Name: 蛍光顕微鏡を使用して競争力のある滴定による転写因子の DNA 結合親和性の高感度測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 学ぼう、蛍光異方性測定を用いたHiP-FA法で転写因子のDNA結合親和性を高感度に測定する手法。この方法は解離定数の大規模解析と結合特性の精密評価に有用である。

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J. ミュラー cDNA クローンとガリア研究室、特に S. Bergelt のメンバー、貴重なアドバイスと活発な議論をありがとうございます。この作品は、SFB 646、ゲノム発現とメンテナンス (CJ、P.B.) は、センターの統合蛋白質科学 (u. g.)、定量的生物ミュンヘン (修士) の大学院の調節ネットワークによって支えられました。U. g. は同毛皮 Bildung und 上海虹橋ドイツ研究振興協会 (SFB 646、SFB 1064、CIPSM、QBM) によってサポートを認めている (BMBF: ドクロ - Innovationswettbewerb Systembiologie)、フンボルト財団 (アレクサンダー ・ フォン ・ フンボルト、教授)。

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著者は利害の衝突を宣言しません。

ヒップ FA は TF DNA 相互作用のバインディングの好みの風景を決定するための包括的な新しい方法です。それは変異 DNA モチーフのバリエーション、直接しきい値上バインダーのセットのヌクレオチドの発生の頻度の結合の好みが反映されている任意の根本的な仮定を避けることの結合親和性を測定します。測定は固定化と機械的又は化学的結合反応、平衡条件を可能な限り近似に干渉せずソリューションで行われます。管理配信システム内の 1 つによる滴定曲線の測定をも可能し、蛋白質の保存中のスループットと信頼性を向上します。高感度蛍光検出高集光効率の高開口数と EM CCD カメラと目標を使用できます。したがって、この設定で小さい FA 変更 10-15 mP を正確に検出することができます; のような低実際には、つまり、バインディングが最小限 (低 2 の質量比) した後の質量増加が容易に検出する任意の結合の反作用。これは通常マイクロ プレート リーダーのような商業システムの場合ではありません。高い感度、ヒップ FA は分からなかった範囲に確実に測定することができます解離定数の範囲を拡張します。結合エネルギーは複数の一桁を正確に決定されます。
改訂された Pwm の品質を評価するには、分析20の 2 つのタイプを実行されます。我々 は、分割遺伝子ネットワークの 5 つの要因のため、異なる Pwm が 21 分割遺伝子のゲノム領域の実験的チップ seq プロファイルを予測することがどれだけテスト。2 番目のテストとして参加する TFs の結合の好みとタンパク質濃度に基づくセグメンテーション エンハンサーの発現パターンを予測するシーケンス-式モデル4を使用しました。両方の練習でより少なく特定のヒップ FA Pwm が大幅に実行がわかった具体的なフット プリントや B1H Pwm20より。
De novoメソッドとは異なりヒップ FA 与えられた TF のバインド設定のいくつかの事前知識が必要です。しかし、コンセンサス シーケンスが多く TFs の知られている、多くの既存方法13,14,15を提供できます。必要な場合は、繰り返し真最適な結合順序を見つけることができます。
Cy5 と Bodipy 650 蛍光標識 DNA 参照オリゴマーを使いました。これらの染料は、連結および非連結のラベル参照 DNA の異方性は異なるテスト染料の中で最大だったので FA 計測のためによく実行する実証されています。これにより、FA 値の最大動的範囲。一般的に、蛍光寿命 ≥ 1 と任意の蛍光染料 ns は最初にテストする必要が合うようになります。可能であれば、近赤外線範囲の蛍光を発する染料を使用して蛋白質の蛍光を最小にすることをお勧めします。
