Name: 原核生物と真核生物の化学形態分析走査電子顕微鏡 (SEM) での乾燥の準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 学ぶ化学乾燥法を用いた原核生物と真核生物のSEM試料調製法。シアノバクテリア、ユーグレナ類、Drosophila melanogasterの形態学的特徴を詳細に可視化し、専門的乾燥機器を不要とする実用的なプロトコルを提供する。

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この作品は研究局、セントラル ミシガン大学大学院研究から MAK に MLS と夏学者賞の助成金によって賄われていた。シアノ バクテリアは、沿岸域、テキサス A & M 大学コーパスクリスティの Zimba とプランクトン研究室、センターの一部によって供給されました。Euglenoids は、Triemer の実験室、ミシガン州立大学によって供給されました。

1. 準備と固定
<ol><li>シアノ バクテリアを準備します。<ol>
<li>14:10 h に 28 ° C の温度で F/2 メディア24,25 unialgal 文化を成長ライト暗い周期。後 15 分を解決するを許可すると、細菌のペレットがサイズで約 0.05 mL、1.5 mL 遠心チューブに十分な文化を転送します。メディアを取り出し、1.5 ml (1.25% グルタルアルデヒド、0.1 M のリン酸バッファー pH 7.0) は定着剤の交換、優しく数回を反転、4 ° C で一晩インキュベート</li>
		<li>セルのサイズによって、0.8 または 0.2 μ m 孔を持つポリカーボネートの 25 mm フィルターを含むガラス ピペット 10 mL ろ過装置 (図 1) に、固定セルを転送します。側の腕を密封し、ファンネルの文化を含むゴム製ス トッパーと漏斗します。両方のストッパーを削除した後穏やかな真空ろ過フラスコに定着剤を削除します。 注: ポリカーボネート フィルターの細胞密度が最適でない場合使用されるカルチャを開始する量を調整します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>単細胞藻類 (euglenoids) を準備します。<ol>
<li>AF 6 メディア26 14:10 h に 22 の ° C の温度で、メディアに追加市販土壌水分中の 150 mL L-1 unialgal 文化を育てる光暗いサイクル。低密度の 2 mL を転送 (外径600 < 0.5) ガラス製ピペット 10 mL ろ過装置 (図 1) に 8 μ m の細孔を有するポリカーボネートの 25 mm フィルターを含む文化。側の腕を密封し、ファンネルの文化を含むゴム製ス トッパーと漏斗します。 注: ポリカーボネート フィルターの細胞密度が最適でない場合使用されるカルチャを開始する量を調整します。</li>
		<li>文化に直接 4% 四酸化オスミウム (OsO4) の 3 滴を追加し、インキュベート 30 分両方のストッパーを削除した後穏やかな真空ろ過フラスコに定着剤を削除することができます。 注: OsO4は急性の毒素 (皮膚、口腔と吸入ルート)、目および呼吸器感作性にダメージを与える、皮膚を腐食。OsO4は、手袋、白衣、眼の保護など適切な個人用保護具を使用して化学の発煙のフード処理必要があります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ショウジョウバエ(ミバエ)23を準備します。<ol>
<li>100% の二酸化炭素を使用して成虫を麻酔します。場所は、大人 (10 に 30 ハエ) 小さなプラスチック スクリュー キャップ バイアルまたは 1.5 mL 遠心管中を麻酔しました。</li>
		<li>4 ° C で 1 ml 2 h (または夜通し) 漬けます (1.25% グルタルアルデヒド、0.1 M のリン酸バッファー pH 7.2) の麻酔のハエを浸すハエは定着剤の表面に浮かぶ場合、は、組織の合計浸漬を可能にする固定液の表面張力を弱めるため 2.5% ポリエチレング リコール tert-オクチルフェニル エーテルを数滴を追加します。ガラス ピペットを使用して定着剤を削除します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 洗濯・脱水
<ol><li>洗って、シアノ バクテリアを脱水します。<ol>
<li>0.1 M リン酸バッファー pH 7.0 10 min. の室温で 5 mL で 3 回固定サンプルを洗います。フラスコと漏斗栓洗浄を保持するために維持します。両方のストッパーを削除した後、穏やかな真空ろ過フラスコで各洗浄を削除します。</li>
