Name: 哺乳類 2 ハイブリッド法によるエストロゲン受容体 α リガンド結合ドメインの二量体化活性の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: 学ぶ哺乳類2ハイブリッド法によるエストロゲン受容体αリガンド結合ドメインの二量体化活性解析。ルシフェラーゼレポーターを用いた細胞ベースアッセイで、選択的エストロゲン受容体調節薬の作用機序を解明する簡便な手法です。

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著者は、原稿とタナー ジェファーソンの彼らの重要な読書のためのビデオの手順を実行するため夫妻末吉と王で、国立環境衛生研究所 (NIEHS) をありがとうございます。この作品は、(K.S.K.) に、NIEHS の学内研究部門からの国内機関の健康の付与 1ZIAES070065 によって支えられました。

<ol><li>Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+F+domain+of+estrogen+receptor+%CE%B1+is+involved+in+species-specific%2C+tamoxifen-mediated+transactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).</li>
<li>Brzozowski, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+agonism+and+antagonism+in+the+oestrogen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor.</a> Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).</li>
<li>Shiau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+estrogen+receptor%2Fcoactivator+recognition+and+the+antagonism+of+this+interaction+by+tamoxifen%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen.</a> Cell. 95 (7), 927-937 (1998).</li>
<li>Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+F-domain+of+estrogen+receptor-alpha+inhibits+ligand+induced+receptor+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).</li>
<li>Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carboxy-terminal+F+domain+of+the+human+estrogen+receptor%3A+role+in+the+transcriptional+activity+of+the+receptor+and+the+effectiveness+of+antiestrogens+as+estrogen+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 9 (7), Baltimore, MD. 814-825 (1995).</li>
<li>Koide, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Regions+within+the+F+Domain+of+the+Human+Estrogen+Receptor+%CE%B1+that+Are+Important+for+Modulating+Transactivation+and+Protein-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions.</a> Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).</li>
<li>Mitry, R. R., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMitry%2C+RR+%22Human+Cell+Culture+Protocols%22">Human Cell Culture Protocols</a>. , Humana Press. (2011).</li>
<li>Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivation+Function-2+of+Estrogen+Receptor+%CE%B1+Contains+Transactivation+Function-1-regulating+Element%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).</li>
<li>Huang, H. -J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+negative+regulatory+surface+within+estrogen+receptor+alpha+provides+evidence+in+support+of+a+role+for+corepressors+in+regulating+cellular+responses+to+agonists+and+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 16 (8), Baltimore, MD. 1778-1792 (2002).</li>
<li>Chang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+LXXLL+nuclear+receptor-coactivator+interaction+motif+using+combinatorial+peptide+libraries%3A+discovery+of+peptide+antagonists+of+estrogen+receptors+alpha+and+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta.</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).</li>
<li>Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+%CE%B1+L543A%2C+L544A+mutation+changes+antagonists+to+agonists%2C+correlating+with+the+ligand+binding+domain+dimerization+associated+with+DNA+binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).</li>
</ol>

著者申告するものがあります。

ここで、我々 は例として ERα LBD のダイマー化アクティビティを検出するアッセイ条件に焦点を当て M2H 試金のためのプロトコルを説明します。一般に、M2H アッセイは、リガンド依存性 ERα LBD 二量体化活動の評価のため人気がないです。これは転写活性化機能を有する ERα LBD 原因です。活動はいくつかのケースで、M2H アッセイの結果を妨げます。しかし、我々 がここに示すよう M2H アッセイは LBD (例えば4OHT、Serm) の AF 2 転写活性化関数をアクティブにしない特定の物質の LBD 二量体化活動の分析に使用できます。LBD (バック グラウンド アクティビティ) の本質的な活動を減らすためには、我々 は生産ロットから最低 E2 含む木炭除去 FBS を選択され、炭剥奪 FBS の熱不活化を使用します。これらの要因は、弱い相互作用の活動を検出する WT ERα LBD を使用して M2H アッセイの成功に重要です。さらに、我々 は ERα LBD 作動薬 (E2 および DES) の二量体化活性を示した AF 2 アゴニスト依存コアクチベーター採用活動を混乱させる mERα I362D...