実験プロシージャの最も重要なステップは、ウェル プレートにゲルのピペットです。良い再現性には、できる限り均一するゲルのボリュームが必要です。データを評価するとき、ゲルの高さの変化が競争力のある DNA オリゴマーのそしてこうして親和性の変化は拡散率の変化に変換されます。これは技術的な複製の差異の主な情報源です。電子ピペットまたはオートメーション技術の使用は、再現性を向上させます。ゆっくりと慎重にピペッティングによるゲル内の空気の泡を回避できます。また、できるだけ小さな遅延として滴定の井戸の上にすべての競合他社のソリューションを追加することが重要です。最高の再現性、ピペッティング ロボットを用いた熱インキュベーター プロセス全体を自動化することができます。オートメーションにプロトコルを転送するための重要な部分は反応槽温度の必要な最適化とインキュベーション時間です。ゲルの粘度の最適なバランスを見つけることを確認してください (すなわち。 寒すぎるではありません) とタンパク質 (すなわち、あまりにもホットではない) の安定性。これは両方依存井戸に使用される蛋白質の安定性のゲルの払出速度に。
ヒップ FA ライバル DNA オリゴマーの制御された配信システムを活用します。滴定曲線を構築する各指定されたzのライバルの DNA 濃度c(z,t)を決定する必要がある-ゲルのマトリックス内での位置し、時間点t。KDsの決定c(z,t)に直接依存しているので、これはもう一つの重要なステップです。DNA 濃度センサーとして NB 色素を含む校正井戸は、(図 1d図 2、) この目的のために使用されます。通常、プレートごと NB を含む 3-5 校正井戸で十分です。任意のヒップ-FA を評価する前に実験、NB 競合他社が異なる (図 3 任意のシーケンスの DNA と agarose のゲルの溶解の従来の滴シリーズを実行することによってセットアップは NB 較正曲線を作成する必要があります。 、)、ステップ 8 で詳細に説明します。非常に強力なバインディングの場合 (KD < 500 pM)、ライバル DNA の低濃度の定量に使用される外挿となる制限より少なく直接測定よりも正確だから。しかし、このような低 KDs と TFs の agarose のゲルのマトリックス (図 5) を使用せず結合バッファーで従来の競争力のある滴定を実行するヒップ FA の設定を使用できます。たとえば、競合企業 DNA の 12 の異なる濃度の 1 つによる滴定は、96 ウェル プレートの 1 つの行で実行できます。
管理配信システムも必要です高速 TF DNA 結合動態と安定した蛋白質拡散以来 agarose のゲルが (遅い) が動的です。蛍光 DNA の参照に分類、それぞれにバインドされる興味の TFs の FA、時間をかけて、次に股関節 FA セットアップを直接両方のプロパティをテストできます。要因を検討の KにKOFF率を測定し、, 秒20、その他研究30に従ってするミリ秒の順序にそれらを発見しました。これは測定が平衡で開催できるように十分に速いです。他のバインディングは遅い反応速度で反応、場合その濃度を下げるか、ゲルの気孔のサイズを減らすことによって競合他社の拡散を調整できます。テスト済みの TFs の場合すべてがあるオフ高速 T (~ 秒)、約 1-2 時間の総計測時間は各測定で熱力学の平衡を確認するのに十分な。
タンパク質に関連する別の問題は、FA の測定を変える可能性のあるタンパク質の凝集体の形成です。(Tenside) のような異なる添加物を含む他のバッファー状態の使用は、必要に応じて集計の形成を防ぐことができます。
我々 は PWM; の線形性の仮定の下で働いています。ただし、ヒップ FA はコンセンサス配列のすべての可能なディ-遺伝子変異を含むように拡張できます。最後に、ヒップ FA は他の種類の結合の相互作用を測定する合わせることができます。前提条件は、使用可能な適切な参照分子拘束タンパク質を蛍光標識することができます。配位子; の任意の種類の制御の配信システムと濃度勾配を生成できます。したがって、タンパク質・ タンパク相互作用は同様に高い再現性とスループット測定できます。

