Name: 成人再生療法のための機械的微細化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 2 s
Description: 学ぶコラゲナーゼ不使用の機械的手法による脂肪組織からのSVF抽出法。遠心分離と乳化プロセスで細胞外マトリックスを保持し、再生医療研究の汚染リスクを低減する革新的プロトコルです。

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この作品は (81471881、81601702、81671931) 中国の国家自然科学基金、中国の広東省 (2014A030310155) の管理者南方病院財団 (2014B009、自然科学財団によって支えられました。2015Z002、2016Z010、2016B001)。

この研究は、南方病院、広州、中国の倫理審査委員会によって承認されました。脂肪組織は健康なドナーから与えたインフォームド コンセントを書かれて、研究に参加する収集されました。すべての動物実験は南方病院機関動物ケアおよび使用委員会によって承認され、国民の健康および医学研究評議会 (中国) のガイドラインに従って実行されます。
1. ECM/SVF-ゲル作製
<ol><li>脂肪を収穫します。<ol>
<li>-0.75 で直径 1 mm のいくつかの鋭い側面穴を含む 3 mm のマルチポート カニューレと人間に脂肪吸引を行う吸引圧の atm。</li>
		<li>滅菌バッグで成人の 200 mL を収集します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>コールマン脂肪を準備します。<ol>
<li>4 つの 50 mL チューブに、成人を転送でき、10 分のためにまだ立って収穫された脂肪。</li>
		<li>転送する広い先端のピペットを使用して、最上位のレイヤーに 2 つの 50 mL チューブに脂肪を収集し、底層の液体の部分を破棄します。</li>
		<li>レイヤーを使用して 50 mL チューブ、centrifugate 脂肪 1,200 x g (RT) 室温で 3 分間。</li>
		<li>コールマン脂肪として上位層 (約 80 mL) を定義します。</li>
		<li>全体チップ ピペットを用いて 20 mL チューブにコールマン脂肪の上部の 2/3 を転送し、低密度脂肪としてこの部分を定義します。</li>
		<li>広い先端のピペットを使用して、別の 20 mL チューブにコールマン脂肪の下の 1/3 を転送し、高密度脂肪としてこの部分を定義します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>低密度脂肪から ECM/SVF-ゲルを生成します。<ol>
<li>低密度脂肪の 20 mL を intershift に (2.4 mm の内部の直径) とメス-メス ルアーロック コネクタによって接続されている 2 つの 20 mL の注射器を使用しています。</li>
		<li>(20 mL/秒) で安定したシフトの速度を維持し、8 x 6 x を繰り返します。</li>
		<li>Centrifugate 2,000 x gで RT 3 分のための混合物。</li>
		<li>10 mL チューブで上油部分を収集するには、さらに使用するため常温広い先端のピペットを使用します。</li>
		<li>ECM/SVF-ゲル (図 1A)、広い先端のピペットを使用して、中間層の粘着性物質を収集し、底層流体を破棄します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>高密度脂肪から ECM/SVF-ゲルを生成します。<ol>
<li>高密度脂肪の 15 mL に 5 mL のオイル (ステップ 1.3.4 採集) を追加します。</li>
		<li>注射器 6 間混合脂肪を intershift x 8 x までエマルジョン内で、くず繭を観察します。</li>
		<li>Centrifugate 2,000 x gで RT 3 分のための混合物。</li>
		<li>上にオイルの部分を破棄します。</li>
		<li>広い先端のピペットを使用して中間層 (ECM/SVF-ゲル) の粘着性物質を収集し、底層流体を破棄します。</li>
		<li>1.3.5 と 1.4.5 の手順から ECM/SVF-ゲルを混ぜます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 裸 ECM/SVF-ゲル移植モデルマウス
<ol><li>裸のマウスの麻酔 (8 週古い、女性) とイソフルレン (1%-3%)動物の手術室で麻酔します。</li>
	<li>ECM/SVF-ゲルを 1 mL の注射器に転送します。</li>
	<li>鈍的浸潤カニューレを 1 mL 注射器を接続します。</li>