		<li>目標到達プロセスの 5 mL の量で 10 分間傾斜エタノール シリーズを使用して連続浸漬を維持しながらサンプルを脱水します。傾斜エタノール濃度: 25%、50%、75%、95%、100% のエタノールの 2 つの変更。両方経由でフラスコと漏斗に損失を防止する漏斗にエタノールを含んでいる栓を保つ蒸発とパッシブ フィルターを通過。</li>
		<li>穏やかな真空ろ過フラスコにエタノールを両方のストッパーを削除した後削除します。フィルター/サンプルを乾燥する前にサンプルをカバーするだけの十分な 100% エタノールを含んでいる皿の重量を量る使い捨てアルミに転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>洗って、単細胞藻類 (euglenoids) を脱水します。<ol>
<li>10 分の室温で 5 mL の脱イオン水を使用して 3 回固定サンプルを洗ってください。フラスコと漏斗漏斗で洗浄を含む栓をしてください。両方のストッパーを削除した後、穏やかな真空ろ過フラスコで各洗浄を削除します。</li>
		<li>目標到達プロセスの 5 mL の量で 10 分間傾斜エタノール シリーズを使用して連続浸漬を維持しながらサンプルを脱水します。傾斜エタノール濃度: 25%、50%、75%、95%、100% のエタノールの 2 つの変更。両方経由でフラスコと漏斗に損失を防止する漏斗にエタノールを含んでいる栓を保つ蒸発とパッシブ フィルターを通過。</li>
		<li>穏やかな真空ろ過フラスコにエタノールを両方のストッパーを削除した後削除します。フィルター/サンプルを乾燥する前にサンプルをカバーするだけの十分な 100% エタノールを含んでいる皿の重量を量る使い捨てアルミに転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>洗いし、脱水ショウジョウバエ(ミバエ)。<ol>
<li>1.5 mL 遠心チューブに 0.1 M リン酸バッファー pH 7.2 10 分室温で 1 mL で 3 回固定サンプルを洗います。ハエを削除しないように注意されているガラス ピペットで各洗浄を削除します。</li>
		<li>および microfuge の管に 1 mL の量で 10 分間傾斜エタノール シリーズを使用してサンプルを脱水します。エタノール濃度: 25%、50%、75%、80%、95%、100%。ハエを削除しないように注意されているガラス ピペットでエタノールを削除します。</li>
		<li>乾燥する前にサンプルをカバーするだけの十分な 100% エタノールで 1.5 mL 遠心チューブにサンプルを保持します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 乾燥
<ol><li>T-ブチル アルコール (TBA)27を使用して化学乾燥を実行します。<ol>
<li>100% エタノール溶液を 20 分 20 分 100% 未定で 1:1 ソリューションを二度繰り返し置換未定と 100% エタノールの 1:1 のソリューションに置き換えます。未定が凍結しないように、37 ° C でのソリューションを保持します。 注: 100% 未定は 25.5 ° C の凍結ポイント1:1 の解決策は、室温では停止しません。未定は可燃性、眼に対する重篤な炎症の原因、吸入した場合有害である、めまいや眠気、呼吸器の炎症を引き起こす可能性があります。未定は、手袋、白衣、眼の保護など適切な個人用保護具を使用して化学の発煙のフード処理必要があります。</li>
		<li>使い捨てアルミ皿の重さに 1.5 mL 遠心チューブの場合は未定でサンプルを転送します。一度アルミ計量皿、未定を削除し、サンプルをカバーするだけの十分な新鮮な 100% 未定で置き換えます。10 分の 4 ° C で TBA を凍結します。</li>
		<li>未定凍結を保つために冷凍ジェル パックの真空デシケータ (ベルジャー) に転送します。避難し、少なくとも 3 時間冷凍未定の真空昇華乾燥または一晩にサンプルを許可するロータリー ポンプと真空を維持します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ヘキサメチルジシラザン (HMDS)20を使用して化学乾燥を実行します。<ol>
