Name: 高分子ナノ粒子の疎水性および親水性化合物のカプセル化のため NanoPrecipitation をフラッシュします。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 学ぶFlash NanoPrecipitation法による高分子ナノ粒子の調製技術。疎水性・親水性化合物のカプセル化と動的光散乱による粒径解析を含む詳細なプロトコルで、スケーラブルなナノ粒子合成を実現します。

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この作品は、Optimeos ライフ サイエンス、国立科学財団 (あわせて 1605816)、法案とメリンダ ・ ゲイツ財団 (BMGF, OPP1150755) と、国立科学財団大学院研究奨学金 (DGE-1656466) に与えられるからの資金によって支えられました。K.D.R.

著者が明らかに何もありません。

プロトコルのステップ 1 のように、ビタミン E などの疎水性化合物のカプセル化は、広範囲にわたって説明9,14,28をされています。比較的単分散粒子は、混合の時間スケールは集計と粒子の成長のための時間スケールよりも短いので作り出されます。具体的には、混合溶剤/antisolvent 液急速になる同質、核が一様に発生することができます。その後、粒子表面にブロック共重合体のアセンブリは、粒子成長5を停止立体安定化を提供します。商工会議所 (乱流) における均一混合時間は CIJ または、MIVM 入口流量の関数で、本質的に定数13の粒子サイズが乱流混合への移行後に発生する吸気率があります。これは、いくつかのバッチにバッチ プロセスに追加の堅牢性を提供します (すなわち、注射器抑速) 入口流量の変動は図 3から見られるように最終的な NP サイズに大きな影響を与えず許容できます。低速または不均一な入口速度は、失火の例に見られるように、大きな粒子またはより多くの多分布で起因できます。FNP は、逆 NanoPrecipitation のフラッシュによって、親水性化合物ナノ粒子をカプセル化するため拡張されています。これらのナノ粒子が反転し、微粒子を作成または水分散性ナノ粒子25を作成するペグで被覆するために使用します。粒子コア架橋の複雑さがあるが、基になるアセンブリの原則は同じまま。これは、水溶液環境下における粒子の安定化のため必要です。一般的に、イオン間相互作用は基本19の添加による pH 調整によって昇格できますが polyacid ブロックと比較して 1:1 の電荷比で十分です。このプロトコルでは反転フォーム NPs に最初の工程だけが記載されています。
高速混合に加えて FNP または iFNP によって成功した定式化はいくつかの条件が満たされて9,14をすることができますのインスタンスに制限されます。最初に、すべての入力ストリーム混和する必要があります。エマルジョンは、NPs を生成する使用されている、FNP ミキサーで均一ソリューション フェーズが必要です。第二に、コア コンポーネントがあります (CIJ、ボリュームで 50/50 の混合物) のミキサーで溶媒条件でほぼ不溶解性急速な核生成を駆動します。そうでなければ、重要な部分はカプセル化されていないままになります。 または antisolvent で希釈してさらに沈殿させます。MIVM は、アドレス コア材料の溶解度限界に混合室で高い antisolvent コンテンツを有効にできます。プロセス デザイン9をガイドする溶媒組成の関数としての溶解度データから過飽和曲線を生成すると便利は多くの場合。図 6は、2 つの化合物の代表的な曲線を示しています。通常、MIVM を使用して、異なる組成で混合チャンバー条件メリットで低過飽和の状態。高過飽和優先コア コンポーネントの核粒子成長が芯材の組立時間の不一致、スタビライザーが治療上の大きな凝集体起因できます。D'Addio と Prud'homme は、詳細9でこのような過飽和状態曲線の応用を検討しました。最後に、BCP は分子溶媒のストリームで溶解しなければならない、antisolvent ストリームを 1 つのブロックを選択する必要があります。BCP は、十分に駆動力安定剤粒子表面と粒子に立体安定性を付与する溶媒和ブロックのアンカーに折りたたまれたブロックから両方型を提供する両親媒性である必要があります。彼らはこれらの制約を満たしている限り、プロトコルに記載されている以外の溶媒を使用する可能性があります。
手動の注射器操作との練習は、スクリーニングの間に成功率を向上できます。前述のように、均質な乱流の混合条件への移行操作はプロセス28小さい流量の変化が許容されることを意味します。カラムのスケール アップ ポンプ駆動、コンピューター制御のフローにより、さらに大きなメリットを再現可能な入口流量のための一貫性。粒子の後処理中の任意の時点で検査または DLS の分析は付随のほこりや粒子の不安定性に起因することができます大きな凝集体の存在を示します。必要がある場合は、適切なフィルターのポアサイズとストリームをフィルターできます。集計がない場合は、ことがわかった以下 5% 質量が通常失われる公称径が粒子径分布より大きい場合、PEG 被覆ナノ粒子をフィルター処理する場合よりも。集計をフィルターしている場合は、プロセス中に失われた質量の測定が必要です。質量損失の定量化は、2 つの方法のいずれかで実施することができます。特定のボリュームの全固形物質量決定できます熱重量分析によるろ過前後変更の範囲を識別するために (補足情報セクション 2 を参照してください)。また、粒子は回復した (例えば、凍結乾燥によって) することができ、良溶媒に溶解しました。芯物質の濃度はは紫外可視吸光光度法やクロマトグラフィーなどの適切な手法で測定直接できます。
