Name: 式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 27 s
Description: 学ぶ低温電子顕微鏡による構造決定のための人間TRPC3イオンチャネルの精製法。バキュロウイルス系を用いた哺乳類細胞での高効率タンパク質発現と精製技術を解説し、膜タンパク質研究への応用を示す。

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低温電子顕微鏡による蛋白質の構造決定はしない蛋白質の構造決定を大きく短縮新しいカメラやアルゴリズムの開発のおかげで、過去数年間で構造生物学の分野に革命をもたらしました容易に、特に膜タンパク質結晶化します。すべての低温電子顕微鏡技術の最近の進歩にもかかわらず、高画質頻繁化を容易にするために十分な質と量で浄化された蛋白質の準備の時間がかかり、高コスト、かつ挑戦的なままです。プロトコルを上で説明するよう迅速かつコスト効果の高い高品質の生産を許可することでこのプロセスの効率を改善する急速に表現する能力、複数の遺伝子をさまざまな精製条件の下で構築画面Cryoem 研究の使用のための浄化された蛋白質。
ここで説明したメソッドによって直接よりも少ないコストで哺乳類の膜タンパク質の大量を浄化するための方法を提供しますより迅速により固定して transfected セル行の生成、多くの手順がある、それぞれの最適化する必要がするには高品質の蛋白質収量を提供します。内で生産し、hTRPC3 を浄化するために使用する生化学的手法、重要なステップとチェックポイントの数があります。最初の重要なチェックポイント...

カルシウムは、ホルモン分子合成1,2,3伝達物質の放出、転写制御カスケードのシグナリングを含むほとんどの携帯電話のプロセスに関与しています。細胞内の自由なカルシウムの恒常性の維持は健康と細胞の機能に不可欠です。ストア作動性カルシウム エントリ (SOCE) カルシウムの枯渇に格納する小胞体 (ER) トリガー イオン チャンネルの開口部を容易にする膜のプロセスは、細胞内のカルシウムの恒常性の主要なメカニズムの 1 つ、さらに4,5,6のシグナル伝達に使用できます、小胞体カルシウムの補充。TRP スーパーファミリーに属するカルシウム透過チャネルである、潜在的な一過性受容体チャンネル (TRPCs) は、SOCE7,8,9の主要な参加者として識別されています。
TRPC 家族の 7 人のメンバーの間で TRPC3、TRPC6、および TRPC7 ホモログ サブグループを形成し、脂質二次メッセンジャー ジアシルグリセ ロール (DAG) シグナル伝達脂質の分解物によって活性化することで一意ホスファチジルイノシトール 4, 5-二リン酸 (PIP2)10,11。TRPC3 は、平滑筋と神経伝達と神経新生12,13に影響を与えるカルシウム シグナル伝達に重要な役割を果たしている脳の大脳と小脳の地域に強く表されます。TRPC3 の機能不全は、中枢神経系疾患、心血管疾患、卵巣腺癌14,,1516など特定の癌にリンクされています。したがって、TRPC3 は、これらの疾患の治療のための医薬品のターゲットとしての約束を保持しています。TRPC3 作用する特化した医薬品の開発は、脂質結合サイト17,18を含むその分子活性メカニズムの理解の欠如によって制限されており。我々 はこれらのメカニズムの19に重要な洞察を提供する人間 TRPC3 チャネル (hTRPC3) と閉じた状態その 2 つの脂質結合部位の最初の原子分解能の構造を報告しています。
高解像度での膜タンパク質の構造決定の重要な要因は、高品質の蛋白質を得ることです。高品質の蛋白質を得るに必要な発現と精製条件の対応するスクリーニングは、時間がかかり、高価な努力をすることができます。ここで表現と hTRPC3 は、私たちの最初のスクリーニングで不完全の浄化のための最適の条件を識別する方法を詳しく説明するプロトコルを提案する.トラブルシューティングおよび電顕 (Cryoem) 私たちの低温電子の固体基盤を築くタンパク質の動作を最適化する方法でいくつかの重要なポイントを紹介します。生成するベクトル (pEG) Gouaux と同僚が開発したスクリーニング アッセイおよび哺乳類細胞20でバキュロ ウイルスの効率的な生成のために最適化されている変更された baculoviral を使用します。この表現方法は哺乳類の細胞膜のタンパク質の発現を迅速かつコスト効果の高い適切です。ベクトルの使用この蛍光検出のサイズ排除クロマトグラフィー ベースと (FSEC) 法21の細胞診を組み合わせています。このメソッドは、興味の構造を融合した緑色蛍光タンパク質 (GFP) タグを使用して、小さな、細胞可溶化されたサンプルのターゲット蛋白質の可視化を向上させます。これは異なる洗剤や添加物、thermostabilizing の突然変異で、タンパク質の安定性のスクリーニングにより、小規模なトランスフェクション細胞の数が少ないを使用できます。このように、条件の多くを急速に大規模な蛋白質の浄化に移動する前に検査します。次の式、スクリーニング、および浄化を取得し、タンパク質のde novoの構造決定を生成する低温電子顕微鏡から画像を処理するためのプロトコルを提案する.ここで説明したアプローチ、TRP チャネル受容体および他の膜タンパク質の構造研究のための汎化可能なプロトコルとなることと考えています。

