Name: 生体外でマウス縁帯 B 細胞のせん断流動誘起移行の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 学ぶマウス縁帯B細胞のせん断流動誘起移行解析法。ICAM-1コーティングフロースライドと顕微鏡イメージングを用いて免疫細胞動態を可視化し、細胞移動パターンを自動追跡します。初心者にも実施可能な免疫学研究手法です。

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<ol><li>Alon, R., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cells+on+the+run%3A+shear-regulated+integrin+activation+in+leukocyte+rolling+and+arrest+on+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells.</a> Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).</li>
<li>Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+direction+of+migration+of+T-lymphocytes+under+flow+depends+upon+which+adhesion+receptors+are+engaged%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">The direction of migration of T-lymphocytes under flow depends upon which adhesion receptors are engaged.</a> Integrative Biology (Cambridge). 7 (3), 345-355 (2015).</li>
<li>Steiner, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+for+endothelial+ICAM-1%2C+ICAM-2%2C+and+VCAM-1+in+shear-resistant+T+cell+arrest%2C+polarization%2C+and+directed+crawling+on+blood-brain+barrier+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Differential roles for endothelial ICAM-1, ICAM-2, and VCAM-1 in shear-resistant T cell arrest, polarization, and directed crawling on blood-brain barrier endothelium.</a> Journal of Immunology. 185 (8), 4846-4855 (2010).</li>
<li>Valignat, M. P., Theodoly, O., Gucciardi, A., Hogg, N., Lellouch, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+lymphocytes+orient+against+the+direction+of+fluid+flow+during+LFA-1-mediated+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">T lymphocytes orient against the direction of fluid flow during LFA-1-mediated migration.</a> Biophysical Journal. 104 (2), 322-331 (2013).</li>
<li>Woolf, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+node+chemokines+promote+sustained+T+lymphocyte+motility+without+triggering+stable+integrin+adhesiveness+in+the+absence+of+shear+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces.</a> Nature Immunology. 8 (10), 1076-1085 (2007).</li>
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<li>Cyster, J. G., Schwab, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine-1-phosphate+and+lymphocyte+egress+from+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Sphingosine-1-phosphate and lymphocyte egress from lymphoid organs.</a> Annual Reviews in Immunology. 30, 69-94 (2012).</li>
<li>Schwab, S. R., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+way+out%3A+lymphocyte+egress+from+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Finding a way out: lymphocyte egress from lymphoid organs.</a> Nature Immunology. 8 (12), 1295-1301 (2007).</li>
<li>Cerutti, A., Cols, M., Puga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marginal+zone+B+cells%3A+virtues+of+innate-like+antibody-producing+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Marginal zone B cells: virtues of innate-like antibody-producing lymphocytes.</a> Nature Reviews Immunology. 13 (2), 118-132 (2013).</li>
<li>Mebius, R. E., Kraal, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+the+spleen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Structure and function of the spleen.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (8), 606-616 (2005).</li>
<li>Tedford, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+opposing+forces+of+shear+flow+and+sphingosine-1-phosphate+control+marginal+zone+B+cell+shuttling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The opposing forces of shear flow and sphingosine-1-phosphate control marginal zone B cell shuttling.</a> Nature Communications. 8 (1), 2261(2017).</li>
<li>ImageJ. MTrack2. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/MTrack2">https://imagej.net/MTrack2</a> (2018).</li>
<li>MTrack2. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html">https://valelab4.ucsf.edu/~nstuurman/IJplugins/MTrack2.html</a> (2018).</li>
<li>ibidi. Chemotaxis and Migration Tool. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html">https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html</a> (2018).</li>
<li>Reeves, J. P., Reeves, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+lymphoid+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Removal of lymphoid organs.</a> Current Protocols in Immunology. , Chapter 1 (Unit 1.9) (2001).</li>
<li>ImageJ. Manual Tracking. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html">https://imagej.nih.gov/ij/plugins/manual-tracking.html</a> (2018).</li>
<li>ibidi. ibidi Pump System. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html. ">https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html. </a> (2018).</li>
</ol>

著者はある利益相反を開示します。

せん断流の力を検出し、その移行を変えることによって反応する細胞の移動を分析するための方法をご紹介します。MZBs の分析は示した MZBs が ICAM 1、フローの存在下で自発的に移行、流れに移行されます。我々 の以前の仕事では、MZBs は VCAM 1 の流れを移行しないが、代わりに場所は固定されたままを示した。マウスの脾辺縁帯には、赤脾髄には、icam-1 および VCAM 1 が含まれていますがの ICAM-1 主に含まれています。これらのデータから MZBs 赤脾髄ではなく辺縁帯にしながら流れを移行することを推論することができます。分析は、体内の MZBs を用いた欠陥接着をした: 脾臓の赤脾髄に流れ12の力によって検証されました。これらの理由から、MZBs はシステムを使用して別のセル型研究する場合も、ここで説明した流れ移行システムをテストするための良い肯定的な制御を表します。
プロシージャの最も重要な側面は、スライドの処理セルの一貫性を確保します。細胞移動の定量化可能な側面は、セルがスライドに準拠する度に依存しているた...

