニングされる。EDTAは、無傷の四量体ピーク位置におけるヒトTRPC3の安定化に顕著な影響を示し、クライオEM顕微鏡写真における粒子数を有意に増加させ、バックグラウンドのノイズを減少させた。
最終結果の品質は、HPLCのFSCCプロファイルのトラブルシューティングに適しています。そして、すべての精製ステップを迅速に完了する上で、理想的には1日で。構造決定、抗体生成、および機能性の研究など、結合アッセイまたは電気生理学は、この手順の後に行うことができる。
この技術は、他のイオンチャネルおよびタンパク質ファミリーを研究し、構造決定を超えた用途に精製タンパク質を生成するために、また、適応され、可能です。層流フードで作業したり、防護服を着用したり、廃棄物を適切に処分するなど、細胞培養バイオハザードを管理するための適切な予防措置を講じる必要があります。
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概要
このプロトコルは、凍結電子顕微鏡法を用いてイオンチャネル構造を決定するための技術を説明し、哺乳類細胞における遺伝子の発現効率に焦点を当てています。タンパク質の抽出、精製、品質チェックの方法や、サンプルグリッドの準備、データ収集が含まれています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 構造生物学
- 生物物理学
背景
- イオンチャネルは様々な細胞機能に不可欠です。
- TRPC3はイオンチャネルファミリーの中で十分に研究されていないメンバーです。
- 凍結電子顕微鏡法は構造決定に強力なツールです。
- 膜タンパク質を研究するには効率的なタンパク質発現システムが不可欠です。
研究の目的
- ヒトのTRPC3の構造を解明すること。
- タンパク質発現と精製の高効率な方法を開発すること。
- タンパク質生化学および生物物理学の研究を促進すること。
使用された方法
- 哺乳類細胞における遺伝子発現のためのバキュロウイルスシステムの使用。
- タンパク質抽出および精製技術。
- 凍結電子顕微鏡法のためのサンプルグリッドの準備。
- 構造解析のためのデータ収集と処理。
主要な結果
- TRPC3タンパク質の発現と精製に成功。
- 凍結電子顕微鏡法のための高品質のサンプルが準備されました。
- TRPC3イオンチャネルに関する構造的洞察が得られました。
- このプロトコルの様々な膜タンパク質に対する効率性が実証されました。
結論
- このプロトコルはイオンチャネルの研究に信頼性の高い方法を提供します。
- TRPC3および類似タンパク質の理解を深めます。
- 膜タンパク質の構造的および機能的研究への応用が可能です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Determining the structure of ion channels like TRPC3 enables mechanistic de-risking of therapeutic targets in cardiovascular, neurodegenerative, and neurologic diseases. This protocol provides a scalable expression and purification system for mammalian membrane proteins, supporting target validation and lead identification efforts. By facilitating high-resolution structural insights, it improves predictive confidence in early discovery decisions for ion channel modulators.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of TRPC3 gating mechanisms and functional target validation in disease-relevant systems.
- Operational Value: Provides purified protein for biochemical and biophysical assays to support hypothesis testing.
- Predictive Value: Structural data informs rational design of modulators and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Purified TRPC3 supports development of binding assays and functional readouts for compound screening.
- Operational Value: Standardized purification yields homogeneous protein suitable for assay reproducibility and scalability.
- Platform Utility: The baculovirus-HEK293 system can be adapted to other ion channels, enabling reusable infrastructure for membrane protein studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Structural insights link TRPC3 biology to disease phenotypes in cardiovascular and neurologic disorders.
- Operational Value: Purified protein enables preclinical validation of target engagement and mechanism of action.
- Risk Mitigation: Early structural data supports go/no-go decisions by clarifying target druggability and safety risks.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical profiling, particularly for ion channel-focused programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via structural and functional analysis of TRPC3.
- Screening: Purified protein enables assay development for high-throughput or secondary screening of ion channel modulators.
- Analytics: Cryo-EM and purification outputs provide quantitative structural and biophysical measurements for lead optimization.
- Translational Research: Structural data connects target biology to disease mechanisms, supporting biomarker alignment and preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: The expression and purification platform is adaptable across ion channel families, reducing redundant development efforts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High-resolution structure enables mechanistic understanding of TRPC3 function and modulation.
- Operational Value: Scalable expression and purification ensure reproducibility and material supply for downstream studies.
- Strategic Value: Informs early go/no-go decisions by reducing biological risk in ion channel target programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of TRPC3 and related ion channel targets in discovery portfolios.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mammalian cell culture, baculovirus systems, and membrane protein biochemistry.
- Dependent on access to ultracentrifugation, affinity chromatography, HPLC, and cryo-EM instrumentation.
- Needs standardization across teams for detergent selection, solubilization conditions, and purification timing.
- Must account for protein stability challenges in different lipid environments and additive screening (e.g., EDTA).
- Practical limitations include time-sensitive purification steps and the need for rapid processing to maintain sample integrity.