<table><tbody><tr><td>pEG BacMam ベクター (pFastBacI)</td><td>addgene</td><td>31488</td><td></td></tr><tr><td>DH10&alpha; 細胞</td><td>Life Technologies</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C. 培地</td><td>Corning</td><td>46003CR</td><td>DH10&alpha の形質転換用; Bacmid</td></tr><tr><td>Bacmam 培養プレート</td>用細胞 <td>Teknova</td><td>L5919</td><td>形質転換 DH10&α; 細胞</td></tr><tr><td>インキュベーションシェーカー細菌細胞用</td><td>Infors HT</td><td>Multitron standard</td><td></td></tr> 昆虫<tr><td>細胞用インキュベーションオービタルシェーカー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>SHKE8000</td><td></td></tr><tr><td>リーチイン CO2 哺乳類細胞用インキュベーター</td><td>サーモフィッシャー</td><td>3951</td><td></td></tr><tr><td>卓上オービタルシェーカー</td><td>サーモフィッシャー</td><td>SHKE416HP</td><td>哺乳類細胞</td></tr><tr><td>用リーチインCO2インキュベーターに使用インキュベーター</td><td>VWR</td><td>1535</td><td>バクテリアプレート用</td></tr><tr><td>QIAprep スピン ミニプレップキット</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>プラスミド抽出および精製用</td></tr><tr><td>フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール</td><td>DNA抽出用</td><td>Invitrogen</td><td>15593031</td></tr><tr><td>Sf9細胞</td><td>Life</td><td>12659017</td> Technologies ウイルス<td>産生昆虫細胞</td></tr><tr><td>Sf-900培地</td><td>Gibco</td><td>12658-027</td>昆虫<td>細胞培</td></tr>地<tr><td>FBS</td><td>アトランタバイオロジカルズ</td><td>S11550</td><td></td></tr>昆虫<tr><td>細胞トランスフェ</td><td>クション用Cellfectin II</td><td>Gibco</td><td>10362100</td>昆虫細胞</tr>リ<tr><td>ポフェクタミン2000</td><td>哺乳類細胞トランスフェクション用</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td></tr><tr><td></td> P1ウイルスろ過用<td>VWR</td><td>28145-501</td><td>P1ウイルスろ過用</td></tr><tr><td>0.2mmフィルターフラスコ500ml</td><td></td><td>P2ウイルス</td>三<td></td></tr><tr><td>角マイヤー培養フラスコ(平底2L)をろ過するためのコーニング430758(平底2L)</td><td>昆虫細胞培養用</td><td>遺伝子メイト</td><td>F-5909-2000</td></tr><tr><td>三角培養フラスコ(バッフル2L)</td><td>哺乳類細胞培養用</td><td>遺伝子メイト</td><td>F-5909-2000B</td></tr><tr>DNAおよびタンパク質濃度を測定するための<td>ナノドロップ2000分光光度計</td> サー<td>モフィッシャーND-2000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-3022</td><td>タンパク質産生用哺乳動物細胞</td></tr><tr><td>フリースタイル 293 発現 培地</td><td>Gibco</td><td>1238-018</td><td>タンパク質発現用哺乳動物細胞培地</td></tr><tr><td>酪酸ナトリウム塩</td><td>アクロス</td><td>タンパク質発現を増幅するための</td>アクロス<td>263195000</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>アクロス</td><td>215740500</td><td>プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>ウシ肺由来</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1153-100MG</td><td>プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>ロイペプチン塩酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24125-16-4</td><td>プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>ペプスタチンA</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2671-250</td><td>プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>ジギトニン</td><td>EMD ミリポア</td><td>300410</td><td>界面活性剤 - 膜イミダゾールからタンパク質を可溶化する</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>792527</td><td>レジンカラムからタンパク質を溶出させる</td></tr>Hisタグスーパーオースによる<tr><td>アフィニティー精製</td>用<td>TALON樹脂</td><td>Clonetech</td><td>製635504 