エストロゲンの受容器のアルファ (ERα) は、エストロゲンのリガンド依存性転写レギュレータです。アミノ酸順序 ERα 種間保存性が高い。人間で高い相同性のため ERα をマウス、これらの受容体の機能は、同じものとして考えられてし、の種の違いによって引き起こされるそれらの種のエストロゲン様物質 (例えばタモキシフェン) 差分の活動化学代謝 ERα の構造的な違いではなく。ERα は高度 A を F ドメインに指定 (NR) 核内受容体スーパーファミリーの間で共通のドメイン構造に保存します。E ドメインまたはリガンド結合ドメイン (LBD) は、リガンド結合ポケットと転写活性化機能 2、AF 2 という名前です。F ドメインは、E ドメインに隣接はローカライズされ、NRs の間でほとんどの変数のドメインです。人間の間でもマウスの ERα、F ドメインの相同性は、他のドメイン1のそれよりも有意に低かった。リガンド ERα LBD は、リガンド依存性遺伝子の転写 (ERα の古典的なアクション) を規制するために直接特定のエストロゲン応答性 DNA 要素をバインドする ERα 蛋白質のダイマー化を向上させます。結晶構造解析は、LBD ダイマー2,3をバインド配置ヘリックス 12 (AF 2 コア ドメイン) または 4-ヒドロキシ-タモキシフェン (4OHT)、エストラジ オール (E2) との差異を明らかにしました。ERα F ドメイン (45 アミノ酸) ヘリックス 12 に直接接続します。ただし、ERα LBD ートコフェロール ヘリックス 12 から 45 アミノ酸 (F ドメイン) のこの拡張機能の影響に関する情報はありません。本研究では、哺乳類 2 ハイブリッド (M2H) アッセイを用いた特異的 4OHT 依存 ERα LBD ダイマー化を F ドメインの寄与を示しています。
M2H アッセイは哺乳類細胞の 3 つの異なるプラスミド Dna を導入することでタンパク質間相互作用を実証する方法: 2 つのタンパク質発現プラスミド、GAL4 DNA 結合ドメイン (DBD) 融合 ERα LBD と VP16AD の融合 ERα LBD を表現してGAL4RE 融合ルシフェラーゼ発現レポーター プラスミド。GAL4DBD 融合 ERα LBD と VP16AD 融合 ERα LBD が対話する (二量体を作る)、セルのこの蛋白質の複合体、GAL4RE にバインドし、その後、アクティブにルシフェラーゼ遺伝子発現 VP16AD 依存型転写活性化関数を。LBD ダイマー化のレベルは、ルシフェラーゼ活性によって評価できます。
酵母 2 ハイブリッド (Y2H) アッセイは、酵母を使用して、ホスト環境と同じ原理に基づく代替方法です。Y2H システムを使用して以前のレポートは、人間 ERα LBD の F ドメイン切り捨て増加 E2 依存コアクチベーター募集 F ドメインが E2 を介した転写4を防止することを締結することを示した。この結果、哺乳類細胞5,6F ドメイン切り捨て人間 ERα の減衰転写活性を示している他のレポートと一致。最近、M2H システムを使用して、我々 の研究は、人間 ERα LBD の E2 依存コアクチベーター採用活動が哺乳動物細胞での F ドメイン切り捨てによる減少は、転写アクティビティ1と一致を示した。タンパク質間相互作用の生理的役割細胞型固有の方法でコンテキストとは異なることが示唆されました。M2H アッセイは、転写活性を決定するために使用される同じ細胞コンテキストのタンパク質-タンパク質相互作用アクティビティをデモンストレーションできます。これは、Y2H や他の in vitroタンパク質-タンパク質相互作用解析に比べて M2H アッセイの利点を提供します。
選択的エストロゲン受容体モジュレーター (Serm) (例えば4OHT) ERα を介した転写を調節する部分アゴニスト活性の分子メカニズムに関する質問が残っています。ERα LBD M2H アッセイは、様々 な哺乳類の細胞タイプの Serm の部分アゴニスト活性のメカニズムを研究に適用あります。