	<li>マウスの各側面にカニューレを皮下挿入します。</li>
	<li>ECM/SVF-ゲルの 0.3 mL を注入します。</li>
</ol>3. 組織 ECM/SVF-ゲル注入後 3、15、および 90 日の収穫
<ol><li>イソフルラン (1%-3%) を持つマウスを麻酔します。吸入麻酔。</li>
	<li>頚部転位法によるマウスを犠牲に。</li>
	<li>マウスの皮膚の正中線を手術用はさみで切開を行います。</li>
	<li>解剖、マウスの両側に脂肪質の接木を収穫します。一晩常温 4% パラホルムアルデヒドで脂肪質の接木を埋め込みます。</li>
	<li>エタノール濃度の増加のティッシュの水分を取り除く: 70% のエタノール、2 つの変更、1 h は、それぞれ;80% エタノール, 1 つの変更, 1 h。95% のエタノール、1 つの変化、1 h。100% エタノール, 3 つの変更、1.5 h 各;キシレン、3 つの変更、1.5 h。</li>
	<li>パラフィン ワックス (58-60 ° C)、2 つの変更、2 h で組織に潜入します。</li>
	<li>組織をパラフィン ブロックに埋め込みます。約 4 μ m の厚さでセクションをカット、スライド上に置きます。</li>
</ol>4. ヘマトキシリン ・ エオシン染色
<ol><li>I、II、および III (各 10 分)、キシレンでそれらを浸すことによってパラフィン ブロック スライドを deparaffinize します。</li>
	<li>濃度 (100%、100%、95%、80%、70%) の減少を介してそれらを渡すことによってティッシュ セクションを水分補給します。3 分間エタノール風呂。</li>
	<li>蒸留水 (5 分) の組織切片をすすいでください。</li>
	<li>5 分のヘマトキシリンで切片を染色します。</li>
	<li>1% アルコールに酸 20 分 Decolorize 水道の流水で切片をリンス (1% 70% アルコールで HCl) セクションが再び青になるまで水道水を実行している 5 s. リンス。</li>
	<li>ピペットでスライドに直接染料をエオシン Y の 2 〜 3 滴を追加し、10 分間設定染料。</li>
	<li>スライドを 1-5 分の水道水で洗ってください。</li>
	<li>(70%、80%、95%、100%、100%) 濃度の増加でスライドを脱水します。3 分間のエタノール。</li>
	<li>5 分の I および II のキシレンのスライドをオフします。</li>
	<li>メディアのマウントのスライドをマウントします。</li>
</ol>5. 免疫蛍光染色
<ol><li>キシレンで切片を deparaffinize I、II、および III (5 分)。</li>
	<li>異なる濃度 (100%、100%、95%、95%、70%) を介してそれらを渡すことによってティッシュ セクションを水分補給します。3 分間アルコール風呂。</li>
	<li>10 分間常温メタノール 3% H2O2ソリューションのセクションを孵化させなさい。</li>
	<li>スライド 2 を洗い 5 分蒸留水 x。</li>
	<li>スライド バスケットのスライドを削除します。300 mL の 10 mM クエン酸バッファー (pH 6.0) を追加し、95 から 100 ° c 10 分のスライドを孵化させなさい。</li>
	<li>RT の 20 分間のスライドをクールします。</li>
	<li>スライド 2 をすすぎリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、5 分で x。</li>
	<li>スライド上に 10% 牛胎児血清の 100 μ L を追加し、1 時間室温で加湿チャンバーで孵化させなさい。</li>
	<li>4 ° C で一次抗体溶液 (モルモット抗マウス Perilipin、1: 400) でセクションを一晩インキュベートします。</li>
	<li>PBS 3 でスライドをすすぎ x、5 分ごと。</li>
	<li>二次抗体の解決セクションを孵化させなさい (ヤギ反ギニア豚 488 IgG) 室温 2 時間</li>
	<li>PBS 3 でスライドをすすぎ x、5 分ごと。</li>
	<li>きれいなティッシュ ペーパーのセクションの周りの水を拭き取る。</li>
	<li>スライドのセクションをカバーするサークルに 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) と Alexa Fluor 488 共役 isolectin をドロップします。</li>
	<li>Coverslips をマウントし、暗闇の中で乾燥させます。</li>
	<li>スライドを蛍光顕微鏡で観察します。</li>
</ol>