6</td></tr><tr><td>列</td><td>GE</td><td>29091596;</td><td>29091597 HPLCおよびFPLC用</td></tr><tr><td>プロミネンスモジュラーHPLCシステム</td><td>島津</td>製作所 <td>下記</td><td></td>参照</tr><tr><td>コントローラモジュール</td><td>「</td><td>CBM20A</td><td></td></tr><tr><td>ソルベントデリバリーシステム</td><td>」</td><td>LC30AD</td><td></td></tr><tr><td>蛍光検出器</td><td>「</td><td>冷却</td>付きRF20AXS<td></td></tr><tr><td>オートサンプラー</td><td>」</td><td>SIL20ACHT</td><td></td></tr> Akta<tr><td></td><td></td><td></td>トロンビン(アルファ)分<td>画器付きピュアFPLCシステム</td></tr> <tr><td></td><td>Haematologic Technologies Incorporated</td><td>HCT-0020 GFP</td><td>タグ切断用</td>ヒトα</tr><tr><td>アミコンウルトラ 15mL 100K遠心フィルターチューブ</td><td>ミリポア</td><td>UFC910008</td><td>濃縮タンパク質</td></tr><tr><td>EDTA</td>フィ<td>ッシャー</td><td>E478500</td>タンパク質<td>安定化用</td></tr><tr><td>400メッシュカーボンコーティング銅グリッドTed</td><td>Pella Inc.</td><td>01754-F</td><td>ネガステイン用グリッド</td></tr><tr><td>クアンティフォイル 穴あきカーボングリッド (金、1.2/1.3&thinsp;&mu;mサイズ/正孔スペース、300メッシュ)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Q3100AR1.3</td><td>grids for Cryo-EM</td></tr><tr><td>Vitrobot Mark III</td><td>FEI</td><td></td><td>for preparing sample grids by liquid ethane freezezing</td></tr><tr><td>liquid nitrogen</td><td>Dura-Cyl</td><td>UN1977</td><td></td></tr><tr><td>ethane gas</td><td>Airgas</td><td>UN1035</td><td></td></tr><tr><td>Solarus Plasma System</td><td>Gatan</td><td>Model 950</td><td>for cleaning grids before.サンプル凍結</td></tr><tr><td>Tecnai Spirit電子顕微鏡</td><td>FEI</td><td></td><td>ネガティブステインEMイメージング用</td></tr><tr><td>Talos Arctica electron microsocope</td><td>FEI</td><td></td> クライ<td>オ電子顕微鏡グリッドのスクリーニングおよび低分解能イメージング用</td></tr><tr><td>Titan Krios 電子顕微鏡</td><td>FEI</td><td></td><td>高解像度クライオ電子顕微鏡</td></tr>イメージング<tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gautomatchソフトウェア</td><td>http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch/</td><td></td> <td>顕微鏡写真から粒子を拾い上げる</td></tr><tr><td>Relion 2.1ソフトウェア</td><td>https://github.com/3dem/relion</td><td></td><td>2Dおよび3D分類を構築する</td></tr><tr><td>CryoSPARCソフトウェア</td><td>https://cryosparc.com/</td><td></td> <td>初期構造モデルを生成する</td></tr><tr><td>Frealignソフトウェア</td><td>http://grigoriefflab.janelia.org/frealign</td><td></td><td>を改良するparticles</td></tr><tr><td>Cootソフトウェア</td><td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/</td><td></td> <td>モデルの構築</td></tr><tr><td>MolProbityソフトウェア</td><td>http://molprobity.biochem.duke.edu/</td><td></td> <td>原子モデルの形状を評価する</td></tr><tr><td>SerialEMソフトウェア</td><td>http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/</td><td></td> <td>自動シリアルイメージスタック取得用</td></tr><tr><td>MortionCor2ソフトウェア</td><td></td><td></td><td>合計されたムービースタックのモーション補正のための http://msg.ucsf.edu/em/software/motioncor2.html</td></tr><tr><td>GCTFソフトウェア</td><td>https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td> <td>ムービースタックの焦点ぼけ値を測定するための</td>https://www.phenix-online.org/documentation/reference/real_space_refine.html ソフトウェアPhenix.real_space_refine<td></td></tr><tr><td>初期3Dモデルの実空間の微調整のための</td><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル trpc3 の精製