免疫細胞は人間の体内で最も運動性細胞、しばしば血液とリンパの流れからのせん断力と争わなければなりません。ただし、白血球1,2,3,4、5のせん断力による移動の研究は比較的少ないがあります。流れ体外への免疫細胞の応答を分析するための信頼のおける定量的プロトコルをご紹介します。アッセイを実行してもコンポーネントの作製が必要ありませんし、市販されているすべての機器および消耗品。1 日で細胞の浄化、移行の分析など、プロトコルを実行できます。最後に、辺縁帯 B 細胞 (MZBs) の移行を説明するがプロトコルを適応免疫細胞の他のタイプの流れに対して移行を分析することができます。したがって、この試金を使用して、条件の包括的なパネルと白血球の広い範囲を体系的に分析することは不可能です。
MZBs は、マウスの脾臓とシャトルでのみ発見されている B 細胞の人口卵胞の内部とマージナル ゾーン6,7,8,9間。辺縁帯厚約 5-10 の免疫細胞細胞の層であります。細胞層卵胞を包んで、10に、MZBs とマクロファージが、また不変の自然なキラー T (iNKT) 細胞、樹状細胞 (Dc) および他の中の好中球を主に成っています。辺縁帯の細胞は、卵胞周囲辺縁洞で終了している脾動脈から発生した単方向血流にさらされています。血辺縁帯を通じて縁洞の穴から流れるは赤脾静脈洞で収集し、11循環に復元します。血液の流動、MZBs を洗うし、血で運ばれる抗原にそれらを公開します。MZBs は、自動的に血液にさらされない卵胞の内側と辺縁帯間の往復で卵胞に抗原を運ぶ。したがって、MZBs へシャトルバス卵胞、として血流12 (図 1 a) せん断力を移行する必要があります。
このプロトコルでは定量的免疫細胞など MZBs がない流れまたは生体外で高流量に対応方法を決定する方法について述べる、明らかにどのようにするためにプログラムの体内に移行します。最初のステップで MZBs は市販のキットからの抗体に結合した磁気ビーズを用いたマウス脾臓から浄化されます。新鮮単離の MZBs が流れチェンバー スライドのウェルに導入、インテグリンのリガンド、着地させて、ポンプ システム (図 2 a) を使用して移行バッファーの流れにさらされています。セルは、タイムラプス ビデオ顕微鏡システムを使用して作成されます。無料の ImageJ のプラグイン、MTrack213,14、自動的にセルを追跡する分析のため、画像が処理されます。トラックは、速度、真直度、マイグレーション インデックスなど様々 なパラメーターを決定する無料 Ibidi 走化性ツール15定量化することができます。これらの値は、体内の免疫細胞の動きを制御する力を理解するためにせん断流移行に関する移行阻害剤、細胞刺激、ケモカイン、および他の移行に影響を与える化学物質の影響を決定する使用できます。

<table><tbody><tr><td>VWRセルストレーナー、70&マイクロ;m</td><td>VWR</td><td>10199-656</td><td></td></tr><tr><td>プレセパレーションフィルター、30 & マイクロ;m</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>MZBおよびFOB細胞分離キット</td><td>Miltenyi</td><td>130-100-366</td><td></td></tr><tr><td>B220 CD45R、クローンRA3-6B2、FITC</td><td>Biolegend</td><td>103206</td><td></td></tr><tr><td>CD21 / CD 35、クローン7G6、APC</td><td>BD Biosciences 558658</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD23、クローンB3B4、PE</td><td>Biolegend</td><td>101608</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Biochrom</td><td>L2035</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS 1x</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>BSA アルブミン画分V、脂肪酸フリー</td><td>Roth</td><td>"0052.3"</td><td></td></tr><tr><td>ICAM-1</td><td>R&Dシステム</td><td>796-IC-050</td><td></td></tr><tr><td>イビディ &マイクロスライド VI 0.4、疎水性、コーティングされていない</td><td>イビディ</td><td>80601</td><td></td></tr><tr><td>灌流セット、白、50 cm、0.8 mm</td><td>イビディ</td><td>10963</td><td></td></tr><tr><td>イビディポンプシステム</td><td>イビディ</td><td>10902</td><td></td></tr></tbody></table>