<ol><li>Bateman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Fat+to+Fight+Disease%3A+A+Systematic+Review+of+Non-Homologous+Adipose-Derived+Stromal%2FStem+Cell+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Using Fat to Fight Disease: A Systematic Review of Non-Homologous Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Therapies.</a> Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).</li>
<li>Baer, P. C., Geiger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+mesenchymal+stromal%2Fstem+cells%3A+tissue+localization%2C+characterization%2C+and+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity.</a> Stem Cells International. , 812693(2012).</li>
<li>Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells+for+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells for regenerative medicine.</a> Circulation Research. 100 (9), 1249-1260 (2017).</li>
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<li>van Dongen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+intraoperative+procedures+for+isolation+of+clinical+grade+stromal+vascular+fraction+for+regenerative+purposes%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).</li>
<li>van Dongen, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fractionation+of+adipose+tissue+procedure+to+obtain+stromal+vascular+fractions+for+regenerative+purposes%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">The fractionation of adipose tissue procedure to obtain stromal vascular fractions for regenerative purposes.</a> Wound Repair and Regeneration. 24 (6), 994-1003 (2016).</li>
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<li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micronized+cellular+adipose+matrix+as+a+therapeutic+injectable+for+diabetic+ulcer%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Micronized cellular adipose matrix as a therapeutic injectable for diabetic ulcer.</a> Regenerative Medicine. 10 (6), 699-708 (2015).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+flap+survival+improvement+by+composition-selective+fat+grafting+with+novel+adipose+tissue+derived+product+-+stromal+vascular+fraction+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Research+Communication%22%5BJournal%5D)">Ischemic flap survival improvement by composition-selective fat grafting with novel adipose tissue derived product - stromal vascular fraction gel.</a> Biochemistry and Biophysics Research Communication. 495 (3), 2249-2256 (2018).</li>
<li>Tonnard, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanofat+grafting%3A+basic+research+and+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Nanofat grafting: basic research and clinical applications.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 1017-1026 (2013).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Extracellular+Matrix%2FStromal+Vascular+Fraction+Gel%3A+A+Novel+Adipose+Tissue-Derived+Injectable+for+Stem+Cell+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Adipose Extracellular Matrix/Stromal Vascular Fraction Gel: A Novel Adipose Tissue-Derived Injectable for Stem Cell Therapy.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (4), 867-879 (2017).</li>
<li>Yao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+Stromal+Vascular+Fraction+Gel+Grafting%3A+A+New+Method+for+Tissue+Volumization+and+Rejuvenation%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Surgery%22%5BJournal%5D)">Adipose Stromal Vascular Fraction Gel Grafting: A New Method for Tissue Volumization and Rejuvenation.</a> Dermatologic Surgery. 44 (10), 1278-1286 (2018).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Long-Term+Volume+Retention+of+Stromal+Vascular+Fraction+Gel+Grafting+with+Enhanced+Angiogenesis+and+Adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Improved Long-Term Volume Retention of Stromal Vascular Fraction Gel Grafting with Enhanced Angiogenesis and Adipogenesis.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (5), 676-686 (2018).</li>
<li>Sun, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+stem+cell-derived+exosomes+in+tissue+engineering+and+neurological+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+the+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Applications of stem cell-derived exosomes in tissue engineering and neurological diseases.</a> Reviews in the Neurosciences. 29 (5), 531-546 (2018).</li>
<li>Allen, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grading+lipoaspirate%3A+is+there+an+optimal+density+for+fat+grafting%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Grading lipoaspirate: is there an optimal density for fat grafting.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (1), 38-45 (2013).</li>
<li>Qiu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+Centrifuged+Lipoaspirate+Fractions+Suitable+for+Postgrafting+Survival%5BTitle%5D)+AND+%22Plastic+and+Reconstructive+Surgery%22%5BJournal%5D)">Identification of the Centrifuged Lipoaspirate Fractions Suitable for Postgrafting Survival.</a> Plastic and Reconstructive Surgery. 137 (1), 67-76 (2016).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