<table><tbody><tr><td>pG5-Luc</td><td>Promega</td><td>E249A</td><td>CheckMate 哺乳類ツーハイブリッドシステムのコンポーネント</td></tr><tr><td>pBIND</td><td>Promega</td><td>E245A</td><td>CheckMate 哺乳類ツーハイブリッドシステムのコンポーネント</td></tr><tr><td>pACT</td><td>Promega</td><td>E246A</td><td>CheckMate 哺乳類ツーハイブリッドシステムのコンポーネント</td></tr><tr><td>ワンショット TOP10 ケミカルコンピテント大腸菌</td><td>C404010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td>ローター <td>SORVALL</td><td>75006445</td><td></td></tr><tr><td>スイングバケット</td><td>SORVALL</td><td>75006441</td><td></td></tr><tr><td>細胞再懸濁液 (CRA)</td><td>プロメガ</td><td>A7112</td><td></td></tr><tr><td>細胞溶解液 (CLA)</td><td>プロメガ</td><td>A7122</td><td></td></tr><tr><td>中和液 (NSA)</td><td>プロメガ</td><td>A7131</td><td></td></tr><tr><td>カラム洗浄液 (CWB)</td><td>プロメガ</td><td>A8102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Midipreps DNA Purification Resin</td><td>Promega</td><td>A7701</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Midicolumns</td><td>Promega</td><td>A7651</td><td></td></tr><tr><td>MEM、グルタミン不使用、フェノールレッド</td>不使用 <td>Gibco</td><td>51200038</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>0.5% トリプシン-EDTA (10x)</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (100x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-106</td><td>熱不活性化</td></tr><tr><td>チャコール:デキストランストリッピング ウシ胎児血清</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-119</td><td>熱不活化</td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース、グルタミンなし、フェノールレッドなし</td><td>トランスフェクション用</td><td>Gibco</td><td>31053028</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>の 11668027</td><td></td></tr><tr><td>受動溶解 5X バッファー</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td></td></tr><tr><td>デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム</td><td>Promega</td><td>E1980</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax L マイクロプレートリーダー</td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SoftMax Pro ソフトウェア</td><td>分子デバイス</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

哺乳類 2 ハイブリッド法によるエストロゲン受容体 α リガンド結合ドメインの二量体化活性の検出

Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

エストロゲンの受容器のアルファ (ERα) は、エストロゲンのリガンド依存性転写レギュレータです。ERα タンパク質のシーケンスは、種間保存性が高い。それは人間の機能およびマウス ERαs が同じであると考えられています。マウスと人間の ERα リガンド結合ドメイン (LBD) 二量体化活動哺乳類 2 ハイブリッド (M2H) アッセイを用いた差動 4-ヒドロキシ-タモキシフェン (4OHT) の効果を実証します。M2H アッセイは 2 つ蛋白質発現プラスミド (GAL4 DNA 結合ドメイン [DBD] 融合 LBD と VP16 転写活性化ドメイン [VP16AD] フュージョン LBD) のトランスフェクションを利用した哺乳類セルの LBD ダイマー化活動の効率性を示すことができるとGAL4 応答性エレメント (GAL4RE) は、ルシフェラーゼ レポーター プラスミドを融合しました。GAL4DBD 融合 LBD と LBD VP16AD 融合細胞の二量体を作る、この蛋白質の複合体は、GAL4RE に結合し、その後、VP16AD 依存性転写活動を通じてルシフェラーゼ遺伝子の発現を活性化します。4OHT を介したルシフェラーゼ活性は、マウス ERα LBD 融合タンパク質発現プラスミドよりひと ERα LBD 融合タンパク質発現 transfected プラスミッド細胞を導入させた HepG2 細胞で高い。4OHT 依存マウス ERα LBD ダイマー化活動の有効性は人間の ERα LBD よりも高いと考えられる。一般に、M2H アッセイの使用率は核内受容体 LBD 二量体化活動の評価にとって理想的 LBD 活動の基底のレベルを高め、LBD 二量体化活性の検出を妨げ敵対配位子。その 4OHT に ERα LBD 基底活性強化ないとわかりました。決定および M2H アッセイを正しく使用するための 4OHT 依存 LBD 二量体化活動を検出することの重要な要因であります。ERα LBD M2H アッセイは、様々 な哺乳類の細胞選択的エストロゲン受容体モジュレーター (例えば4OHT) の部分アゴニスト活性を研究する適用できます。

図 3では、組み合わせ (i) と (ii) プラスミド トランスフェクト細胞の組み合わせで可能な応答のスキームが表示されます。実験の結果は図 4のとおりです。(I) (pG5 リュック + へ mERαEF 協定) の組み合わせの活動刺激を示しています 10 nM E2 (図 4A) ERα LBD に AF 2 リガンド依存性転写機能ドメインが含まれているため。アゴニスト (例えばE2) ERα LBD にバインドする募集転写 coactivator(s) AF 2 ドメインにしています。このイベントは VP16AD 融合 LBD と相互作用せず転写活性化を引き起こすし、非特異的なバック グラウンド (図 3C) ため LBD ダイマー化活性を評価...

