哺乳類 2 ハイブリッド法によるエストロゲン受容体 α リガンド結合ドメインの二量体化活性の検出

したがって、この方法は、エストロゲン受容体αを調節するエストロゲンリガンドの能力と選択的エストロゲン受容体モジュレーターのメカニズムに関する重要な質問に答えることができます。この手法の主な利点は、単純な方法です。細胞内のリガンド依存性エストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン二量体化活性を示す。

手順をデモンストレーションするタナー・ジェファーソン、私たちのグループのポスドクの学生になります。この方法は、細胞内のエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン二量体化活性を検出するために3つの異なるプラスミドを使用する。pG5-Lucは、二量体化活性の有効性を検出するためのルシファーゼレポータープラスミドである。

pBINDマウスエストロゲン受容体αEFは、pG5-Lucレポーター上のGAL4応答性要素に結合する主融合マウスのエストロゲンαリガンド結合ドメイン発現プラスミドに結合するガラクトース応答性転写因子GAL4 DNAである。pACTマウスエストロゲン受容体αEFは、pG5-Lucレポーターに直接結合しないマウスエストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン発現プラスミドを融合した単純なウイルストランスアクティベートセグメントタンパク質VP16活性化ドメインである。適切なリガンドが存在する場合、pBINDマウスエストロゲン受容体αEFおよびpACTマウスエストロゲン受容体αEFプラスミド由来のタンパク質は、エストロゲン受容体αリガンド結合ドメインを介して結合する。

二量体化の効率は、ルシファーゼ活性によって決定される。最も重要なステップは、pBINDマウスエストロゲン受容体αEF由来タンパク質の活性を制御することである。pACTエストロゲン受容体を含まない各リガンドにおけるpBIND由来エストロゲン受容体αリガンド結合ドメインの活性は、リガンド依存性エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン二量体化活性を分析する前に評価しなければならない。

適切なプラスミドの組み合わせを、組み合わせごとに2つの1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに追加します。DNA混合物の2つの組み合わせを準備します。第1の管は、pG5-Luc、pBIND-エストロゲン受容体-αEF、および空のpACTプラスミドを含む。

第2の管は、pG5-Luc、pBIND-エストロゲン受容体-αEF、およびpACT-エストロゲン受容体-αEFプラスミドを含む。DNAを沈殿させるために、3つの酢酸モルナトリウムのDNA混合物体積の1/9と20X3酢酸ナトリウム100%エタノールの3倍の大臼歯ナトリウムを各チューブおよび渦管のDNA混合物に加える。翌朝の最高速度で遠心分離機を行う前に、一晩摂氏20度で混合物を保管してください。

上澄み液を捨て、チューブあたり75%エタノールの120マイクロリットルで目に見えないペレットを再中断し、チューブの内側に付着したDNAをすすいでください。同じ条件で2回目の遠心分離を行った後、上清を捨てて、真空濃縮器でDNAを30分間乾燥させます。トランスフェクションでは、調製したヒト肝細胞癌細胞を1回の洗浄1回あたり0.5ミリリットルの室温PBSで2回洗浄し、10%炭除去熱不活化ウシシ血清および2ミリモルL-グルタミンを補った新鮮な37度のフェノール赤自由MEMの0.5ミリリットルで細胞を供給する。

次に、乾燥プラスミドDNA混合物およびトランスフェクション試薬を、個々の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管内のウェル数当たりの適切な量のDMEMで懸濁液。各DMEM懸濁プラスミドDNA混合物チューブに等量のトランスフェクション試薬培地を加える。室温で5〜10分間のインキュベーションの後、24ウェルヒト肝細胞癌細胞培養プレートの適切な実験井戸に25マイクロリットルのDNA混合物を加え、細胞培養インキュベーターで6時間のトランスフェクションを行う。

そして、インキュベーションの終わりは、10%の炭を取り除いた熱不活性化FBS、2ミリモルLグルタミン、1%ペニシリンストレプトマイシン、およびリガンドを18時間に細胞培養インキュベーターに戻した新鮮な37°Cフェノール赤自由MEMの0.5ミリリットルでトランスフェクション培地を交換し、細胞を18時間に戻す。翌朝、細胞を井戸1回につき1ミリリットルのPBSで洗い、各ウェルから100マイクロリットルの受動的な溶菌バッファーをボルテックスミキサーで激しく揺れ動かして細胞を取り付けます。その後、液体窒素中の細胞ライセートを凍結します。

二重ルシファーゼアッセイの日に、プレートが室温に達するまでシェーカーでライセートを振り、96ウェルの白いプラスチック板の個々の井戸に10マイクロリットルのライセートを移します。次に、マイクロプレートリーダー上の各細胞ライセートサンプルのルシファーゼ活性を読み取る。pBINDマウスエストロゲン受容体αEFおよびpACTプラスミドの治療は、10ナノモルエストラジオールを有するトランスフェクト細胞を刺激し、エストロゲン受容体αリガンド結合ドメインがリガンド依存性トランス活性化機能ドメインであるAF-2を含有するようにルシファーゼ活性を刺激する。

しかし、1および10ナノモル濃度は、pBINDおよびpACTマウスエストロゲン受容体αEFプラスミドの組み合わせでトランスフェクトされた細胞におけるルシファーゼ活性を誘導し、エストラジオール治療のナノモル1ナノモルでエストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン二量体化活性を評価するためのこの手順の実現可能性を示唆している。4-ヒドロキシタモキシフェンによる治療は、pBINDマウスエストロゲン受容体αEFおよびpACTプラスミドトランスフェクション細胞におけるルシファーゼ活性を惹起せず、エストロゲン受容体αのAF-2機能がこのリガンドによって活性化されないことを示唆している。しかし、最大10ナノモル濃度は、pBINDおよびpACTマウスエストロゲン受容体αEFプラスミドの組み合わせでトランスフェクトされた細胞中のルシファーゼ活性を誘導し、この手順は、4-ヒドロキシタモキシフェン処理の最大10ナノモルでエストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン二量体化活性を評価するために実現可能であることを示唆している。

pBINDとpACTマウスの組み合わせから4-ヒドロキシタモキシフェンとの発現プラスミドのエストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン発現プラスミドは、pBINDとpACTヒトエストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン発現プラスミドの組み合わせよりも有意に高い。これは、マウスエストロゲン受容体αリガンド結合ドメインの4-ヒドロキシタモキシフェン依存性ホモジマー化活性がヒトエストロゲン受容体αリガンド結合ドメインよりも強力であることを示している。また、ヒトFドメインを含むマウスエストロゲン受容体αリガンド結合ドメインの4-ヒドロキシタモキシフェン依存性ホモジマー化活性は、野生型マウスのエストロゲン受容体αリガンド結合ドメインのそれよりも有意に低い。

これに対し、マウスFドメインを含むヒトエストロゲン受容体αリガンド結合ドメインの4-ヒドロキシタモキシフェン依存性ホモジマー化活性は、野生型ヒトエストロゲン受容体αリガンド結合ドメインのそれよりも有意に高い。これは、Fドメインが種特異的な4-ヒドロキシタモキシフェン依存性エストロゲン受容体αリガンド結合ドメインホモメーラ化活性に影響を及ぼすことを示唆している。この手順を試みている間に、 GAL4 DNA結合ドメインの基底活性をテストすることが重要です エストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン活性をリガンドと結合.

その活動は、車両の治療と同じである必要があります。