幹細胞を用いた再生治療法は、さまざまな病気に大きな潜在的な利点を示しています。簡単に取得し、組織の修復と15新しい組織の再生能力を持っているので、Asc、卓越した治療候補です。ただし、セルおよび6を処理するコラゲナーゼを分離する複雑な手続きを必要とするので、臨床応用を拡大する制限があります。したがって、コラゲナーゼを使用せず幹細胞を取得する単純な手法の開発が不可欠です。
本研究ではネイティブ脂肪 ECM によって保護されている SVF のセルを取得する脂肪組織の純粋に機械的なプロセスを提案します。さらに、このプロセスは、コラゲナーゼ無料です。前研究と比較して異なる intersyringe 回を処理および 10 mL/秒の流量で 1 分は ECM/SVF-ゲル12を製造するための最適なプロトコル、標準コールマン脂肪の intersyringe 処理がわかった。Intersyringe シフトを使用することにより、成人のほとんどの脂肪細胞は、...

幹細胞療法は、様々 な疾患1の代替治療を提供することがありますので、組織の修復・再生のためのパラダイム シフトを提供します。幹細胞 (例えば、誘導多能性幹細胞、胚性幹細胞) は偉大な治療可能性を秘めているが、携帯規制と倫理的配慮により制限されます。脂肪由来間葉系間質/幹細胞 (Asc) は成人と同じ制限を受けないを入手しやすいしたがって、実用的な再生医療2理想的なセルタイプをなっています。加えて、彼らは nonimmunogenic して自家脂肪3から豊富な資源があります。
現在、Asc は、脂肪組織のコラゲナーゼを介した消化によって主に得られます。脂肪組織の間質の血管分数 (SVF) には、Asc、内皮前駆細胞、血管、免疫細胞が含まれています。有益な効果があることが示された酵素によって SVF/Asc の高密度を取得、いくつかの国の法律は厳密にコラゲナーゼ4を使用してセル ベースの製品の臨床応用を調整します。SVF のセルを取得する 1 時間 30 分のコラゲナーゼと脂肪の消化準備し、生物学的汚染両方の外因性物質のリスクが高まります。付着性文化と日を週には、Asc、精製特定の検査機器が必要です。さらに、ほとんどの研究では、懸濁液中の SVF セルと Asc が使用します。細胞外マトリックス (ECM) または別のキャリアの保護がなければフリー セルを受けます、注入後、不良セルの保持を引き起こす、治療結果5を危険にさらします。これらすべての理由は、幹細胞療法のそれ以上の適用を制限します。
コラゲナーゼを介した消化せず脂肪組織から Asc を取得、遠心分離、まな板、破砕、pureeing、ミンチ、機械を含むいくつかの機械的処理は開発6,7をされています。,8,9します。 これらのメソッドは、成熟脂肪細胞とその油を含む小胞を機械的に破壊して組織と Asc を凝縮すると考えられています。また、動物における再生医療モデル8,9,10として、Asc の高濃度を含むこれらの準備はかなり治療の可能性を示した。
2013 年には、Tonnardらは接木処理11intersyringe による乳化成人の生産を含む nanofat を導入しました。Intersyringe シフトによって作成された剪断力は選択的に成熟脂肪細胞を破ることができます。彼らの調査結果に基づいて、我々 SVF 細胞と ECM/SVF-ゲル12分別された ECM だけを残して、成人の脂質と流体のほとんどを削除する純粋に機械的処理方法を開発しました。ここで、ECM/SVF-ゲルを生成するひと由来脂肪組織の機械的なプロセスの詳細について述べる。