<li>HMD の 1:2 の溶液で 100% エタノール溶液を交換して、100% のエタノール 20 分の HMD の 2:1 の溶液で 1:2 ソリューションを置き換えるし、100% のエタノール 20 分の 2:1 の交換により、100 %20 分 HMD をもう一度繰り返します。 注: HMDS は可燃性と急性毒素 (皮膚ルートです)。HMD は、手袋、白衣、眼の保護など適切な個人用保護具を使用して化学の発煙のフード処理必要があります。</li>
		<li>1.5 mL 遠心チューブの場合使い捨てアルミ皿の重さに HMD でサンプルを転送します。アルミ 100% を置き換える計量皿、一度 HMD だけで十分な新鮮な 100% のサンプルをカバーする HMD。</li>
		<li>新鮮な乾燥剤 (5-6 cm) をプラスチックやガラス、非真空デシケータにサンプルを転送し、化学の発煙のフードで配置。また、サンプルの上に落ちてから破片を防ぐために、ボックスなどの緩やかなふた付け乾燥させる化学発煙のフードに直接サンプルを配置します。12 ~ 24 時間乾燥するサンプルを許可します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 取付
<ol><li>シアノ バクテリアと euglenoids をマウントします。<ol>
<li>何が上に配置されていることを示すようにスタブをマウント 12 または 25 mm のアルミニウムの下部にラベルを付けます。12 mm スタブを使用して場合、きれいなかみそり刃またはメスの四分の一にカット乾燥細胞ポリカーボネート フィルターまたは 25 mm スタブを使用して場合、全体のフィルターを配置します。</li>
		<li>接着剤またはスタブの上部に固定されている炭素接着] タブで各フィルターを配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>マウントショウジョウバエ(ミバエ)。<ol>
<li>何が上に配置されているを示すアルミニウム実装スタブの下にラベルを付けます。 乾燥したはえを精密ピンセットで解剖顕微鏡の下でスタブの上部に固定接着剤やカーボンの接着] タブで目的の位置に配置します。</li>
		<li>銀の導電性接着剤、すなわち、銀塗装、スタブの外側のエッジの周りを適用します。導電性を確保するためにつまようじを使用してハエにシルバーのペイントを接続します。塗装目的の撮像領域をタッチをできないようにします。</li>
		<li>スタブ ホルダー ボックスにスタブを配置し、デシケータでオープン スタブ ホルダー ボックスを配置します。少なくとも 3 時間を乾燥または最良の結果のために一晩にシルバーのペイントを許可します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. スパッタ コーティング
<ol><li>アルゴンのガスの 4 ~ 5 フラッシュを実行することによりスパッタ コーティング装置を準備します。湿度が高い場合 (すなわち部屋の空気が湿った、通常について感じている相対湿度 50%)、6 ~ 7 のフラッシュを実行します。スパッタは、製造元の指示に従ってスタブをコートします。</li>
	<li>標本に基づいてコート サンプルが使用されます。<ol>
<li>シアノ バクテリア フィルター, 上 180 s ストレート コートをスパッタするタイマーを設定します。</li>
		<li>真核生物の藻類、すなわちeuglenoids のためのフィルター 120 s、ストレート、20 s は 45 ° の角度で 3 つの側面のためのコートをスパッタするタイマーを設定します。</li>
		<li>すなわち、飛ぶヘッド、大型サンプルの 45 ° の角度で両側に 60 s、ストレート、30 秒のためのコートをスパッタするタイマーを設定します。 注: コーティングが完了すると、スタブは色でライトグレーをする必要があります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 画像
<ol><li>画像のサンプル走査型電子顕微鏡によるには二次電子 (SE) 検出器が含まれます。<ol>
<li>シアノ バクテリア、設定: 3-5 kV 加速電圧 (AC)、20-30 プローブ電流 (PC)、5 ミリメートル作動距離 (WD)。Euglenoids、3 kV AC、30 を使用して PC と 5 mm WD。ハエ、5 kV AC、30 を使用して PC と 5 〜 10 mm WD。</li>
	</ol>
</li>
	<li>詳細または視覚化されるオブジェクトのサイズに応じて倍率を調整します。明確なイメージが作成されるまで、stigmators、開口部とフォーカスを調整します。SEM の製造元の指示に従って高解像度の設定を使用してイメージをキャプチャします。</li>
</ol>