4-ヒドロキシ タモキシフェン-依存性エストロゲン受容体 α リガンド結合ドメイン二量体化アクティビティ哺乳類の 2 つのハイブリッド試金を使用しての解析法を提案します。

Estrogen receptor alpha (ER&#945;) is an estrogenic ligand-dependent transcription regulator. The sequence of ER&#945; protein is highly conserved among ...

したがって、この方法は、エストロゲン受容体αを調節するエストロゲンリガンドの能力と選択的エストロゲン受容体モジュレーターのメカニズムに関する重要な質問に答えることができます。この手法の主な利点は、単純な方法です。細胞内のリガンド依存性エストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン二量体化活性を示す。手順をデモンストレーションするタナー・ジェファーソン、私たちのグループのポスドクの学生になります。この方法は、細胞内のエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン二量体化活性を検出するために3つの異なるプラスミドを使用する。pG5-Lucは、二量体化活性の有効性を検出するためのルシファーゼレポータープラスミドである。pBINDマウスエストロゲン受容体αEFは、pG5-Lucレポーター上のGAL4応答性要素に結合する主融合マウスのエストロゲンαリガンド結合ドメイン発現プラスミドに結合するガラクトース応答性転写因子GAL4 DNAである。pACTマウスエストロゲン受容体αEFは、pG5-Lucレポーターに直接結合しないマウスエストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン発現プラスミドを融合した単純なウイルストランスアクティベートセグメントタンパク質VP16活性化ドメインである。適切なリガンドが存在する場合、pBINDマウスエストロゲン受容体αEFおよびpACTマウスエストロゲン受容体αEFプラスミド由来のタンパク質は、エストロゲン受容体αリガンド結合ドメインを介して結合する。二量体化の効率は、ルシファーゼ活性によって決定される。最も重要なステップは、pBINDマウスエストロゲン受容体αEF由来タンパク質の活性を制御することである。pACTエストロゲン受容体を含まない各リガンドにおけるpBIND由来エストロゲン受容体αリガンド結合ドメインの活性は、リガンド依存性エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン二量体化活性を分析する前に評価しなければならない。適切なプラスミドの組み合わせを、組み合わせごとに2つの1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに追加します。DNA混合物の2つの組み合わせを準備します。第1の管は、pG5-Luc、pBIND-エストロゲン受容体-αEF、および空のpACTプラスミドを含む。第2の管は、pG5-Luc、pBIND-エストロゲン受容体-αEF、およびpACT-エストロゲン受容体-αEFプラスミドを含む。DNAを沈殿させるために、3つの酢酸モルナトリウムのDNA混合物体積の1/9と20X3酢酸ナトリウム100%エタノールの3倍の大臼歯ナトリウムを各チューブおよび渦管のDNA混合物に加える。翌朝の最高速度で遠心分離機を行う前に、一晩摂氏20度で混合物を保管してください。上澄み液を捨て、チューブあたり75%エタノールの120マイクロリットルで目に見えないペレットを再中断し、チューブの内側に付着したDNAをすすいでください。同じ条件で2回目の遠心分離を行った後、上清を捨てて、真空濃縮器でDNAを30分間乾燥させます。トランスフェクションでは、調製したヒト肝細胞癌細胞を1回の洗浄1回あたり0.5ミリリットルの室温PBSで2回洗浄し、10%炭除去熱不活化ウシシ血清および2ミリモルL-グルタミンを補った新鮮な37度のフェノール赤自由MEMの0.5ミリリットルで細胞を供給する。次に、乾燥プラスミドDNA混合物およびトランスフェクション試薬を、個々の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管内のウェル数当たりの適切な量のDMEMで懸濁液。各DMEM懸濁プラスミドDNA混合物チューブに等量のトランスフェクション試薬培地を加える。