生体外でマウス縁帯 b 細胞のせん断流動誘起移行の解析

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

辺縁帯 B 細胞 (MZBs) は、卵胞を包むマウス脾辺縁ゾーンに存在する B 細胞の人口です。卵胞に到達、MZBs は血流のせん断力を移行する必要があります。この流動誘起 MZB 移行を体外の解析方法をご紹介します。まず、MZBs はマウスの脾臓から分離されます。第二に、MZBs はフロー チャンバー スライドでインテグリンのリガンドに定住、せん断流れに公開され、移行中の顕微鏡イメージを作成します。第三に、MTrack2 の自動細胞 ImageJ、トラッキングのプラグインを使用して移行の MZBs のイメージを処理して結果セル トラックが Ibidi 走化性ツールを使用して量を示されます。移行データは、セルがどのように高速移動、どのくらいの頻度彼らは方向を変更、かどうかせん断流動ベクトルに影響、その移行の方向、どのインテグリンのリガンドが関与しているを明らかにします。我々 は、MZBs を使用して、メソッド簡単にせん断流の力に反応する白血球の移行を分析するために適応できます。

ICAM 1 コーティング スライド (0 dyn/cm2) の流れのない MZBs の移行を比較する上記プロトコルを使用し、せん断流れ (4 ディン/cm2) にさらされます。セルは、フローはありません (0 dyn/cm2) と (4 ディン/cm2) 分布を示すことの細胞移行映画、トラック (図 4 a) の形で MTrack2、およびファイルが覆われた結果の追跡で自動的に追跡されました。セル トラック トラック (図 4 b) 各ムービーのプロットを生成する Ibidi 走化性ツール (ICT) にインポートされました。平均移行インデックス (ICT で"FMIy"と呼ばれる)、速度、真直度 (ICT で「率直さ」と呼ばれる)、およびセルで計算された各両方の条件 4 映画からトラックの直線距離 (ICT で「ユークリッド距離」と呼ばれる)、走化性ツール「測定値...

辺縁帯 B 細胞 (MZBs) は、流れを自分の移行パスを再定位せん断流の力に対応します。このプロトコルは、記録し、流体工学ユニット、ポンプ、顕微鏡イメージング システム、フリー ソフトウェアを使用して移行を分析する方法を示しています。

生体外でマウス縁帯 B 細胞のせん断流動誘起移行の解析

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...