FNP、水性分散液から残留 10 vol % 有機溶媒 (例えばTHF) を削除する必要があります。これは蒸発蒸留14,29、透析30、または接線流ろ過31,32によって行うことができます。提供されている引用文献の処理ステップごとに実用的な考慮事項を説明します。透析、典型的な膜、3.5 kDa または 6-8 kDa カットオフが大きいオプションがあります。この分子量カットオフは、ときにいくつかのバスの変更を使用して 24 時間透析で溶剤を除去に十分です。接した流れのろ過の使用は、膜表面濃度分極による誘導を避けるために注意する必要がある、いくつかのプロセスの開発を伴います。我々 は、膜表面における凝集を排除システム依存値、2-10 vol % 通常以下有機溶媒組成を減らすことを発見しました。熱重量分析に処理後、ナノ粒子の濃度を容易に判定 (補足情報セクション 2 を参照してください)。運搬又は粒子を非常に安定した形で保管することが望ましいです。水性分散液は、ドライアイス/アセトン混合物を使用して迅速に、-80 ° C で保存し、単に固定できます。また、乾燥粉末は凍結乾燥33,34によって得ることができるまたはスプレー乾燥24。頻繁に凍結や乾燥中のナノ粒子凝集を抑える、保護剤の検討を追加する必要があります。糖(スクロース、トレハロース等)、poly(ethylene glycol)、またはシクロデキストリンを検査する有効性の濃度の範囲で DLS35,36,37、サイズを監視することによって 38。処理中に一般的な NP 安定性問題頻繁移動が増加、条件の下でより低いエネルギー状態への転位の結果としてコアで溶解または相分離に関連しています。改善安定性14,16,17,39,40、共同コア材料、代替安定剤または変更された外部溶液組成の使用を助けることができます。 41。
前述のように、MIVM 有効高過飽和度を達成する必要がある場合は、混合室に antisolvent 含量にします。それは 2 つ以上のストリームに種の物理的な分離のための反応性や溶解性の制約がそれを要求するときできます。例24抗生物質らいのゼイン タンパク質安定ナノ粒子の形成であります。アセトン ストリームで疎水性らいを導入します。60% エタノール水溶液ストリームでゼインを導入します。カゼイン、ゼイン、どの錯体は、水様バッファー ストリーム持って来、4 ストリーム、アセトン、エタノールへの水の比率を増加する追加のバッファーです。らいとゼインが一般的な溶媒に可溶ではないので、2 つの溶媒のストリームが必要です。このプロセスは 2 つジェット CIJ ミキサーで達成できなかった。このタンパク質安定製剤も FNP、BCP スタビライザーに限定されないことを示します。スタビライザー42なしヤヌス粒子が生成され、口腔のアプリケーション24低コスト安定剤の範囲が示されています。特に、ヒドロキシプロピルメチル セルロースなど共重合体は、ブロック共重合体の24の代わりに使用することができます。芯材は、テクニックの数によってより疎水性可能です。疎水性イオンのペアリングは、中間の溶解度43,44,45を持っている化合物の広い範囲をカプセル化に適用されています。非常に疎水性プロドラッグがされている生成され、46をカプセル化します。核酸は、カチオン性脂質47との錯形成によってカプセル化されました。重要なは、これらの研究は、FNP が粒子の表面化学の範囲を作り出すことができることを示しています。チェーンの端にターゲット ligand の変更されている BCP の一部を含むさらに、混合の安定剤が使用されています。これにより表面に配位子コンテンツを正確に制御、粒子成分が入力ストリーム構成23,48を反映しているので。同様に、染料、無機ナノ粒子3、8を含むだけでなく、複数のコア コンポーネントを組み込むことが可能です。
フラッシュ NanoPrecipitation は、疎水性や親水性のコアで構成される高分子ナノ粒子に拡張性の高いアプローチです。上記に列挙された条件を満たしている場合一般的に以上コア材の 95% はカプセル粒子の質量分率高で。次に示す 3 つの例は、ベンチ スケール、材料および各入口ストリーム約 0.5 mL の数ミリグラムが必要で実施されました。定式化の最適化のパーティクル条件の急速なスクリーニングが可能になります。バッチ サイズを大きくする鉛配合のスケール アップは、容易にシリンジ ポンプや流量コント ローラーを使用して達成することができます長く、プロセスの実行の問題です。対照的に、一括添加 nanoprecipitation のスケール アップ追加の時点で十分な気を維持し、容器の幾何学49の変更の効果のため会計に十分に文書化の課題に直面します。それは FDA の要件50を満たすために一貫した方法で粒子を製造することが重要なので、これは大きな障壁です。マイクロ流体技術はまた制服、再現性の高いナノ粒子を生成が、ミリグラムの範囲での生産を有効にするだけです。たとえば、Karnikらは、薬剤放出を 0.25 mg/分の生産量研究51報告。さらにスケール アップは通常12ドル高の首都で並列化を伴います。FNP、シリンジ ポンプやミキサーの入り江を結ぶいくつかの付属品 600 mg/分でのナノ粒子の 1 グラムを生成するは簡単です。したがって、FNP はアクセス可能な実験室規模のスクリーニング ツールとして NP 並進作業用にスケーラブルなアプローチを表しています。