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ここで我々 は生物や組織の多くの種類の機能に適用できる他の有機体の 3 種類の外部形態的特性について詳細な情報を取得する SEM を使用してプロトコルを記述しました。プロトコルの各ステップ内では、潜在的なエラーで発生する可能性があり、詳細は以下で説明している点があります。
定着剤と洗浄ここに与えられたボリュームが特定は一般に定着剤と洗浄が試料量 × 5-10 をする必要があります。などの問題が発生した場合、すべて固定・洗濯・脱水時間が私たちの経験に基づいていますサンプルの shriveling、脱水や乾燥の各ステップの時間を増加する必要があります。あなたの 1 つのセルのサンプルによってグルタルアルデヒド固定と四酸化オスミウムのポスト固定の両方を行う必要があります。決闘固定がある場合必要なシアノ バクテリアの 1.1.2 手順後カバー同量 2% 同じバッファーで OsO4と単一のセルの手順の手順 1.2.2 から進みます。仕事はここでは示しませんからことショウジョウバエできますか定着性の次の anesthetization ...

走査型電子顕微鏡 (SEM) は、サンプル1の地形と形態を示す二次電子から画像を生成するのに高エネルギー電子の集束ビームを使用します。SEM は、直接サンプル、提供のより高い解像度と表面構造三次元形状の物理サイズと光学顕微鏡と比較してフィールドの大きい深さを決定する使用できます。電子顕微鏡検査 (EM) の別のフォーム、透過型電子顕微鏡 (TEM) は、内部構造の細部のイメージを生成するサンプルを通過集中電子を使用します。TEM 光または SEM より高い解像度があり単一原子のような小さな構造を解決する使用ことができます、それは 3 つの主要な不利な点: 広範なサンプル準備、小さな視野とフィールド2,3の浅い深さ。その他可視化プロトコルが SEM を使用して特定の細胞、細胞小器官や組織4,5,6,7,8,9,を調べる存在する10 、このプロトコルは、固有生物形態学的評価のための大規模な範囲に広く適用することができる方法について述べる。
SEM は、地質、産業、科学、材料14,のナノ粒子11,12, ポリマー13, と多数のアプリケーションを含む無機材料を検査するための広範なアプリケーションを発見した15,16。生物学で、SEM は長い個々 の蛋白質から全体生物17,18に至るまで生物学的サンプルを調べるための方法として使用されています。SEM は、科学的発見を知らせるため表面の形態学的詳細を使用できるため、特定の値が。SEM 解析は、構造、サイズ、および幅広い生体試料の表面特性について詳細な情報を取得する高速、安価で、簡単な方法です。
SEM は、一貫した高速電子ビームをサポートする高真空 (10-6 Torr の最小) の下で通常動作するため液体 (水、油、アルコール) は許可されません試料室の真空が形成するを防ぐ液体として。したがって、SEM を用いてすべてのサンプルは、通常乾燥プロセスによって続く傾斜エタノール シリーズを使用したエタノールを削除、脱水される必要があります。乾燥空気乾燥、凍結乾燥、臨界点乾燥 (CPD) デバイス、または化学 t-ブチル アルコール (未定) またはヘキサメチルジシラザン (HMDS)19、を使用して乾燥の使用など、SEM で使用するため生体組織のいくつかの方法があります。20,21,22. 各生物学的サンプルが異なるそれぞれの乾燥方法に反応するのでほとんどの場合、乾燥方法の選択は経験的。任意の指定されたサンプルのすべてのこれらのメソッドがあります適切な長所とそれぞれの短所を比較することは適切な方法を選択する際に便利ですので。
部屋の温度や乾燥炉 (60 ° C) 試料の乾燥空気は、最も簡単な方法は、ほとんどの生物学的サンプル shriveling など乾燥によるダメージを表示する、折りたたむには、供試体の歪みの結果します。凍結乾燥のプロセスも水 (または氷)、サンプルから削除しますが、フラッシュ凍結サンプルを必要として有害なサンプル、昇華のプロセスを介して氷を削除する真空下に置かれます。さらに、ユーザーは、エアカーテンへのアクセスに必要です。SEM のためのサンプルをステータス退避に最も一般的に使用されるメソッドは、臨界点乾燥 (CPD) です。液体の二酸化炭素 (CO2) と、特定の温度と臨界点 (31.1 ° C、1,073 psi) CO2気化により表面張力を作成せずとして知られている圧力条件の下で、CPD のサンプルでエタノールが置き換えられますサンプルの形態や構造の特徴を効果的に維持します。CPD は、標準的な方法では一般的に、いくつかの欠点があります。最初に、プロセスでは、臨界点乾燥機は高価なだけでなく、また液体の二酸化炭素の使用が必要になりますへのアクセスが必要です。第二に、乾燥することができますサンプルのサイズは、臨界点乾燥機のチャンバー サイズに制限されます。第三に、CPD の中に液体の交換は、サンプルを傷つけることができる乱流を可能性があります。
化学乾燥 CPD に比べて多くの利点を提供しています、SEM 試料の普及に伴い、適切な代替として機能します。未定、HMD など化学の dehydrants の使用は、サンプルの構造の整合性を維持しながら他の方法を高速、安価で、シンプルな代替を提供しています。我々 は最近、組織または大人のショウジョウバエ網膜組織23の乾燥方法として CPD または未定を使用する場合に、最終的な画像品質の整合性の違いがなかったことを示した。CPD とは異なり乾燥器や液体 CO2未定と HMD は必要ありません、乾燥試料のサイズに制限はありません。化学物質を取得、に加えて標準の化学発煙のフードと適切な個人用保護具 (手袋、白衣、安全メガネ) だけは乾燥のプロセスを完了する必要があります。TBA は毒性の少ないより少なく高価な未定と HMD は可燃性ですが、(約 1/3 HMD のコスト) HMD より。
この記事で述べる修正、洗浄、脱水、乾燥、マウント、スパッタ コート、およびイメージの 3 つのタイプの菌する方法: シアノ バクテリア (Toxifilum mysidocida、 Golenkina sp、不明な sp)、2 つの euglenoids 属Monomorphina から(M. aenigmatica と m. pseudopyrum) とフルーツ フライ (ショウジョウバエ)。これらの生物は、サイズ (4 mm 0.5 μ m) と (単細胞多細胞に) 細胞の多様性の広い範囲を表すまだすべては、だけ小さな変化が切片作製に必要な SEM 解析へ簡単に従う義務があります。このプロトコルは 3 つのタイプの菌の形態学的詳細を調べます化学脱水と SEM 分析を使用する方法について説明し、多くの生物を調べることに広く適用されると組織型。