室温で5〜10分間のインキュベーションの後、24ウェルヒト肝細胞癌細胞培養プレートの適切な実験井戸に25マイクロリットルのDNA混合物を加え、細胞培養インキュベーターで6時間のトランスフェクションを行う。そして、インキュベーションの終わりは、10%の炭を取り除いた熱不活性化FBS、2ミリモルLグルタミン、1%ペニシリンストレプトマイシン、およびリガンドを18時間に細胞培養インキュベーターに戻した新鮮な37°Cフェノール赤自由MEMの0.5ミリリットルでトランスフェクション培地を交換し、細胞を18時間に戻す。翌朝、細胞を井戸1回につき1ミリリットルのPBSで洗い、各ウェルから100マイクロリットルの受動的な溶菌バッファーをボルテックスミキサーで激しく揺れ動かして細胞を取り付けます。その後、液体窒素中の細胞ライセートを凍結します。二重ルシファーゼアッセイの日に、プレートが室温に達するまでシェーカーでライセートを振り、96ウェルの白いプラスチック板の個々の井戸に10マイクロリットルのライセートを移します。次に、マイクロプレートリーダー上の各細胞ライセートサンプルのルシファーゼ活性を読み取る。pBINDマウスエストロゲン受容体αEFおよびpACTプラスミドの治療は、10ナノモルエストラジオールを有するトランスフェクト細胞を刺激し、エストロゲン受容体αリガンド結合ドメインがリガンド依存性トランス活性化機能ドメインであるAF-2を含有するようにルシファーゼ活性を刺激する。しかし、1および10ナノモル濃度は、pBINDおよびpACTマウスエストロゲン受容体αEFプラスミドの組み合わせでトランスフェクトされた細胞におけるルシファーゼ活性を誘導し、エストラジオール治療のナノモル1ナノモルでエストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン二量体化活性を評価するためのこの手順の実現可能性を示唆している。4-ヒドロキシタモキシフェンによる治療は、pBINDマウスエストロゲン受容体αEFおよびpACTプラスミドトランスフェクション細胞におけるルシファーゼ活性を惹起せず、エストロゲン受容体αのAF-2機能がこのリガンドによって活性化されないことを示唆している。しかし、最大10ナノモル濃度は、pBINDおよびpACTマウスエストロゲン受容体αEFプラスミドの組み合わせでトランスフェクトされた細胞中のルシファーゼ活性を誘導し、この手順は、4-ヒドロキシタモキシフェン処理の最大10ナノモルでエストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン二量体化活性を評価するために実現可能であることを示唆している。pBINDとpACTマウスの組み合わせから4-ヒドロキシタモキシフェンとの発現プラスミドのエストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン発現プラスミドは、pBINDとpACTヒトエストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン発現プラスミドの組み合わせよりも有意に高い。これは、マウスエストロゲン受容体αリガンド結合ドメインの4-ヒドロキシタモキシフェン依存性ホモジマー化活性がヒトエストロゲン受容体αリガンド結合ドメインよりも強力であることを示している。また、ヒトFドメインを含むマウスエストロゲン受容体αリガンド結合ドメインの4-ヒドロキシタモキシフェン依存性ホモジマー化活性は、野生型マウスのエストロゲン受容体αリガンド結合ドメインのそれよりも有意に低い。これに対し、マウスFドメインを含むヒトエストロゲン受容体αリガンド結合ドメインの4-ヒドロキシタモキシフェン依存性ホモジマー化活性は、野生型ヒトエストロゲン受容体αリガンド結合ドメインのそれよりも有意に高い。これは、Fドメインが種特異的な4-ヒドロキシタモキシフェン依存性エストロゲン受容体αリガンド結合ドメインホモメーラ化活性に影響を及ぼすことを示唆している。この手順を試みている間に、 GAL4 DNA結合ドメインの基底活性をテストすることが重要です エストロゲン受容体αリガンド結合ドメイン活性をリガンドと結合.その活動は、車両の治療と同じである必要があります。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオでは、植物由来化合物のエストロゲン活性を決定するための細胞ベースのレポーターアッセイについて説明しています。エストロゲン様活性を持つ化合物は、エストロゲン受容体への結合を模倣し、下流のレポーター酵素遺伝子転写を促進します。レポーター酵素は反応で生物発光を生成し、化合物のエストロゲン活性を示します。...