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

正規の TRP 亜科の一過性受容体電位チャンネル (TRPCs) が重要な役割を果たすカルシウム恒常性、特にストア作動性カルシウム エントリの適切な機能を維持するために不可欠な非選択的陽イオン チャネルシナプス小胞の放出と細胞内シグナリング。したがって、TRPC チャネルは、さまざまな心臓肥大などの心臓血管疾患、パーキンソン病などの神経変性疾患、脊髄小脳変性症などの神経系の疾患を含む人間の病気に関与しています。したがって、TRPC チャネルは、人間の病気の潜在的な薬理学的ターゲットを表します。ただし、これらのチャネルのゲーティングの分子メカニズムはまだ明らかではありません。安定性、均一な精製されたタンパク質の大量の取得の難しさ構造決定研究、特に TRPC イオン チャネルなどの哺乳類の膜タンパク質の制限要因となっています。ここでは、親和性とサイズ排除クロマトグラフィーによって変更されたバキュロ ウイルス遺伝子の転送システムとこれらの蛋白質の精製を用いた哺乳類のイオン チャンネル膜タンパク質の大量発現のためのプロトコルを提案する.さらに浄化された蛋白質から単一粒子の低温電子顕微鏡画像を収集するために、これらの画像を使用して蛋白質の構造を確認するプロトコルを提案します。構造決定は、ゲートとイオン チャネル機能のメカニズムを理解するための強力な方法です。

表現のプロトコルの概要と hTRPC3 の精製は、図 1 aに表示されます。理想的な白人植民地、バクミド DNA 精製のために選択のような hTRPC3 バクミド板のイメージは図 1 bに表示されます。わかったその 48 h は明確な黄色 gal は、隔離されたコロニーの存在を維持しながらの染色に最適です。P2 hTRPC3 GFP 蛍光で可視化としてのウイルスの生産ピークは感染 Sf9 昆虫細胞 (図 1) の 4 d の後見られました。
P2 baulovirus 1% を添加したメディアから収穫された FBS、HEK293 細胞の懸濁液に感染するために使用します。酪酸ナトリウムが追加されたタンパク質式20を後押しするウイル...

このプロトコルは、バキュロ ウイルス システムを効率的に最小限の労力と毒性、蛋白質の抽出、精製、哺乳類細胞の遺伝子を表現するために使用を含むクライオ電子顕微鏡によるイオン チャネルの構造を決定するために使用方法をについて説明します品質チェック、サンプル グリッドとスクリーニングと同様、データ収集と処理。