<table><tbody><tr><td>ゴールド&ndash;パラジウム</td><td>テッドペラ株式会社</td><td>91212</td><td></td></tr><tr><td>銀導電性接着剤 503</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>12686-15</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 8 &mu;m、ポリカーボネート</td><td>Sigma</td><td>WHA110614</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Track エッチング メンブレン; 直径 25 mm、細孔径 0.8 &mu;m、ポリカーボネート、黒色</td><td>Sigma</td><td>WHA110659</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes; diam. 25 mm, pore size 0.2 &mu;m、ポリカーボネート</td><td>Sigma</td><td>WHA110606</td><td></td></tr><tr><td>アルミ計量皿&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-732-100</td><td></td></tr><tr><td>アルミ取り付けスタブ(12 mm)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>75210</td><td></td></tr><tr><td>アルミ取り付けスタブ(25 mm)</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>75186</td><td></td></tr><tr><td>粘着タブ&nbsp;</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>76760</td><td></td></tr><tr><td>導電性カーボン接着タブ</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>77825</td><td></td></tr><tr><td>F/2 メディア</td><td>テキサス大学オースティン校の藻類の文化コレクション</td><td>https://utex.org/products/f_2-medium</td><td>カタログ番号は指定されていません - リンク&nbspを参照してください。</td></tr><tr><td>AF6 media</td><td>Bigelow - National Center for Marin Algae and Microbiota</td><td>https://ncma.bigelow.org/media/wysiwyg/Algal_recipes/NCMA_algal_medium_AF6_1.pdf</td><td>カタログ番号は記載されていません - リンク&nbsp;</td></tr><tr><td>土壌水媒体</td><td>カロライナバイオロジカルサプライカンパニー</td><td>153785</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコールtert-オクチルフェニルエーテル (Triton X-100)</td> <td>VWR</td><td>97062-208</td><td></td></tr><tr><td>ハマー 6.2 スパッタコーター</td><td>アナテック USA</td><td>http://www.anatechusa.com/hummer-sputter-systems/4</td><td>カタログ番号は指定されていません - リンク&nbsp;</td></tr><tr><td>日立 3400N-II SEM&nbsp;</td><td>日立</td><td>https://www.hitachi-hightech.com/us/product_list/?ld=sms2&md=sms2-1&sd=sms2-1 -2&gclid=EAIaIQobChMIpq_jtJfj3A IVS7jACh2mdgkPEAAYASAAEgKA nfD_BwE</td><td>このモデルはもう販売していないようです&nbsp;</td></tr></tbody></table>