定量的な方法で彼らの結合の好みを決定する重要遺伝子の転写因子 (TFs) の中心的な役割を与えられました。・ フォン ・ ヒッペルによる独創的研究によって制御される RNA のポリメラーゼ プロモーターを募集の下流のイベント中のバインドは熱力学の平衡で記述するよう規制 TFs が急速に DNA を認識概念が導入されて遅い速度1。生体内でバインディングを示唆して、この絵は可能性がより複雑な2,3;それにもかかわらず、これらの一般的な仮定は良い近似として役立ち、シス要素を検索し、シーケンス4,5,6から式を予測する多くの計算のアプローチを支持しています。平衡バインディングが概念として正常に採用されてこのようにしながら TF DNA の相互作用を決定する方法が現在バインドの特異性に焦点を当てる、通常直接測定平衡結合親和性。TF DNA 結合の系統的測定はかなりの技術的な課題を表し、既存の方法いくつかの異なる制限があります。
結合親和性の測定または genomic フラグメント内のサイトのバインドの正確な局在、深い (チップ seq)7、最も普及している生体内でテクニックをシーケンス続いてクロマチン免疫沈降は許可されていません。いくつかの in vitroメソッドは、DNase フット プリント8、電気泳動の移動性シフト (EMSA)9、表面プラズモン共鳴 (SPR)10、マイクロ スケール働く11などは結合親和性を測定することができます。しかし、彼らは比較的低いスループットです。ハイスループット技術タンパク質結合マイクロ アレイ12、HT SELEX13,14, 細菌 1 ハイブリッド (B1H)15などが結合親和性を測定し、通常過度に降伏することは逆に、特定のシーケンス、主因は厳しい選択をバインドまたは洗浄の手順が必要です。最近の進展、ディープ シーケンス ベース ヒット フリップ16や笑顔 Seq19と SELEX seq17、マイクロ ベース三富18絶対結合親和性; の抽出を可能にします。ただし、彼らはラベル付きの TF と DNA の蛍光強度を測定に依存します。蛍光信号、したがって、なる低蛋白質濃度と低 KD値を決定する制限 (< ~ 10 nM)。さらに、これらのメソッドで TF DNA 結合が行われる薄い表面上不明確な結合および/または自動蛍光バック グラウンド、弱い結合を正確に定量化することは困難になると問題を提起します。
これらの制限に対処するため TF DNA の親和性風景平衡、高性能蛍光異方性 (ヒップ-FA)20と呼ばれるソリューションを決定するための新しい手法を提案します。手法は確立された蛍光異方性 (FA) アッセイ21に基づくが、高感度とカスタマイズされた自動顕微鏡や分析のセットアップを使用して大規模な結合定数を測定する変更します。
FA アッセイ標識分子の分子の回転を測定することによって TF、この場合の結合パートナーに (DNA オリゴマー) のような蛍光に分類された種との相互作用を監視します。TF に結合する、回転速度が高い流体力学的半径と分子量増加 FA で結果バインドの複合体のため低下します。非常に強い結合の正確な測定 (KD < ~ 1 nM) ラベルの付いた参照 DNA の低濃度の使用が必要です (c < ~ 1 nM)。これは、標準的なマイクロ プレート リーダーなど市販の装置では実現困難です。さらに、連結および非連結の複合体のサイズに大きな差 (10 ~ 100 倍) は通常必要な TF 結合ドメインを通常ほぼ同じ分子量の短い DNA オリゴマーとの間の相互作用の測定を禁止します。.最後に、による滴定曲線は、通常合成と titrating 種の濃度シリーズを含む複数の井戸の測定が必要です。