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488-標識イソレクチン GS-IB4</td><td>分子プローブ</td><td>I21411</td><td></td></tr><tr><td>モルモット 抗マウス ペリリピン</td><td>Progen</td><td>GP29</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>サーモフィッシャー</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>ワイドチップピペット</td><td>セルトリート</td><td>229211B</td><td></td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡&nbsp;</td><td>ライカ&nbsp;</td><td>TCS SP2</td><td></td></tr><tr><td>ヌードナイス&nbsp;</td><td>南医学大学</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡&nbsp;</td><td>オリンパス</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>50mLチューブ</td><td>コーニグ</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>滅菌袋</td><td>ライシ</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>ライカ&nbsp;</td><td>CM1900</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Heraus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

成人再生療法のための機械的微細化

Mechanical Micronization of Lipoaspirates for Regenerative Therapy

様々 な疾患の再生ツールとなっている間質血管分数 (SVF)しかし、法律は厳密にコラゲナーゼを使用して細胞製品の臨床応用を調整します。ここでは、純粋に機械的なプロセスによって、脂肪組織から SVF 細胞と細胞外マトリックスのネイティブの注射混合物を生成するためのプロトコルを提案する.成人は遠心分離機に入れ、3 分間 1,200 x gでスピンします。中間層の収集し、二層 (下部に高密度脂肪) と上に低密度脂肪に分かれています。上位層を直接 8 x 6 x 用 20 mL/秒のレートで intersyringe シフトすることによって乳化します。乳化脂肪は 3 分間 2,000 × gで遠心分離し、油の層の下に粘着性物質が収集され、細胞外マトリックス (ECM) として定義されている/SVF ゲル。最上層に油が収集されます。約 5 mL のオイルは、高密度脂肪 15 mL に追加され、intersyringe シフト、6 x 8 x に 20 mL/秒のレートで乳化します。乳化脂肪は 3 分間 2,000 × gで遠心分離し、粘着性物質も ECM/SVF-ゲルです。ECM/SVF-ゲルのヌードマウスへの移植後、移植、収穫、組織検査によって評価。結果は、このプロダクトに通常の脂肪組織に再生成する可能性があることを示しています。この手順は、再生のための自然な支援の ECM に埋め込まれた SVF 細胞を凝縮して、シンプルで効果的な機械的解離プロシージャです。

ECM/SVF-ゲルにコールマン脂肪を処理した後破棄された石油の量は最終巻の 80% とオイルの層の下で保持される脂肪の 20% だけは ECM/SVF-ゲル (図 1A) とみなされます。ECM/SVF-ゲルは 27 G 針; を通過することができます滑らかな液体のような質感しかし、コールマン脂肪は大規模な繊維と一体脂肪構造で構成されています、18 G カニューレ (図 1B) を通過することができますのみ。
移植後 3 日目、複数の細胞内脂肪滴、豊富な血管に富んだ結合組織浸潤炎症細胞と脂肪細胞を小型の多数に出演。15 日以降は、徐々 に減少に開始された炎症細胞の数と脂肪細胞が成熟し始めた。90 日でグラフト血管の結合組織のほとんどは、成熟脂肪細胞 (<strong...

ここでは、一連の機械的なプロセス、乳化および複数の遠心を含む脂肪組織から間質血管の一部を取得するためのプロトコルを提案する.

Stromal vascular fraction (SVF) has become a regenerative tool for various diseases; however, legislation strictly regulates the clinical application of ...