1990 年代後半以来、ナノ材料1,2を用いた臨床試験数の着実な増加があった。金利上昇は、疎水性薬物のバイオアベイラビリティを改善するために、3体で優先ターゲットを有効にするナノ材料の約束を反映しています。高分子ナノ粒子 (ナノ粒子または呼ば NPs ここ) は、材料2のこのクラスの成長割合を表します。NPs は、彼らはサイズ、組成、表面機能化4など高度の特性を持っているので、関心を集めています。難水溶性薬物の管理に適用する、NPs はよく治療上の疎水性コアにカプセル化されて、親水性ポリマー ブラシ成っているシェル コア-シェル構造を持ちます。この構造を生成する単純な方法を採用、両親媒性ジブロック共重合体 (BCP) 粒子のコアの一部を形成する、分解性疎水性ブロックから成ると親水性 poly(ethylene glycol) (PEG) のブロックは、ポリマー ブラシを形成して立体安定4,5を与えます。
シンプルとはエネルギー集中6だから、Nanoprecipitation は高分子ナノ粒子作製手法が一般的です。最も単純な形式で nanoprecipitation には NP コンポーネント攪拌水の余分なボリュームにアセトンのような有機溶媒中でのピペットで追加が含まれます。溶媒不溶性のコア コンポーネントの沈殿物の希薄水溶液に変更。この成長の粒子表面にスタビライザーを組み立てる折りたたまれた疎水性ブロック7,8,9,10の吸着による監督します。均一な粒子径分布は、溶剤と水が急速に均一溶液を形成する混合時に取得されます。混合、核形成と大規模に部品結果のアセンブリより多くの多粒子の人口よりも遅くなります。簡単なテストのためアクセスしやすく、撹拌したバッチのアプローチ結果のばらつきが大きく、矛盾を混合のために、スケール アップ6,11に従順ではないです。マイクロ流体は連続的に実行することができます NP 生産に別の道として浮上しています。この生産手段は最近鼎らによって検討されています。11.一般的なアプローチは、サブミクロン値に溶剤の長さスケールを減らすに焦点を当てた流を使用しています。小さな流れ寸法が均一な粒子11,12のために重要、拡散することにより、antisolvent の混合が発生します。スケール アップのための複数のマイクロ流体チャンバーの並列化は、大量生産の問題です。
マイクロ流路中の制服 nanoprecipitation を支持する急速混合条件は、限られた、乱流の交互製作可能します。フラッシュ NanoPrecipitation (FNP) では、マイクロ流体と可能なより高い体積流量の下でこれらの条件を達成する特別な混合ジオメトリを採用しています。入口ストリーム拡散11,13の長さスケール上に溶剤/反 solvent ラメラを形成、渦の生成につながる乱流の条件の下で混合チャンバを入力します。したがって、核形成と治療上の成長よりも短い時間スケールでの均一混合が達成されます。ミキサーの限られたジオメトリは、乱流エネルギー散逸が発生する全体のシステムを経験する同じプロセスの歴史13地域のストリームをバイパスするを許可しません。混合室で均一に発生する核形成と粒子成長の表面9,14に BCP のアセンブリによって停止まで進行。安定した粒子を含む混合ストリーム可能性がありますオストワルド成長を抑制するための追加の antisolvent で希釈し、粒子15,16,17の熟成します。
閉じ込められた衝突噴流 (CIJ) ミキサーの FNP の最も簡単なミキサー設計と拡張性と継続的なファッション、図 1A13に示すように 2 つのストリームの混合が可能します。図 1B18に示すように、均一な粒子の形成に必要な迅速なミクロ混合を実現しながら最大 4 つの別のストリーム入力を有効にするマルチ入口渦のミキサー (MIVM) が開発されました。FNP は商業スケールの生産に容易に翻訳できる単純な定式化スクリーニングできます。プロセスの継続的な性質のため、バッチ サイズが大きいは、実行時間ではなく、もはや、同じ機器鉄道キログラム規模生産に有効にする簡単な翻訳、新しい血管を必要はありません。
ペプチドおよびタンパク質 ('生物学的製剤') などの親水性の化合物は、プロセスと呼ばれる逆フラッシュ NanoPrecipitation (iFNP) でもカプセル化できます。テクニックには、両親媒性 1 つのブロックは疎水性、他は polyacid19BCP が必要です。最初の手順では、生物学的を含むジメチル ジメチルスルホキシド (DMSO) ストリームとジクロロ メタンやクロロホルムなどの脂溶性溶剤に対して BCP の急速な混合をします。これは、結果、疎水性ブロック ブラシで安定した粒子の形成。ここでは、このようなアーキテクチャの '逆' NP と呼ぶが。イオンでは、その polyacid を含んでいる多価カチオンを使用して架橋。これは文学19,20,21で報告されている手法によって微粒子や PEG 被覆ナノ粒子の形で水溶液環境に粒子を安定させます。
コア-シェルの疎水性または親水性化合物をカプセル化する高分子ナノ粒子の実験室規模の生産のため、このプロトコルを用いることができます。プロトコルのサブセクションでは、両方のミキサーのクラス - CIJ と、MIVM の使用について説明します。読者は小説コア コンポーネントのプロトコルを適応し、再現性をもってストリーム入力の適切なミキサーを使用して目的のサイズのナノ粒子を生成することができるはず。FNP と iFNP を使用して 3 つの例製剤を以下に示します。2 つは CIJ ミキサーを採用し、MIVM15,22が必要です。最初の定式化は、モデルのカプセル化を示して疎水性FNP で化合物。2 番目の定式化を示します、モデルのカプセル化親水性CIJ ミキサーで iFNP による化合物。最終的な定式化は、iFNP、MIVM を使用して蛋白質のカプセル化の例を示します。この 3 番目の定式化のプロトコルは 'μMIVM' と呼ばれる小規模なハンドヘルドの MIVM の使用を説明します。ミキサーのデザインが簡略化された製剤スクリーニングのための許可する小さいが、スケーリングの動作を十分に理解し、ミキサーは、マイクロ流体デバイス22ではないです。プロトコルの最後のセクションには、スクリーニングで識別される鉛配合のスケール アップでいくつかのノートが含まれています。これらの製剤は、学習プロセスのアクセス ポイントを提供し、非分解性ポリ (スチレン) を使用して、その結果-ポリマーをベースします。代替安定剤は、生体適合性商業オプション利用できる14,23,24の数と、文献に記載されています。