原核生物と真核生物の化学形態分析走査電子顕微鏡 (sem) での乾燥の準備

Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM)

走査電子顕微鏡 (SEM) は、個々 のタンパク質から細胞、組織、器官、でも全体の有機体に至るまでの生物的標本を研究に適用されている広く利用可能な技術です。このプロトコルが SEM. を用いた原核生物と真核生物のイメージングへの応用と t-ブチル アルコール (TBA) ヘキサメチルジシラザン (HMDS) 2 つの化学的乾燥方法に焦点を当ててください。この記事で述べる修正、洗浄、脱水、乾燥、マウント、スパッタ コート、およびイメージの 3 つのタイプの菌する方法: シアノ バクテリア (Toxifilum mysidocida、 Golenkina sp、不明な sp)、2 つの euglenoids 属Monomorphina から(M. aenigmatica と m. pseudopyrum) とフルーツ フライ (ショウジョウバエ)。このプロトコルの目的は、高速、安価で、シンプルな構造、サイズ、および有機体のための大規模な範囲に広く適用できる標本の表面特性について詳細な情報を取得するメソッドを記述する形態評価。このプロトコルを正常に完了は、他の SEM を使用して彼らのシステムにこれらの技術を適用することによってサンプルを視覚化することができます。

シアノ バクテリアは原核生物地球規模の炭素、酸素、および窒素サイクル28,29に重要な生物群が。シアノ バクテリア30推定 6000 種のほとんどをカバーし、セルを一緒に接続する粘液質の鞘があるし、他の構造に31、図形と一緒にすることができます解決顕微鏡32。セルのサイズ、形状、および顔料の存在、個々 の種を区別し、水生生息地では、シアノ バクテリア「花」28として視覚化できます。現代のシアノ バクテリアの分類は、光学顕微鏡、電子顕微鏡、SEM と分子データ33を使用可能なすべての形態学的特徴を兼ね備えています。藍藻類の粘質物シースと同様に、ペリクルは、系統の決定 euglenoid 種援助のストリップします。Eugle...

SEM 解析、種の同定や表現型差別を支援する効果的な方法です。このプロトコルは 3 つの代表的なタイプの菌の形態学的詳細を調べる方法について説明し、多くの個体の特徴を調べることに広く適用されると組織型。

原核生物と真核生物の化学形態分析走査電子顕微鏡 (SEM) での乾燥の準備

Scanning electron microscopy (SEM) is a widely available technique that has been applied to study biological specimens ranging from individual proteins to ...