これらの問題に対処する単一の井戸の z 位置の違いで FA 計測ができ、高い検出感度を達成するために変更された広視野の顕微鏡のセットアップを使用します。これにより、種同様の分子量と高親和性の結合相互作用を監視することができます。高いスループットを実現するには、ウェル プレート形式とよく管理された配信システム (図 1、) を使用して単一の全体の滴シリーズの実施で FA を測定します。さらに、競争の結合の試金を採用し、結合定数だけでなく、アクティブなタンパク質の濃度を抽出します。表現された TF 分子の部分だけがタンパクや劣化によるアクティブなので、これはアッセイの重要な機能です。実験装置は、XY ・ Z ピエゾ ステージを搭載した商業落射蛍光顕微鏡に基づいています。我々 は外部レーザ励起、システムをアップグレードし、2 つ高量子効率光検出 (図 1bと1 c) を持つ EM CCD カメラのチップ上の線形偏波成分の放出を検出します。超高感度センサーと結合した高開口数 (NA) 目的が使用され、したがって高感度 FA 計測を affords します。蛍光 z スタックを記録することによって相互作用を結合測定できます光の z 軸に沿って反応に異種のマトリックスを使用する場合。すべてのこれらの変更は既存のシステムに容易に実装することができます、費用対効果。
我々 は、ラベル付けされていない DNA オリゴマーの結合親和性を参考に蛍光に分類された DNA と比較して測定競争の結合の試金を採用しています。TF と参照 DNA 結合の相互作用のない環境を構成する、多孔質 agarose ゲルのマトリックス (細孔サイズ 〜 1 μ m) で一定濃度組み込まれます。参照 DNA は、Cy5 とともに表示されます。この色素は、比較的長い蛍光寿命により FA 計測に適してことを証明 (~ 1 ns) と可視スペクトル (低自動蛍光バック グラウンド) ので、遠赤色蛍光性の放出。TF 濃度はモル超過 Cy5 参照 DNA、すべて参照 DNA が蛋白質にバインドされていることを確認します。ラベルのない競技者 DNA の溶液はゲルの表面上に堆積しとzが変わって濃度勾配c (z, t)を確立する多孔性のマトリックスの内部拡散-フォーカル プレーンと時間t (図の位置1、 図 2a から 2 c)。Cy5 参照 DNA に結合する TF がローカル ライバル Cy5 参照 DNA FAREF(z, t)の動的に変化する FA につながるバインディングの競合している DNA の異なる濃度にさらされている従って (図 2bと2 c)。
ライバルの濃度 c(z,t) を決定する個別井戸 (校正ウェルズ) ナイル青 (NB) FANB(z, t)の動的に変化する FA の信号の測定 (図 2、3)。この色素は DNA に主体し、それにより競合企業 DNA の DNA センサーとして機能します。この制御の配信システムと 1 つのウェル プレート (96 または 384 ウェル プレート形式) 内で数十数百の異なる DNA タンパク質結合親和性を測定できます。測定が TF からラベル参照 DNA の完全な変位まで順番に実行されます。長さNのコンセンサス配列のすべて3 N単一ベースの突然変異の親和性を測定することにより特定の因子の結合特異性を決定しました。ヒップ FA タンパク質の少量が必要です (~ 滴定曲線あたり pmols) 低速で比較的大きいスケールで測定しながら KDs [係数が変化 (CV) < 20%] の決定の可変性と。このメソッドは、手動でまたは完全に自動化ロボット システムでは、さらに低い CVs (図 4、上部のパネル) の結果を使用して実施できます。解離定数は 0.5 まで高精度で測定されます nM。非常に高い親和性の (KD < 500 pM)、標準的な競争力のある滴定 (図 5) を使用して、低レベル (< 100 nM) でライバル DNA 濃度測定の誤りが原因。
ヒップ-FA は、ほぼ任意の標準実装、反転、蛍光顕微鏡、自動 XY ステージとピエゾ z 軸ステージの可用性を提供できます。光学部品は、長距離目標装備自動広視野セットアップ中造られました。実習では、アッセイは (の特定作業、距離と開口数) 他の特性の目的に適応することができます。ただし、パラメーターの最適化が必要です ( z間の距離-スライス、気孔率およびagarose のゲル等の高さ。)。他の種類のレーザーやカメラの使用も可能です。プロトコル セクションの全体の実験とデータ解析の詳細な説明を記します。