<table><tbody><tr><td>閉じ込められたインピンギングジェットミキサーNA</td><td></td><td>NA</td><td>エンジニアリング図面の補足情報を参照してください。新しいミキサー検証のレビューテキスト</td></tr><tr><td>ルアーフィッティング</td><td>Idex Health &サイエンス</td><td>P-604</td><td>CIJまたはMIVMミキサーインレットに組み立て、対応するスレッドプラグ</td></tr><tr><td>フィッティング</td><td>Idex Health &Science</td><td>P-309</td><td>CIJミキサー側に組み立てる(穴あけからのシールアクセスポイント)</td></tr><tr><td>アウトレットフィッティング - CIJ</td><td>Idex Health &Science</td><td>P-205</td><td>CIJ チャンバー出口フェルールにフェルールとチューブを取り付けて組み立て</td></tr>る <tr><td>- CIJ</td><td>Idex Health &Science</td><td>P-200</td><td>アウトレット フィッティング (ラージ エンド フラッシュ チューブ付き)</td></tr> <tr><td>アウトレット チューブ - CIJ</td><td>Idex Health &Science</td><td>1517</td><td>端をきれいにするためにチューブカッターを使用してください。余分なチューブがミキシングチャンバーに侵入しないようにする</td></tr><tr><td>テトラヒドロフラン(THF)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>T425-4</td><td>BHTの溶解度制限を避けるために、スタビライザーフリーのTHFを使用してください。過酸化物は、一部のアプリケーションで干渉する可能性があります。</td></tr><tr><td>Norm-jectシリンジ(3 ml)</td><td>VWR</td><td>53548-017</td><td></td></tr><tr><td>ビタミンE(&α;-トコフェロール)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90669-50G-F</td><td>冷蔵</td></tr><tr><td>ポリ(スチレン-b-エチレングリコール)、PS1.6k-b-PEG5k</td><td>ポリマーソース</td><td>P13141-SEO</td><td>用途に応じて許容されるその他のブロックサイズ</td></tr>ポリ<tr><td>(スチレン)<サブ>1.8k</サブ></td><td>ポリマーソース</td><td>P2275-S</td><td>疎水性コア材料の例</td></tr><tr><td>シンチレーションバイアル</td><td>DWK Lifesciences</td><td>74504-20</td><td></td></tr><tr><td>ルアースリッププラスチックシリンジ、1ml (100 pk)</td><td>National</td><td>S7510-1</td><td></td></tr><tr><td>マルトデキストリン DE 4-7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>419672-100G</td><td></td></tr><tr><td>ポリ (スチレン-b-アクリル酸)、PS5k-b-PAA4.8k</td><td>ポリマーソース</td><td>P5917-SAA</td><td>用途に応じて許容されるその他のブロックサイズ</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>D159-4</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウムジフジレート</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>223506-25G</td><td>吸湿性。</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>水酸化アンモニウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>AC423300250</td><td></td></tr><tr><td>鶏卵白(オボアルブミン、OVA)からのアルブミン</td> シ<td>グマ-アルドリッチ</td><td>A5503-1G</td><td></td></tr><tr><td>マルチインレットボルテックスミキサー</td><td>NA</td><td></td><td>NA エンジニアリング図面の補足情報を参照してください。