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

このプロトコルは、重要な、しかし研究されたイオンチャネルの家族のメンバーであるヒトTRPC3の構造を解決することを可能にしました。この技術の主な利点は、構造と機能の両方の研究のために、様々なタンパク質を発現し、精製するために適用することができる高効率です。この方法は、タンパク質の生化学や生物理学の研究に使用するための効率的なタンパク質発現および精製システムを提供し、多種多様なイオンチャネルおよび他の膜タンパク質に適用することができる。まず、ウイルス産生培養物のサンプル中のウイルスのGFP蛍光を見て、相対的なウイルス発現を確認する。十分なサイズのバッフル底アーレンマイヤー培養フラスコでは、HEK293哺乳動物細胞懸濁液培養液の望ましい体積を調製し、1ミリリットル当たり35〜380万個の細胞を発現培地中で、1%無菌FBSを添加する。調製されたP2ウイルスストック溶液の体積%を加え、摂氏37度と135 RPMでオービタルシェーカーにインキュベートします。感染後12〜18時間で10ミリモルのナトリウムブタイレートを加えて、最適なタンパク質発現に必要な時間を摂氏30度でインキュベートする。この後、細胞を収穫するために2、880倍の重力で遠心分離を行った。収穫した細胞の1リットル当たり約100ミリリットルのTBSで細胞を洗浄し、再懸濁させる。20分間2、880倍の重力で再び遠心分離機を、細胞ペレットを採取する。また、様々な時点で小さな1ミリリットルの細胞ペレットの収穫を収集し、異なる洗剤および/または添加物の存在下で攪拌して摂氏4度で2時間可溶化します。235,000倍の重力で、摂氏4度で10分間超遠心分離することにより、これらの小さな全細胞可溶化サンプルを明確にします。次に、SECクロマトグラフィーカラムで30マイクロリットルのサンプルとして実行し、発現に最適な時間と最適な可溶化条件を決定します。採取した細胞の1リットル当たり100ミリリットルのバッファーでペレットを解凍します。細胞が解凍されたら、ピペットまたは攪拌して溶液が均質であることを確認します。細胞を攪拌バーでかき混ぜながら2時間氷に浸したビーカーに摂氏4度で可溶化させます。次に、重力235,000倍、摂氏4度で1時間超遠心分離して細胞デブリを取り除きます。HPLCによるSCCカラム上に30マイクロリットルの上清サンプルを実行し、タンパク質量を確認し、GFBシグナル出力により標的タンパク質を可視化します。可溶化したタンパク質を含むコバルト親和性樹脂結合上清を重力カラムに塗布し、流量を収集する。SCCカラムでフロースルーの30マイクロリットルサンプルを実行し、タンパク質が樹脂に結合しているかどうかを確認します。その後、10カラムのバッファーで樹脂を洗浄する。SCCカラムで洗浄の30マイクロリットルサンプルを実行し、タンパク質の損失を確認します。緩衝液を用いて、樹脂結合ヒトTRPC3を溶出する。SSCカラムで1~100個希釈した溶出液の90マイクロリットルサンプルを実行して、タンパク質が溶出していることを確認し、標的タンパク質サイズに対応する位置にGFPシグナルの存在を確認します。1〜20モル比でトロンビンを追加し、溶出したサンプルにEDTAの10ミリモルを追加します。摂氏4度で3時間インキュベートします。この後、溶出剤を15ミリリットルの遠心フィルターチューブに移します。チューブを2、800倍の重力、摂氏4度で5分刻みで回転させ、溶出液を500マイクロリットル以下に濃縮します。スピン間のタンパク質溶液を上下にピペットしてタンパク質を再中断し、濃縮を防ぎます。バッファー内の SSC 列に集中をロードします。高速タンパク質液体クロマトグラフィーを実行し、300マイクロリットルの分画を収集します。次に、UV吸光度信号で視覚化されたTRPC3四トラマーを含むピーク画分を組み合わせます。そして、ミリリットル当たり少なくとも5ミリグラムの最終濃度に再び濃縮する。ヒトTRPC3は、0.01~20マイクロモルの臨界ミセル濃度を有する様々な洗浄剤で全細胞可溶化し、バッファを含むDDM/CHSで実行した。DDM/CHSはヒトTRPC3の溶解度が最も高いが、ピーク位置が大きすぎて四量体ヒトTRPC3に見えない。細胞全体を可溶化した後、細胞溶解デブリを取り除き、可溶化したタンパク質をSSCカラムにロードし、DDM/CHS洗剤含有緩衝液中のHPLC上で実行し、TRPM4コントロールに対して異なる条件下でヒトTRPC3の絶対溶解度とピーク量を比較する。異なる洗剤の可溶化TRPC3サンプルはすべて、ヒトTRPC3の四量体形態が正のヒト制御TRPM4よりも分子量が小さいため、11.9ミリリットル前後のピーク位置を示しています。DDM/CHSとデジトニンを含む2つの異なる可溶化および実行中のバッファがテストされます。ジクトンニンを含むバッファーで実行されるタンパク質は、陽性対照に対して妥当な位置で最高のピークを生み出す。細胞の25ミリリットルを使用して小規模な精製はいくつかの広いピークを示すが、タンパク質は陰性染色による2D分類における単一の四量体ヒトTRPC3チャネルの特徴を示す。添加剤は、ヒトTRPC3の生理学的特徴に基づいてスクリーニングされる。EDTAは、無傷の四量体ピーク位置におけるヒトTRPC3の安定化に顕著な影響を示し、クライオEM顕微鏡写真における粒子数を有意に増加させ、バックグラウンドのノイズを減少させた。最終結果の品質は、HPLCのFSCCプロファイルのトラブルシューティングに適しています。そして、すべての精製ステップを迅速に完了する上で、理想的には1日で。構造決定、抗体生成、および機能性の研究など、結合アッセイまたは電気生理学は、この手順の後に行うことができる。この技術は、他のイオンチャネルおよびタンパク質ファミリーを研究し、構造決定を超えた用途に精製タンパク質を生成するために、また、適応され、可能です。層流フードで作業したり、防護服を着用したり、廃棄物を適切に処分するなど、細胞培養バイオハザードを管理するための適切な予防措置を講じる必要があります。