<table><tbody><tr><td>Cy5-labeled 16- / 18-bp DNA-オリゴマー</td><td>Eurofins</td><td></td><td>カスタム合成</td></tr><tr><td>16- / 18-bp DNAオリゴマー</td><td>Eurofins</td><td></td><td>カスタム合成</td></tr><tr><td>ナイルブルー A</td><td>シグマ</td><td>N5632-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sensoplate plus microplate 96-or 384-well, PS</td><td>Greiner</td><td>655891</td><td>175 &micro;m厚いガラス底</td></tr><tr><td>384ウェルSensoplate、黒</td><td>Greiner</td><td>788896</td><td></td></tr><tr><td>アガロース、低ゲル化温度</td><td>シグマ</td><td>A9414-50G</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td>メル<td>ク</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン-20</td>シ<td>グマ</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>二カリウムリン酸水素三水和物</td><td>メルク</td><td>1.05099.1000</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素カリウム</td><td>メルク</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>Q-POD エレメント</td><td>メルク ミリポア</td><td>ZMQSP0DE1</td><td></td></tr><tr><td>ミリパック 40 ガンマ ゴールド フィルター</td><td>メルク ミリポア</td><td>MPGL04GK2</td><td></td></tr><tr><td>ミリクエント インテグラル 3 浄水システム</td><td>メルク ミリポア</td><td>ZRXQ003WW</td><td></td></tr><tr><td>クォンタム TIX</td><td>メルク ミリポア</td><td>QTUMOTIX1</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815-1G</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler gradient</td><td>Eppendorf</td><td>Z316083</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal チューブ 1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.706.200</td><td></td></tr><tr><td>チューブ 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Multiply-Pro cup 0.2 mL PP</td><td>Sarstedt</td><td>72.737.002</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡 セットアップ:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>全自動広視野顕微鏡</td><td>LEICA</td><td>DMI6000</td><td></td></tr><tr><td>長距離対物レンズ</td><td>LEICA</td><td>HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. ドライ</td><td></td></tr><tr><td>638 nm ライン連続ダイオードレーザー</td><td>オミクロン</td><td>PHOxX 638-40, 40mW</td><td></td></tr><tr><td>裏面照射型 EM-CCD カメラ</td><td>Andor</td><td>iXon DV897</td><td></td></tr><tr><td>ダイクロイックミラー</td><td>AHF</td><td>640nm カットオフ</td><td></td></tr><tr><td>バンドパスフィルター</td><td>AHF</td><td>ET バンドパス 700/75</td><td></td></tr><tr><td>直線偏光板</td><td>Thorlabs</td><td>LPVISC050-MP2</td><td></td></tr><tr><td>偏光ビームスプリッター</td><td>Thorlabs</td><td>BS010</td><td></td></tr><tr><td>アクロマティックレンズ</td><td>Thorlabs</td><td>焦点距離 200 mm 焦点距離</td><td></td></tr><tr><td>マルチモード光ファイバー</td><td>Optronis</td><td>FVP600660710</td><td></td></tr><tr><td>ロボットシステム:</強力></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>当社のロボットシステムには、96チャンネルヘッドを備えたBiomek NXPワークステーションと、サーボシャトルに接続されたSpan-8ピペッターが含まれており、すべての液体移送ステップに使用されます。さらに、このシステムには、Span-8グリ</td><td>ッパーBeckman Coulter</td><td>Biomek NXP</td><td></td></tr><tr><td>SOFTWARE:プログラミング言語</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>National Instruments</td><td>Labview 9.0</td><td></td></tr><tr><td>HiP-FAソフトウェア用のスクリプト</td>によって提供されるオービタルシェーカーとマイクロプレートリーダー(Paradigm、Molecular Device)が装備されています。<td></td><td></td><td>https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA</td></tr></tbody></table>