新しいミキサー検証</td></tr><tr><td>アウトレットフィッティングのレビューテキスト - MIVM</td><td>Idex Health &Science</td><td>P-942</td><td>フェルール付きコンビネーション</td></tr><tr><td>アウトレットチューブ - MIVM</td><td>NA</td><td>NA</td><td>フェルールIDに適合。</td></tr><tr><td>Oリング (MIVM)</td><td>C.E. Conover</td><td>MM1.5 35.50 V75</td><td>一括注文 - 消耗部品です。別の供給源を使用する場合は、溶剤の互換性を確認してください。</td></tr><tr><td>ミキサースタンド</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Markwalter&を参照してくださいデザインのためのPrud'homme class<="xref">17</td></tr></tbody></table>

高分子ナノ粒子の疎水性および親水性化合物のカプセル化のため nanoprecipitation をフラッシュします。

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

治療化合物のナノ粒子 (NPs) への定式化は、ユニークな特性を与えることができます。難水溶性薬物の NP 製剤は、バイオアベイラビリティを改善し、体内の薬剤分布を変更できます。ペプチッドまたは蛋白質のような水溶性薬物は、NPs 内のカプセル化にも自然のクリアランス機構からの保護を提供できます。拡張性の高い、高分子の NPs の生産のためのほとんどのテクニックがありません。フラッシュ NanoPrecipitation (FNP) は、使用するプロセス設計狭い粒径分布と 30 〜 400 nm の間の波長可変サイズ NPs を生成する混合ジオメトリです。このプロトコルは、FNP を使用してターゲット サイズのナノ粒子を高分子コア-シェルの実験室規模の生産について説明をします。唯一のマイナーな修正と親水性または疎水性化合物をカプセル化するプロトコルを実装できます。技術は画面製剤にミリグラムのスケールで研究室で容易に用いることができます。鉛ヒットすることができます直接スケール アップ グラムとキログラム スケールに。継続的なプロセスとしてスケール アップには、新しい容器への変換ではなく長くミキシング プロセスの実行時間が含まれます。FNP によって生成される NPs が治療で高負荷、高密度の安定化ポリマー ブラシ、± 6% のサイズの再現性を付いてください。

FNP と NP 製剤のスクリーニングは急速な (1-10 mg) 挟まれる材料の少量を必要とします。ビタミン E (ステップ 1) など疎水性化合物をカプセル化する FNP プロトコルは安定した、明確または軽く乳白色 NP 分散の結果します。動的光散乱法 (DLS) 粒子径を特徴付けるための堅牢な手段を提供します。図 3に示すように、プロセスは、再現可能な方法で低分散で NPs を生成します。典型的な分散インデックス (PDI) 0.20 よりも小さいを示す、比較的単分散人口。PDI 自己相関関数から取得して計測器のソフトウェアによく実装されています。それは 2 番目の最初の瞬間の比率 0.1 の値は、一般的に単分散粒子26に取得されます。4 ビタミン E/PS の-b-値は 0.12 ± 0.02 と平均直径 107 ± 7 nm、PEG 製剤レプリケート報道します。注射器のいずれかのむらうつ病またはうつ病速度による典型的な「不発」は、図 3にも報告されます。分散は影響を受けなかったが、サイズがちょっと大きい (135 nm)。このサンプルを含む粒子サイズの新しいメトリックが 113 ± 14 nm です。商工会議所が単一のストリームの種類だけに含まれている期間で起因する失火。同じプロセスの履歴およびミキサー内有機と水溶液中のストリームの相対的なボリューム ストリーム全体を経験することが重要です。安定せず表示される骨材を用いた不透明なソリューションが生成されます。このサンプルの DL の自己相関関数は非単調、図 3嵌め込む式に見られるように、スムーズに崩壊しません。
FNP による粒子サイズ制御、図 4に示されて芯材-ポリスチレンこの場合-と PS -1.8 k bの相対的な量をさまざまな場所-49 152 nm からの粒子サイズで起因したペグ スタビライザー。これらの粒子のサイズが 25%、50% または 75% の質量がポリ芯材をされたコアの総質量濃度と 20 Mg/ml のスタビライザーを含む THF ストリームを生成されました。ナノ粒子の分散が 0.15 未満で常にだった。文献10でパラメーターに及ぼす粒 FNP プロデュースの広範な議論があります。読み込みは、溶媒量の定数を保持していると、コアと安定剤原液の相対的なボリュームを変化によって調整できます。同様に、総質量濃度は 10 mg/mL 以外の値で原液を準備することによって変えることができます。特定の条件下で DLS27によって空ミセル人口を観察することが可能です。測定粒径分布を広げる以外の任意の有害な影響はありません。サイズが類似している場合、これは 2 つの別々 のピークではなく、単一の広いピークとしてマニフェストがあります。