このプロトコルは、2つの化学乾燥法、ヘキサメチルジシラザンとTブチルアルコールとSEMを使用して原核生物と真核生物の両方をイメージングするそれらのアプリケーションに焦点を当てています。この技術の主な利点は、分析用のサンプルを調製するために、臨界点乾燥機などの特殊な乾燥装置を使用する必要がなされないことです。このプロトコルは、3種類の生物の化学脱水およびSEM分析を使用する方法を記述するが、多くの生物および組織タイプを調べるのに広く適用されるであろう。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の学部生であるマディソン・クーンです。開始するには、一晩固定することによってシアノバクテリアを調製します。次に、ポリカーボネート25mLフィルタを含む10mL濾過リグに移します。ゴムストッパーでろ過リグのサイドアームと漏斗をシールして、漏斗の中の培養物を封じ込める。両方のストッパーを取り外した後、濾過フラスコに優しい掃除機をかけることによって固定剤を取り除きます。単細胞藻類のユーグレノイドを調製するには、4%オスミウム四酸化膜の3滴を、以前に10mL濾過リグに移された培養物に直接加えて固定します。30分間のインキュベーションの後、両方のストッパーを取り外し、濾過フラスコに優しい掃除機をかけることによって固定剤を取り除きます。固定ユーグレノイドを0.1 Mリン酸緩衝液pH 7.0の5 mLで10分間、フラスコと漏斗をストッパーで閉じて洗浄を保持したまま3回洗浄します。両方のストッパーを取り外した後、濾過フラスコ上の穏やかな真空によって各洗浄を除去する。連続浸漬を維持しながらサンプルを脱水するには、フラスコと漏斗をストッパーで閉じたまま、漏斗中の5mLの体積で10分間のグレードエタノールシリーズを使用して、漏斗にエタノールを含めます。両方のストッパーを取り除いた後、濾過フラスコの真空を穏やかに除去し、エタノールを除去する。サンプルをサンプルをカバーするのに十分な100%エタノールを含む使い捨て可能なアルミニウム計量皿にサンプルを移します。TBAを用いてユーグレノイドの化学乾燥を行う場合は、まずアルミニウム皿中の100%エタノール溶液をTBAの1~1溶液、100%エタノールに20分間交換します。その後、1~1溶液を100%TBAに20分間交換し、この処理を2回繰り返します。TBAを取り外し、サンプルをカバーするのに十分な新鮮な100%TBAと交換してください。TBAを凍らせるには、10分間摂氏4度で皿を置きます。試料を冷凍ゲルパック付きの真空デシケーターに移し、TBAを凍結状態に保ちます。ロータリーポンプを使用して真空を排気し、維持し、凍結したTBAの真空昇華によってサンプルを少なくとも3時間乾燥させます。ユーグレノイドにシアノバクテリアを取り付けるには、25mmのアルミニウム実装スタブの底にラベルを付けて、上に置かれているものを示します。次に、各フィルターをスタブの上部に固定したカーボン接着剤タブに置きます。ショウジョウバエメラノガスターを調製するには、麻酔付きハエを摂氏4度で2時間固定化して麻酔を行い、完全に水没していることを確認します。ガラスピペットを使用して固定剤を取り除きます。固定ショウジョウバエサンプルを1.5 mLマイクロ遠心分離チューブで1.1Mリン酸緩衝液1 mL、pH 7.2を室温で10分間洗浄します。ガラスピペットを使用して各洗浄物を取り除き、サンプルを取り外さないと注意してください。次いで、グレードエタノール系列をそれぞれ10分間用いて、マイクロフュージチューブ内のサンプルを1mLの体積で脱水する。ガラスピペットを使用して各洗浄物を取り除き、サンプルを取り外さないと注意してください。サンプルをカバーするのに十分な100%エタノールで1.5 mLマイクロ遠心チューブに保管してください。HMDSを用いてハエの化学乾燥を行う場合は、まず100%エタノール溶液をHMDSの1~2溶液に、100%エタノールを20分間交換します。その後、溶液をHMDSの2~1溶液と100%エタノールで20分間交換します。最後に、このソリューションを100%HMDSに20分間交換してから、このプロセスを1回繰り返します。1.5 mLマイクロ遠心分離チューブとHMDS内のサンプルを使い捨てアルミニウム計量皿に移します。サンプルをカバーするのに十分な新鮮な100%HMDSと100%HMDSを交換してください。アルミニウム皿の中に直接サンプルを化学発煙フードに入れ、箱などの緩い蓋で乾燥させ、破片がサンプルに落ちるのを防ぎ、12〜24時間乾燥させます。ショウジョウバエを取り付けるには、アルミニウム製の取り付けスタブの底にラベルを付けます。精密ピンセットを使用して、乾燥したハエを、解剖顕微鏡の下でスタブの上部に固定されたカーボン接着タブの所望の位置に置きます。銀の導電性接着剤をスタブの外縁に貼ります。爪楊枝を使って銀色の塗料をハエに接続し、導電性を確保し、塗料が目的のイメージング領域に触れないようにします。スタブをスタブホルダーボックスに入れ、開いたスタブホルダーボックスをデシケータに入れ、銀色の塗料を少なくとも3時間乾燥させます。スパッタ塗布装置を準備するために、アルゴンガスの4〜5フラッシュを行う。コーティングするサンプルに応じて、原稿に記載されているようにタイマーを異なる設定に設定します。スパッタは、メーカーの指示に従ってスタブをコーティングします。最後に、使用するサンプルに依存する設定を持つ二次電子検出器を含む走査型電子顕微鏡を用いた画像サンプル。このプロトコルを用いたSEM用シアノバクテリアの調製に成功し、表面の形状や質感を含む細胞の詳細、細胞からの粘液および突起の鞘が見える画像が得られた。コロラド州の糸状淡水種のSEM画像は、粘液の目に見える鞘を示しています。オハイオ州の淡水細菌のSEM画像は、時には粘液の薄い層によって一緒に保持されたコロニーを形成する個々の細胞を明らかにします。フィラメント状突起は、個々の細胞から伸びる。テキサス州沿岸海域の高い堆積物からの未知の糸状種の画像は、個々の細胞と分裂細胞を示しています。SEMは、2つの異なるユーグレノイド種のペリクルストリップを視覚化するために使用された。モノモルフィナとアイニグマティカをモノモルフィナ擬ピルムと比較すると、後端に出現するペリクルストリップの可視的なヘリカル配置が尾を形成し、フィロジナリを終結に補助する。正常なショウジョウバエの目のSEM画像は、剛毛とレンズの順序付けられた配列を示していますが、アルツハイマー病に関連するタンパク質の発現は、荒い目の表現型を作成します。眼の荒い表現型を抑制または増強する遺伝子は、疾患進行において生理学的役割を果たす可能性がある。ここでは、不適切な乾燥技術から眼の崩壊した構造の例や、画像取得時に出現する不十分なスパッタコーディングからの電子帯電の例を含む、避けるべき潜在的なピットフォールの例を示す。ここで説明するプロトコルは、尊敬される共犯と非常に大きく使用される生物を利用しましたが、生物学の多くのサブ分野にまたがる科学的発見に不可欠な有用な形態学的情報を収集するためにSEM分析に適しています。T-ブチルアルコール、ヘキサメチルジシラザン、および四酸化オスミウムとの作業は危険であり、適切な安全対策は常にユーザー、特にこれらの化学物質を取り扱う学生を保護するために守られるべきであることを忘れないでください。