蛍光顕微鏡を使用して競争力のある滴定による転写因子の dna 結合親和性の高感度測定

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

転写因子 (TF) の正確な定量化-DNA の相互作用は遺伝子発現の規則を理解するため。以来、既存のアプローチは大きな制約に苦しむ、大規模に感度が高い TF DNA 結合親和性を決定するための新しい方法を開発しました。試金は確立された蛍光異方性 (FA) の原則に依存しているが、重要な技術的な改善を紹介します。まず、TF と多孔質の agarose のゲルのマトリックスで DNA の蛍光に分類された参照を組み込むことによって単一の井戸の完全 FA 競争力のある滴定曲線を測定します。ラベルのない DNA オリゴマーは上の競争相手としてロードされ、拡散を時空間的勾配を形成します。カスタマイズされた落射蛍光顕微鏡のセットアップを使用して生成される FA グラデーション、読み出します。この改善されたセットアップを同じような分子量の分子に対しても確実に定量化する弱いと強力なバインディングが可能、FA 信号検出の感度が大幅に増加します。このファッションのウェル プレートのウェルあたり 1 つの滴定曲線を測定することができ、フィッティング処理を通じて絶対的な解離定数 (KD) とアクティブな蛋白質の集中の両方を抽出できます。与えられたコンセンサス シーケンスのバインドのすべてのシングル ポイント突然変異のバリエーションをテストすることにより単板に通常の TF の全体結合特異性風景を調査して我々。結果位置の重み行列 (Pwm) アウトパ フォーム TF 占有体内を予測の他のメソッドから派生したものです。従来の自動化された蛍光顕微鏡とデータ解析パイプラインのヒップ-FA を実装するための詳細なガイドを紹介します。