同じ CIJ ミキサーは、プロトコルの手順 2 で例示として iFNP によって親水性化合物をカプセル化するも使用できます。報告された定式化で生成した粒子は約 65 nm 0.08 の低分散。サイズ分布は、図 5 a (破線) で見ることができます。図 5 bに示すように、粒子安定性に PAA カルボン酸残基を発揮、DMSO などの強い溶剤で DLS による架橋の影響。まあ架橋粒子の自己相関関数始めるべき 1 のドロップ値近く大幅 0 粒 (実線) に関連する特徴的な時にです。広範囲に膨潤または溶解粒子架橋は、最小限の自己相関信号 (点線) を表示します。IFNP の失敗した試験は同様の方法でマニフェスト FNP 上記のとおり。表示されている集計を見ることができるまたは貧しい DLS 自己相関関数の形状を観察する可能性があります。以上 2 つの入口のストリームが溶解度や化学の非互換性などのシステム制約のため必要な場合、FNP の iFNP、MIVM を使用できます。そのミキサー スタンド付き MIVM (μMIVM) の小規模版を図 2に示します。CIJ と同様、疎水性または親水性化合物22をカプセル化するこのミキサーを使用できます。ステップ 3 では、iFNP による親水性タンパク質、OVA のカプセル化プロトコルが記述されていた。粒径分布は、図 5 a (実線) で表示されます。サイズは約 125 0.16 の PDI の nm。縮尺が大きいほどシリンジ ポンプ操作のための一般的なプロトコルは、ステップ 4 で提供されます。
<img alt="溶媒と反溶媒の混合図、焼入れセットアップにより、ナノ粒子の図が描かれます。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図 1: ミキサー アセンブリおよび内部のフロー パターン概略図。付属の注射器で (A) 限られた衝突噴流 (CIJ) ミキサーは焼風呂の上にあります。焼風呂バイアルと撹拌プレート攪拌棒が描かれていません。混合ジオメトリは、商工会議所の中心に影響を与える 2 つのストリームの入口を示す拡張ビューで描かれています。(B) A の複数入口渦のミキサー (μMIVM) は、ガラスの注射器と、焼風呂上スタンドで配置。モバイル板と機械の停止は、画像からトリミングされています。拡大ビューでは、渦室および入口チャネルを模式的に表示されます。(C) A FNP によるコア-シェル NPs の模式図。赤い球に青い折りたたまれたポリマー ブロックと併用治療を表す、NP のコアを構成します。NPs に立体安定を与えるブラシ層を形成して黄色ポリマー ブロック<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="材料試験で形状を混合するためのラベル付き成分を含むレオメーターセットアップ図。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図 2: μMIVM 用語およびアセンブリのコンポーネントです。ΜMIVM では、ミキサー スタンド 4 注射器の制服うつ病を有効にする必要があります。この場合、すべてのシリンジのプランジャー ハイツはある均一な混合を確実に制服で必要があります。また、シリンジ ポンプを使用して操作することができます。ミキサー スタンド ラベル付きコンポーネントは、図の左に表示されます。右側は混合ジオメトリ ディスク上の場所で o リングを逆アセンブルしたミキサーです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="正規化された強度とNPの直径グラフ。相関時間の挿入;粒子分析結果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図 3: 粒子サイズのビタミン E のコアを含む高分子ナノ粒子の分布と PS の-bの安定化-ペグします。動的光散乱 (DLS) は、NP の直径分布を示す強度加重サイズ分布を提供します。曲線は、各試験の帳票分析の平均し、同一の最大ピークの高さを生成する再します。(実線) の 4 つの複製を示すメソッドの高再現性 (標準偏差 = 7 nm)。注射器速度など大きい粒子径となる注射器 2 本の不均等なうつ病代表不発 (破線) も含まれています。不発を含む NP サイズの標準偏差は 14 nm。(インセット)PS の-bなし-ペグ スタビライザー、大規模なミクロン スケール集計 (またはビタミン E のような油の場合、水滴) が形成されます。スタビライザー (点線) なしの実行の DLS 自己相関関数は、ナノ粒子の複製 (実線) から代表的な自己相関とともに表示されます。自己相関関数は、コントロールのサンプルは、多人口を示す特徴的な時間スケールの数を示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="ナノ粒子サイズ分布;グラフ;コアパーセンテージの正規化された強度とNP直径。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図 4: コア安定装置に材料の相対比を変化させることを介して FNP による粒子サイズ制御します。PS の-bの安定化ポリスチレン コア 3 つ配合強度加重サイズ分布-ペグが描かれています。Thf 中で総質量濃度が 20 mg/mL と、antisolvent が水。CIJ ミキサーで製剤を調製しました。芯材の質量の割合は、凡例に表示されます。たとえば、25% コア試料には 5 mg/mL ポリスチレンと 15 mg/mL PSbが含まれて-ペグします。25% (実線)、50% (破線)、および 75% (混合の破線) コア荷重の平均的なサイズが 49 nm、96 nm、および 152 nm、それぞれ。PDI のすべての値は 0.15 未満でした。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="NP直径分析;グラフ (A)、相関時間研究。グラフ(B)、動的光散乱。