植物性エストロゲン活性をスクリーニングするためのエストロゲン受容体-レポーター活性アッセイ

ケトコナゾールに結合し、プレグナンX受容体（PXR）の活性化に拮抗する。 PXR変異体の酵母ハイスループットスクリーニングは、ケトコナゾールが結合するための独自の領域を規定する。この酵母ベースの遺伝的方法は、表面結合部位と会合したリガンドを有する新規な核内受容体相互作用を検出します。...

相互作用するリガンドおよび/またはアンタゴニストと、哺乳動物核内受容体残基を同定するために逆酵母ツーハイブリッドシステム

エストロゲンとマイクロRNAの両方を介したシグナル伝達分子は、乳がんの発展と成長において重要である。エストロゲンは転写因子であるエストロゲン受容体を活性化する。多くの転写因子は、マイクロRNAの発現を調節することができ、エストロゲン調節マイクロRNAは、異なる大規模な技術を用いてプロファイリングすることができる。...

乳癌細胞におけるエストロゲン調節マイクロRNAのプロファイリング

このプロトコルは、COS7線維芽細胞上の上皮成長因子受容体(EGFR)の標識と、その後の水和状態の全細胞の相関光顕微鏡と電子顕微鏡法について説明しています。ラベルには蛍光量子ドットが含まれていました。このプロトコルは、EGFRの化学量論を単一分子レベルで研究するために使用できます。...

相関顕微鏡を用いて、無傷の細胞における上皮成長因子受容体の化学量論を学びます

この記事では、パーソナルケア製品 (PCPs) エストロゲン受容体 α (ERα) および/またはベータ版 (ERβ) を結合するリガンドを定量化するための最適化された酵母エストロゲン画面を示します。メソッドには、2 つの比色基板オプション、学部コースで使用するため 6...

学部の教育研究所の酵母エストロゲンの画面に最適化されたを使用して個人的な心配プロダクトのエストロゲンのリガンドを検出

ここでは、近接結紮の試金 (PLA) を使用して感度が高い固定細胞における MST1/MST2 heterodimerization...

その場で近接結紮アッセイを用いたタンパク質アイソ フォームの Heterodimerization の検出

任意の与えられた低分子リガンドに対して所望の親和性および特異性を有する化学的に誘導されたタンパク質二量体化システムを作成することは、多くの生物学的センシングおよび作動アプリケーションを有するであろう。ここでは、ファージディスプレイコンビナトリアル単一ドメイン抗体ライブラリーの段階的選択を介した化学的に誘導された二量体化システムのde...

組み合わせ単一ドメイン抗体ライブラリーの段階的ファージ選択による高特異的化学的誘起タンパク質二量体化システムの作成

市販のエストロゲン受容体βレポーターアッセイを最適化し、エストロゲン活性に対するヒトおよび非ヒト霊長類食品をスクリーニングしています。我々は、既知のエストロゲンヒト食品大豆が高く登録されているのに対し、他の食品は活性を示さないことを示すことによって、このアッセイを検証した。...

レポーターアッセイによる細胞ベースのエストロゲン受容体β使用したフィトエストロゲンのスクリーニング

この場合の単一分子RNA蛍光蛍光(smFISH)は、単一細胞レベルで特異的なRNAのレベルおよび局在を正確に定量する方法です。ここでは、特定のRNAの単一細胞定量化のためのウェットベンチ処理、イメージングおよび画像解析のための検証済みのラボプロトコルを報告します。...

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

新規抗HER2モノクローナル抗体を用いた検証済みのサンドイッチELISAアッセイを紹介します。このアッセイにより、 in vitro...

細胞から放出され細胞に結合したヒト上皮成長因子受容体2の包括的な測定のための検証済み免疫化学アッセイ

学ぶ哺乳類2ハイブリッド法によるエストロゲン受容体αリガンド結合ドメインの二量体化活性解析。ルシフェラーゼレポーターを用いた細胞ベースアッセイで、選択的エストロゲン受容体調節薬の作用機序を解明する簡便な手法です。

哺乳類 2 ハイブリッド法によるエストロゲン受容体 α リガンド結合ドメインの二量体化活性の検出

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