分割遺伝子ネットワーク25,26, 転写制御を通して主のショウジョウバエの胚の前方後方体パターンを生成する TFs ヒップ FA に適用した.このネットワークから選んだ bZIP ドメイン TF 巨大 (Gt) の詳細な分析 (図 4)。GST 融合 DBD を使用し、表現するエシェリヒア属大腸菌GST 融合タンパク質の構築フルレングス転写因子はエクスプレスし、の DNA 結合ドメイン (DBD)13としてほとんど同じバインディング設定を生成することは困難なのでつながれてだけで20と同じ結果を提供します。
Gt コンセンサス シーケンス (、TTACGTAAC) では、我々 は上記のように決定最強のバインド シーケンスを表します。その後、5' と 3' 端に追加の基地に挟まれた 10 mer Gt コンセンサス シーケンス (合計 30) 内のすべての可能なシングル ポイント変異の結合エネルギーに及ぼす影響を調べた。そのゲルのサンプルは、オートメーションを使用して作り出された 2 つの複製と比較のため手動で生成される 1 つの追加の複製を測定しました。〜 &gt; 2000 nM 単独変異シーケンスは、0.6 KDs とまた「非バインド」シーケンス (データは示されていない) へのバインドの完全な欠如を確認しました。
TF DNA 結合特異性は通常スコアが結合モチーフの各位置で可能な限り各塩基配列に割り当てられている位置重量行列 (PWM) を使用してモデル化します。PWM では、各位置は結合強度を個別に貢献し、バインドの設定27TF の十分なモデルを構成するほとんどの場合を想定しています。私たち親和性測定に基づく改訂を実現して生成した次の手順28,29を設立し、既報文献の 2 つを実現してそれらを比較して。最初はヌクレオチド DNA のフット プリントの4、5、によって識別されるサイトのバインドから使用頻度に基づいており、2 つ目の PWM は細菌 1 ハイブリッド (B1H) 選択によって得られました。15
(図 4、上部のパネル) の 3 つの複製の Pwm の類似性が高い (複製 3) 手動で調製した試料を含む、ヒップ FA 法の高い再現性を示します。ヒップ FA によって得られる Pwm は全体的な得られる Pwm のよう他の方法 (図 4、下部のパネルとがありますの有意な偏差: 位置 2 (黒矢印)、コアの bZIP モチーフ T の突然変異の開始 &gt; (G、C、A) につながる一致しているヒップ FA で得られるモチーフでバインディングの損失を完了 B1H モチーフではなく、バインディングまま脚 (G, A) の比較的強い、DNase のフット プリントで得られる。逆に、位置 7 (灰色の矢印)、突然変異 T &gt; C 前に測定した Pwm に基づく予期されたものより多くの強力なバインディングに 。
その他の逸脱は微妙、劣らず重要です。全体的に、ヒップ FA PWM は他の 2 つよりも特定コンセンサスから多くの突然変異はまだ適度に強い結合の結果という事実を反映しました。これは、情報コンテンツ (IC) を使用して定量化することができます。IC は IC と比較して股関節 FA マトリックス (3 つの複製の平均) の 11.5 ビット = 13.4 ビットと DNase のフット プリントと B1H 行列 16.8 ビットそれぞれ。一般に (しかしない普遍的に)、ヒップ FA によって得られる Pwm が20を調べた 26 TFs に基づく他の方法によって得られるものより特定性の低い。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig1.jpg"> 図 1:ヒップ FA アッセイと実験装置の回路図の描写。(滴定の競争相手単一の井戸で DNA のゲル a) 配信システム。(b) ヒップ FA 顕微鏡のセットアップ。EM CCD カメラに偏光蛍光光検出の自動化された広視野顕微鏡をカスタマイズしました。並列 (赤) を決定するために使用の興味の 2 つの領域 (c) Raw 蛍光画像と垂直 (グリーン) 偏光コンポーネント。(96 ウェル プレートの d) 典型的なレイアウトです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig2.jpg"> 図 2: 生 FA データおよび再建された滴定曲線。(よく注意を含む校正 a) 典型的なFA(z,t)軌道(b, c)強い (b) とより穏健な (c) DNA 結合競合他社への連結を測定する 2 つの滴定井戸のFA(z,t)時間の軌跡。(d, e)対応する FA 滴定測定を再建され、強い (d)、中等度 (e) バインドの曲線します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig3.jpg"> 図 3: ライバル DNA c の濃度を決定する (z、t)ナイル青 (NB) を使用します。(16 塩基対の DNA オリゴマーのため a) FA 濃度校正曲線。従来の滴シリーズの NB は濃度の異なる DNA の競争相手と共に agarose のゲルに埋め込まれます。NB の DNA に対する親和性はシーケンスに依存しない20;したがって、同じ校正曲線は c を決定する使用できます (z、t)同じ長さの異なる DNA シーケンス。(b) 競技者 DNA 時間拡散プロフィル 5 校正井戸を用いて任意のz高さで。測定サイクルごとに 4 つの nb の井戸の平均 FAs は白いドットとして表示されます。曲線が装着式 3 (ホワイト ライン、色で個々 の井戸) と c を使用して (z、t)低濃度 (C &lt; ~ 100 nM) 推定フィッティング曲線によって決定されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig4.jpg"> 図 4: TF 巨大 (Gt) bZIP ドメイン家族の特異性をバインドします。3 複製のヒップ FA Pwm: オートメーションを使用して作製した 2 つと 1 つを手動で準備 (上部パネル) が DNase のフット プリントと細菌 1 ハイブリッド (B1H) 選択法 (下段) による生成を実現すると比較されます。全体的にみて、ヒップ FA 結合モチーフは以前のデータ同意するが、また黒と灰色の矢印で強調されているように、大きな違いを示します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58763/58763fig5.jpg"> 図 5: ヒップ FA と従来の競争力のある滴。(a) プレート デザインは、96 ウェル プレートの 1 つの行に結合バッファーで希釈した直列 8 の異なるライバル DNA を示しています。FA ヒートマップは強み異なる任意のバインドに対して表示されます。(b) 競争力のある滴定 3 競技者 Dna の異なる親和性を持つ Bcd TF へのバインドします。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58763/58763fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

大規模な感度を考慮した結合親和性平衡、ソリューションを決定するための手法をご紹介します。これは、転写因子の DNA 結合の定量的解析を向上します。メソッドは、制御された配信システムで自動蛍光異方性測定に基づいています。