expression-purification-human-lipid-sensitive-cation-channel-trpc3

Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

脂質膜にプロトタイプ電位依存性カリウムチャネルの完全な再構成のための手順が説明されています。再構成されたチャネルは、生化学的アッセイ、電気録音、リガンドのスクリーニングおよび電子結晶学的研究に適している。これらの方法は、他の膜タンパク質の構造的および機能的研究の一般的なアプリケーションを有することができる。...

構造と機能研究のための脂質膜へのKvチャネルの再構築

異種発現および嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（CFTR）の精製は、重大な課題および嚢胞性線維症のための薬物療法の開発における制限因子である。このプロトコルは、機能的および構造的研究に適しCFTRのミリグラム量の単離のための2つの方法について説明します。...

で表現する嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子タンパク質の精製<em&gt;サッカロマイセス·セレビシエ</em

この論文は、高分子のほぼネイティブな状態の高品質な顕微鏡画像を取得するために使用されるクライオ電子顕微鏡法について説明しています。この方法は、高分子の3D再構成を生成するために考案された単一粒子アプローチを使用したさらなるコンピュータ化された処理に適した画像を生成します。...

高分子の3次元再構成のための試料調製のプライマーおよび高品質データ収集：クライオ電子顕微鏡ののいいことといけないことをやる

本稿では、ソフトウェアスイートSPHIREを使用して低温EM画像を処理するためのプロトコルを紹介します。現在のプロトコルは、ほぼ原子分解能を目標とするほぼすべての単一粒子EMプロジェクトに適用することができます。...

SPHIREを用いた電子冷凍顕微鏡画像からの高分解能単一粒子解析

この記事では、分光分析用洗剤可溶化 TRPV1 の生化学的な量を取得する具体的な方法について説明します。結合されたプロトコルは、膜制御環境で哺乳類のイオン...

精製と TRPV1 の分光学的解析のための再構成

イオン チャネルの浄化はしばしば困難、しかし、一度は、それが悪意のチャネルの構造と機能の生体外で調査。ここでは、式と哺乳類 bestrophin 蛋白質、Ca2...

哺乳類 Bestrophin イオン チャネルの発現と精製

cryoEMを用いた高分子複合体の構造決定は、ある種のタンパク質や複合体に対して日常的なものとなっている。ここでは、このパイプラインが要約され(サンプルの準備、スクリーニング、データの取得と処理)、読者は、より困難な標本の場合に変更される可能性があり、さらに詳細なリソースと変数に向けられています。...

単粒子クライオ電子顕微鏡:試料から構造まで

INADタンパク質複合体の組み立て機構に基づいて、このプロトコールでは、内因性 ショウジョウバエ...

内因性 ショウジョウバエ 一過性受容器電位チャネルの精製

このプロトコルでは、TIRF顕微鏡を使用して個々のイオンチャネルを追跡し、支持された脂質膜におけるそれらの活性を決定し、それによって側方膜の動きとチャネル機能の間の相互作用を定義する方法について説明します。メンブレンの準備、データの記録、および結果の分析方法について説明します。...

全反射蛍光(TIRF)顕微鏡を用いた脂質二重膜の横方向移動度とイオンチャネル活性の1分子イメージング(英語)

本稿では、変異を熱安定をスクリーニングヒトセロトニントランスポーターの精製、高親和性抗体を生成し、抗うつ薬のSの -シタロプラムにバインドされたセロトニントランスポーター-抗体複合体を結晶化する方法について説明します。このプロトコルは、他の挑戦的な膜輸送体、受容体、およびチャネルの研究に適合させることができます。...

にバインドされた熱安定、発現、精製、およびヒトセロトニントランスポーターの結晶化<em&gt; S</em&gt; - シタロプラム

学ぶ低温電子顕微鏡による構造決定のための人間TRPC3イオンチャネルの精製法。バキュロウイルス系を用いた哺乳類細胞での高効率タンパク質発現と精製技術を解説し、膜タンパク質研究への応用を示す。

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