この方法は、細胞骨格がせん断力を送る方法や、インテグリンリガンドとケモカインが白血球のフロー誘発性移動にどのような影響を与えるかなど、免疫細胞移行分野の重要な質問を理解するのに役立ちます。この手法の主な利点は、初心者が実行しやすい新しいタイプの移行アッセイです。市販の機器や試薬、フリーソフトウェアのみを使用しています。この方法は、周辺ゾーンB細胞に関する洞察を提供することができるが、活性化されたT細胞などの他の免疫細胞にも適用することができる。実験の前日に、ICAM-1のアリコートを解凍し、PBSで1ミリリットル当たり5マイクログラムの最終濃度に希釈する。次に、フロースライドの所望のチャンバーにICAM-1の30マイクロリットルを加えます。スライドを湿気の多いチャンバーに入れ、摂氏4度に設定して一晩インキュベートします。翌日、1ウェルに100マイクロリットルのPBSを加えてチャンバーを洗浄し、チャンバーの他のウェルから100マイクロリットルを引き出します。次いで、100マイクロリットルのブロッキングバッファーをチャンバーに加え、室温で湿度の高いチャンバーにスライドを90分間インキュベートする。次に、1つの井戸に100マイクロリットルのPBSを加えてチャンバーを洗浄し、もう一方の井戸から引き出し、100マイクロリットルの移動バッファーをチャンバーに加えます。スライドを使用する準備ができました。実験まで室温で湿気の多いチャンバーに保管してください。まず、流体ポンプを差し込み、流体ユニットを取り付けます。次に、ポンプソフトウェアをオンにします。次に、5~10ミリリットルの移行バッファーでチューブを1回洗います。これには約1分かかります。次に、両方の貯留槽に11.7ミリリットルの移動バッファーを均等に加え、気泡を取り除きます。さて、コネクタ片からチューブを約10センチメートルクランプし、加熱されたインキュベーションチャンバーに流体ユニットを顕微鏡に置きます。ソフトウェアでは、スライドの選択をマイクロスライドVI 0.4に、チューブオプションを白に設定します。また、所望のせん断応力を1平方センチメートルあたり約4ダイン、イメージング時間を30分に設定します。次に、ポンプソフトウェアに値を入力して、所望の流量とせん断応力を設定します。次に、顕微鏡インキュベーションチャンバー、流体ユニット、および移動バッファーアリコートを摂氏37度に予め温める。ウォームが加わったら、流体ポンプをテストし、移動バッファが貯水池を行ったり来たりして、システムに気泡がないことを確認します。まず、白血球を単離し、付随するテキストプロトコルに記載されているように、限界領域B細胞を浄化する。次に、エタノールを湿らせた組織でスライドの底部を洗浄します。30マイクロリットルのセル懸濁液をチャンバの1つのウェルに加え、貯めた移動バッファーの30マイクロリットルを他方の井戸から引き出す。スライドを覆い、30分間インキュベートして細胞を取り付けます。次に、正の半月板が井戸から上がるまで、スライドの各ウェルに温め込まれた移行バッファをゆっくりと追加します。ピペットチップで気泡を取り除きます。細胞接着に影響を与える因子との一貫性を保つことが重要ですので、バッファーと細胞を37度に保ち、バッファーをチャンバにピペットする際には過度の力を使わないようにしてください。スライドを顕微鏡ステージにクランプし、滑らかなチューブの無印の側面をコネクタから取り外します。その後、気泡のない正の半月板が終わりから上がるまで、チューブの端を移動バッファで満たします。チューブの端を裏返し、フローチャンバーの上部ウェルに挿入します。チューブをクランプしたまま、チューブのマークされた端に対して手順を繰り返します。次に、イメージングシステムをライブモードに切り替え、スライドの中央にある視野を選択します。ここでは、細胞に焦点を当て、その後、細胞の黒い輪郭を強化し、白い内部を生成するためにわずかに焦点を外します。黒の背景と白の中央は、自動追跡プログラムで使いやすくなります。10xドライ目的を使用して、5秒ごとに1つの画像を30分間記録するようにイメージングシーケンスプログラムを設定します。次に、録音を開始します。チューブからクランプを取り外し、ポンプをオンにします。これにより、非接着性細胞が洗い流され、接着細胞が移行を開始します。イメージングプログラムの最後に、ムービーにラベルを付けて保存します。細胞遊動の阻害剤または修飾剤を使用する場合、スライドに置く前に細胞懸濁液中の細胞または流体ユニットのマイグレーションバッファに追加することができる。自動移行トラック分析を開始するには、ImageJ プログラムを開きます。MTrack2_ktの Java ファイルを ImageJ プラグイン フォルダーにコピーします。[プラグイン] メニューの [コンパイルして実行] を選択します。次に、ImageJ を再起動すると、プラグインがプラグインメニューに表示されます。ImageJ でセルマイグレーションムービーからイメージスタックを開き、画像をカラーフレームから白い背景上の黒いオブジェクトとして表示するハイコントラスト画像に変換するために、ここに示すようにイメージを処理します。次に、画像を 2 回シャープにし、イメージをデスペクするイメージを 8 ビットに変換します。[イメージ] メニューの [明るさ/コントラストの調整] サブメニューに移動し、[コントラスト] スライダを最大コントラストにします。これにより、黒い背景に白いオブジェクトとして表示されます。次に、[閾値の調整] サブメニューに戻り、白い背景に黒のオブジェクトとして表示されるようにします。次に、自動セル追跡プラグイン MTrack2 kt を実行します。オプション画面で、パーティクルサイズの最小値を 1 ピクセルに、最大 30 ピクセルに設定します。速度値を 10 ピクセルに設定しますが、周辺ゾーン B セルは通常、5 秒間隔の連続したフレームでは 2 ピクセルを超えないでしょう。セルトラックは、ibidi Chemotaxis ツールを使用して解析できるようになりました。これら 2 つのフィールドは、ICAM-1 コーティング スライドにシードされた限界ゾーン B 細胞の移動経路を示します。この資料で説明した方法を使用して、セルを MTrack2 で自動的に追跡しました。左側では、細胞を静的な条件下で画像化し、右側の細胞に4つのダイン/平方センチメートルのせん断流を浴びせた。個々のセルトラックを ibidi Chemotaxis ツールに読み込み、各ムービーのトラックプロットを生成することができます。ここでは、個々のセルトラックが赤で色付けされ、原点の下流で終了したことを示し、上流に終わった場合は黒色になります。フロー条件とフロー条件の両方について、4つの個別のムービーのセルトラックの解析を次に示します。これには、両方の条件の平均方向移動インデックス、セル速度、パスの直線性、および最終直線距離が含まれます。このビデオを見た後、シアーフローに向かって限界ゾーンB細胞の方向移動をイメージする方法と、セルを自動的に追跡する方法を理解する必要があります。この手順の間に、TIRF顕微鏡のような他の方法は、細胞骨格およびインテグリンがせん断応力にどのように反応するかのような追加の質問に答えるために行うことができるか。

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Immunology and Infection

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ここでは、フローサイトメトリーによる腹膜、脾臓、および骨髄組織におけるマウス免疫B細胞区画の不均一性の単純な分析について説明する。プロトコルは、他のマウス組織に適応し、拡張することができます。...

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生体外でマウス縁帯 B 細胞のせん断流動誘起移行の解析

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