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JoVE Journal

Biology

生物学

走査型電子顕微鏡(SEM)は、主に生体試料の表面特性を画像化するための強力なツールです。ただし、高品質の画像を取得するには、適切なサンプル調製が重要です。このビデオでは、SEM用の無傷の成体ショウジョウバエを調製するための脱水および乾燥ステップに焦点を当てています。...

化学乾燥:走査型電子顕微鏡(SEM)のための生物学的サンプル調製

出典: Bucher, T.ら 、 『B. subtilisバイオフィルムを小分子バイオフィルム阻害剤の特徴付けモデルとして研究する方法論』。 J. Vis.

形態学的解析のための細菌バイオフィルムコロニーの準備

&gt;jove_content&lt;走査型電子顕微鏡観察のための生物学的サンプルの処理における問題には、細胞の崩壊、湿った微小環境からのサンプルの処理、および細胞破壊が含まれます。ここでは、花分裂組織、卵分裂組織、真菌(Agaricales)などの困難なサンプルの調製に適した低コストで比較的迅速なプロトコルをまとめ、詳細に説明しています。...

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走査型透過電子トモグラフィーにより太い生物学的サンプルの調製と観察

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透過型電子顕微鏡における微生物の連続超薄切片を得る方法

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クライオ電子断層撮影のための サッカロミセス・セレビシエ の調製とクライオFIBマイクロマシニング

このプロトコルは、菌根菌で発芽した植物組織および種子における真菌コロニー形成を研究するために、走査型および透過型電子顕微鏡、光学顕微鏡、共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡などのさまざまな顕微鏡技術を適用して、マイコ従属栄養植物サンプルを収集、固定、および維持するための詳細な手順を提供することを目的としています。...

菌従属栄養植物組織における真菌のコロニー形成と種子の共生発芽を解釈するための顕微鏡技術

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学ぶ化学乾燥法を用いた原核生物と真核生物のSEM試料調製法。シアノバクテリア、ユーグレナ類、Drosophila melanogasterの形態学的特徴を詳細に可視化し、専門的乾燥機器を不要とする実用的なプロトコルを提供する。

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