蛍光顕微鏡を使用して競争力のある滴定による転写因子の DNA 結合親和性の高感度測定

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

転写因子-DNA結合の理解を深めるため、例えば異方性測定を用いて大規模に解離定数を測定する方法を開発しました。この技術により、自動的に完全な滴定曲線を取得し、解離定数を高感度で決定することができます。平衡時の溶液で働き、中程度のスループットと大きな動的範囲を有する。HiP-FAを適用して、転写因子の結合アフィニティの景観を改良しました。しかし、このプロトコルは、例えばタンパク質とタンパク質相互作用やタンパク質薬物相互作用のような他の種類の結合事象に適用することができる。私は、測定の再現性に関する推定を得るために、最初に同じ結合パートナーと複数の滴定を実行することをお勧めします。利用可能な場合は、より良い削減のために自動化されたシステムを使用してください。参照DNAのDNAオリゴマーをアニールするには、1つのチューブに10ミリモルの二量標識フォワードとラベルなしの逆鎖のそれぞれ7マイクロリットルを混合する。競合するDNAの場合、各100ミリモル未標識鎖の20マイクロリットルを96ウェルドPCRプレートの2つの井戸に混ぜます。次に、標準的なPCR機を使用して、DNA溶液を摂氏70度まで3分間加熱します。その後、1秒あたり0.1°Cの速度で室温に下げます。電子レンジを使用して、100ミリリットルの結合バッファーで0.5グラムのアガロースを溶かします。二重蒸留水を加えて、蒸発の可能性を補うために最終体積を調整します。10ミリリットルのストックアリコートを準備します。96ウェルプレートの滴定およびキャリブレーションウェルを準備するには、2つのゲルストックアリコートを75°Cインキュベーターシェーカーに移します。各滴定ウェルについて、参照DNA、転写因子タンパク質の1.4ナノモルを、20〜60ナノモルの最終濃度で、0.2ミリモルDTT、および結合バッファーを溶融ゲルの240マイクロリットルに加える。チューブを反転・振るだけで充分に混ぜます。次いで、96ウェルプレートの指定された滴定ウェル内のDNA含有ゲルのウェル当たり200マイクロリットルをゆっくりとピペット化する。キャリブレーションの各ウェルに対して、溶かしたゲルの240マイクロリットルに5ナノモルナイルブルー染料を加えます。気泡を避け、96ウェルプレートの5~6個のウェルに色素含有ゲル溶液のピペット200マイクロリットルをゆっくりとピペットする。ゲルを完全に水平な表面に置き、室温で10分間、摂氏4度でさらに10分間インキュベートします。マルチウェルプレートリーダーを使用して、プレートの異なるウェルでゲル高さのレベルの均質性を確認します。競合遺伝子溶液を調製するために、まず標識された参照DNA、タンパク質、および3倍の濃縮結合バッファーを組み合わせます。次に、20マイクロリットルの溶液を、アニールされた競合のDNA溶液のそれぞれ40マイクロリットルと混合する。キャリブレーションの各ウェルについて、アニールされた競合のDNA溶液の1つと15ミリモルナイルブルー色素溶液を含む3倍の濃縮結合バッファーの適切な量を組み合わせます。最後に、混合競合液を可能な限り同時にゲルの上に50マイクロリットル加えます。画像の取得を開始するには、96ウェルプレートを顕微鏡ステージに配置します。次に、参照DNAからタンパク質の完全な結合が解除されるまで、ウェルのZスタック画像の時系列を取る。原稿に従って滴定アッセイを行う。その後、HiP-FA ソフトウェアを使用して、個々の競合シーケンスの滴定曲線を作成します。次に、エクスポートボタンをクリックして、各滴定中の活性タンパク質の解離定数と濃度を良好に取得します。粘性のあるゲル溶液をピペットする際には、特に注意してください。不正確なピペット処理により、解離定数の決定精度が低下する可能性があります。本研究では、B-zip型転写因子のDNA結合性の好みを決定するためにHiP-FA法を適用した。巨大、フライセグメンテーション遺伝子ネットワークから。手動で作成した複製用のPWMの高い類似性は、HiP-FA法の高い再現性を示しました。この方法と他の方法によって得られるPWMは全体的に類似している。しかし、突然変異が完全な結合の喪失、または以前の測定よりもはるかに強い結合につながるコアモチーフの2および7位で有意な偏差が見られる。我々は、数十の転写因子の結合のための改良を生成するためにHiP-FAを使用し、最終的にデータのより良い予測を得ることを示している。高精度の尺度は、全てのシステムやあらゆる種類の相互作用に対するTF-DNA結合をよりよく理解するのに非常に役立つと考えています。

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Research

JoVE Journal

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