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 図 5: CIJ ミキサーまたは μMIVM で作られた逆の NPs のキャラクタリゼーション。DLS (A) 曲線の各製剤の帳票分析の平均です。破線は、実線は、μMIVM で行われた OVA 粒子のサイズ分布は CIJ ミキサー、3 k MD 粒子のサイズ分布を示します。(B) 架橋結合の強さは、希釈剤として DMSO を使用して DL によって評価できます。DLS の自己相関関数は、初期の自己相関値によって架橋結合の強さとゼロの値にきれいな転移の観察を示します。破線は、初期の信号が弱いと幅広い減衰時間を示すない架橋剤と粒子の自己相関関数を示しています。実線は、強力な最初の信号と定義された崩壊のタイム スケールを示しています (この例はテトラエチレンペンタミン) で強力な架橋剤添加後自己相関を示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="過飽和対有機溶媒チャート;ペプチドB、ボスカリド溶解度分析、科学データ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> 図 6: 過飽和、水に有機溶媒の相対的な混合比の関数としての S.(○) ボスカリド、農薬、(○) ペプチド B、7 残基ペプチドの最高の達成可能な過飽和の (A) の比較。有機のストリームでは、ボスカリド 230 mg/mL と 200 mg/ml、飽和濃度 B ペプチドの濃度で含まれています。各原薬 (API) に依存している最大の過飽和状態がある/溶剤システム。(B) 有機ストリームのボスカリドの濃度が減少する 20 倍、過飽和状態および nanoprecipitation の達成を条件になる限られました。この図は、エルゼビア9から許可を得て転載します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

フラッシュ NanoPrecipitation (FNP) は、高分子コア-シェル粒子を生成するスケーラブルなアプローチです。疎水性または親水性の治療薬のカプセル化のための実験室規模製剤を説明します。

高分子ナノ粒子の疎水性および親水性化合物のカプセル化のため NanoPrecipitation をフラッシュします。

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

ここで示すフラッシュナノ沈降、またはFNP技術は、ポリマーナノ粒子の内部に疎水性または親水性化合物をカプセル化するためのスケーラブルで簡単なプラットフォームを提供します。分かりやすくするために、生物学的製剤をカプセル化するために使用される技術は、逆フラッシュナノ沈降、またはIFNPと呼ばれています。基礎となる原理は変わらないが、得られるナノ粒子構造は異なる。一般に、新しいユーザーは、小さなナノ粒子バッチを手動で作成する際に、一貫して入口注射器を操作する練習が必要です。より大きい容積はコンピューター制御されたスポイトポンプと製造することができる。我々のプロトコルはまた、製剤の適用を成功させるためにしばしば重要であるナノ粒子溶液の後処理に関する詳細を提供する。プロセスを開始する前に、CIJミキサーの継手を確認し、出口管が圧着されていないことを確認してください。次に、2つの5ミリリットルポリプロピレンゴムフリールアーロックシリンジを2〜3ミリリットルのアセトン、または別の洗浄溶媒で充填します。注射器を入口アダプターにロックし、アセンブリを無駄なコンテナーの上にセットします。着実に数秒の間に混合チャンバーを介して溶媒を送信するためにプランジャーを落ち込ませる。次いで、注射器を取り出し、窒素ガスの流れで混合物を乾燥させた。次に、溶媒入力流の調製を開始し、ピペット0.25ミリグラムの1ミリグラムのビタミンEの1ミリリットル溶液、安定剤遊離テトラヒドロフランで、1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入る。次いで、THF中のブロック共重合体安定剤の1ミリリットル当溶液当たり10ミリグラムのピペット0.25ミリリットルを同じチューブに入れた。混合物を5〜10秒間ボルテックスし、その後、キャップに付着した液体を回収するために5〜10秒間1000Gで遠心分離する。0.525ミリリットルの脱イオン水を含む1.5ミリリットルの遠心管を抗溶媒として調製します。次いで、4ミリリットルの脱イオン水を20ミリリットルのシンチレーションバイアルにピペットし、クエンチバスを作る。バイアルに小さな攪拌バーを置きます。クリーンなCIJミキサーを、ラックまたは試験管ブロックのクエンチバスの上に攪拌板に置きます。可能な最大速度の約75%でクエンチバスを攪拌開始します。次に、鈍い先端の針を1ミリリットルのポリプロピレンゴムフリーシリンジに合わせ、抗溶媒を引き出す。慎重に注射器から気泡を排出し、その後、針を取り外し、処分します。液体が注射器の端に来るようにプランジャーを調整します。次に、シリンジをCIJの入口の1つに取り付けます。同じ方法で第2の注射器に溶媒混合物を引き込み、もう一方の入口に取り付けます。ナノ粒子を形成するために、同時に0.5秒未満で滑らかな均一運動で両方のプランジャーを押し下げます。注射器を迅速かつ均等に、かつスムーズに押し下げることは非常に重要です。あなたは突然注射器を打つべきではありませんが、すでに注射器の上部に接触している動きを開始する必要があります。その後、シリンジを取り外さずに、シリンジを取り外さずに、シジェを分散液に排出しないようにCIJミキサーをセットします。シンチレーションバイアルから攪拌バーを取り出し、キャップします。その後、溶媒と抗溶媒注射器を除去し、廃棄する。次のフラッシュナノ沈殿試験の前にミキサーを洗浄してください。動的光散乱分析用のサンプルを調製するために、100マイクロリットルの分散液をキュベットにピペットで調製した。900マイクロリットルのクエンチバス溶剤を加え、サンプル分析を開始する前にピペッティングでよく混ぜます。マイクロ MIVM の組み立てを開始するには、O リングをミキシング ジオメトリ ディスクに配置します。ミキシングディスクの穴を上部ディスクのペグと合わせ、Oリングを変えないように注意して一緒にフィットします。下部の受信機のコンセントチューブフィッティングを緩め、接続したディスクを受信機にねじ込みます。スパナレンチを上部ディスクのペグに合わせ、アセンブリを締めます。混合ジオメトリディスクの底面にしっかりと合わせるように、出口管の継手を締めます。上部ディスクのシリンジ継手がぴったりであることを確認します。ミキサースタンドのモバイルプレートを上げて邪魔さないようにし、組み立てたミキサーをスタンドに置き、出口チューブをサポートプレートに通します。次に、5.25ミリリットルのクロロホルムを含む15ミリリットルの遠心管を出口管の下にクエンチ浴として置きます。次に、10%の体積でジメチルスルホキシドのオボアルブミンのミリリットル溶液あたり5ミリグラムである溶液Aの0.75ミリリットルを、鈍い先端の針で1ミリリットルのガスタイトなルアーロックシリンジに引き出す。気泡を慎重に排出し、針を取り除き、溶液をLuerのフィッティングの端までプライムします。シリンジをミキサーの入口に接続します。このプロセスを、DMSOのブロック共重合体安定剤のミリリットル当たり6ミリグラムである各溶液BおよびTHFである溶液Cで、このプロセスを繰り返します。シリンジを時計回りにミキサーの入口にアルファベット順に接続します。クロロホルムである溶液Dの1.85ミリリットルを含む2.5ミリリットルのガスタイトシリンジを準備し、それを4番目の入口に接続します。シリンジの高さに大きな差がないことを確認します。次に、モバイルプレートの両側のベアリングハウジングを慎重に握り、シリンジの上に均等に置くのがやっとになるまでゆっくりとプレートを下げます。ナノ粒子を生成するために、着実かつスムーズに約0.5〜1秒でプレートを押し下げます。次に、クエンチバスチューブを取り外し、キャップします。終了したらミキサーを分解して清掃します。より大きい容積で働くために、ガスのきついスポイトに解決をロードし、スポイトにLuerの付属品とポリテトラフルオロエチレン管を接続する。チューブの端にソリューションをプライム。シリンジをシリンジポンプにクランプし、適切なミキサーの入口にチューブを取り付けます。起動ボリュームを収集するための出口管の下に小さな廃棄物バイアルを置きます。クエンチバスを準備し、近くに保管してください。同時に、ポンプを起動し、約5ミリリットルの排水が廃棄物バイアルに流れ込みます。次に、いつものようにクエンチ浴中のナノ粒子の採取を開始する。攪拌板は、必要に応じてクエンチ浴を混合するために使用され得る。疎水性コアを有する高分子ナノ粒子のFNPの4つの複製は、CIJミキサーで調製され、高い複製性を示し、比較的単分散性であり、平均直径は107ナノメートルであった。遅いまたは不均一なシリンジのくぼみからの代表的なミスファイアは、わずかに大きな粒子を生成し、この例では多分散性が影響を受けなかったが、誤射はより多分散分布をもたらす可能性がある。DLSの自己相関関数は、代表的な高分子ナノ粒子サンプルに対してスムーズに減衰しました。この滑らかな崩壊は、代わりにミクロンスケールの油滴を生成するブロック共重合体安定剤を使用せずに製剤を試みた場合には認められなかった。安定剤に対するコア材料の相対量は、ここで示すように、ポリスチレンコアを有するナノ粒子において粒子サイズを制御した。PDIは各製剤において0.15を下回った。IFNPによって生成された親水性コアを有するナノ粒子。CIJミキサーで調製したマルトデキストリンコアを有する粒子は、直径約65ナノメートルであり、PDIは0.08であった。マイクロMIVMで調製されたオボアルブミンコアを有する粒子は直径約125ナノメートルで、PDIは0.16であった。FNPとIFNPは、分子やナノ粒子を処理するための強力なツールです。いずれの手法を行う前に、混合中に高い超飽和を確保するために、すべての溶媒、または溶媒混合物における各成分の可溶性を考慮してください。基本的なテクニックは簡単ですが、注射器のうつ病のステップを習得するにはいくつかの練習が必要です。問題が発生した場合は、このビデオに示すようなシリンジポンプのセットアップを使用して一貫性を向上することを検討してください。荷電親水性分子、または中間溶解度を有する分子については、FNPは、効率的なカプセル化を可能にする疎水性イオン対合と組み合わせてもよい。FNPはまた、同じナノ粒子コア内の複数の化合物をカプセル化するために使用することができる。必要な用途でナノ粒子分散から有機溶媒を除去する方法については、テキストやその他の文献リソースをご覧ください。また、貯蔵中にナノ粒子を安定化させる技術も様々です。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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高分子ナノ粒子の疎水性および親水性化合物のカプセル化のため NanoPrecipitation をフラッシュします。

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