脂肪吸引から間質血管分画(SVF)を得るためにはコラゲラーゼによる消化が必要であり、生物学的汚染のリスクが高まる。コラゲターゼなしでSVFを得るためのより良い方法を開発する必要があります。これらの技術は、単純な機械的プロセスを通じて、そのネイティブの細胞外マトリックスでSVFを得ることを可能にします。手順をデモンストレーションするのは、私たちの研究室の卒業生であるXihang Chenです。脂肪サンプルを得た後、リポアズパイアを1本の50ミリリットルチューブに移し、収穫した脂肪を10分間平衡化させます。次に、広い先端ピペットを使用して、チューブの最上層から新しい50ミリリットルチューブに脂肪を引き出し、遠心分離によって脂肪を回転させます。チューブの上層はコールマン脂肪分画です。コールマン脂肪の上の2/3を新しい15ミリリットルチューブに移します。この部分は低密度脂肪と考えられる。コールマン脂肪の下3分の1を2番目の15ミリリットルチューブに移します。この部分は高密度脂肪と考えられる。低密度脂肪から細胞外マトリックス間質血管画分ゲルを生成するには、女性から女性のルアーロックコネクタに接続された2つの20ミリリットルのシリンジを低密度脂肪の10ミリリットル間間シフトに使用する。これは、アディポサイトを破壊するための重要なステップです。インターシリンジのシフトが行われる速度と時間は、最終製品の品質に寄与します。最後のシフト間セッションの後、遠心分離によって脂肪を収集し、15ミリリットルのチューブに上部の油層を移します。次に、粘着性の中中細胞外マトリックス間質血管画分ゲル層を新しい15ミリリットル円錐形チューブに移します。高密度脂肪から細胞外マトリックス間質血管画分ゲルを生成するには、低密度油分率の2ミリリットルを高密度脂肪サンプルの5ミリリットルに加える。エマルション内で凝集が観察されるまで実証したように混合脂肪をシフトする。遠心分離によってフロクレートを収集し、上部の油層を捨てます。次に、粘着性のある中間層を収集し、低密度細胞外マトリックス間質血管画分ゲルサンプルとこの画分を混合します。コールマン脂肪を細胞外マトリックス間質血管画分ゲルに処理した後、廃棄された油の体積は最終体積の80%を占め、油層の下に保存された脂肪組織の20%だけが細胞外マトリックス間質血管画分ゲルとみなされる。細胞外マトリックス間質血管画分ゲルは、27ゲージの細かい針を通過することを可能にする滑らかな液体のような質感を有する。しかし、コールマン脂肪は、18ゲージカニューレを通過できる大きな繊維を持つ一体型脂肪構造で構成されています。移植後3日目には、複数の細胞内脂質滴を有する多数の小型の前脂肪細胞、広範な血管結合組織、および浸潤した炎症細胞が多数現れる。15日目から、炎症細胞の数は徐々に減少し始め、アディポサイトは成熟し始める。90日目までに、移植片の血管化結合組織の大部分は成熟した有数細胞に置き換えられた。細胞外マトリックス間質血管画分ゲル移植片はまた、移植の3日後にいくつかのペリリピン陽性脂肪細胞を含み、小さなサイズの前脂肪細胞を有し、複数の細胞内脂質滴が15日目に出現し始める。1日90の細胞外マトリックス間質血管画分ゲル移植片切片の各分野は、多数のペリリピン陽性脂肪細胞および新たに形成された血管を示す。フローサイトメトリーは、製品中の細胞集団を決定するために行うことができる。走査電子顕微鏡とは、製品の微細構造を可視化するために行うことができる。この技術は、外科医および研究者が脂肪組織から天然の細胞外マトリックス繊維を有する高濃度のSVF細胞を有する産物を得るための簡単な方法を提供する。

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Medicine

医学

このプロトコルは、吸引脂肪や骨格再生を評価するための重要な4ミリメートルサイズの頭蓋冠欠損の作成から脂肪由来の間質細胞の単離を説明します。...

吸引脂肪から採取した脂肪由来間質細胞を使用したクリティカル·サイズの頭蓋冠欠損モデルの修復

2001年には、UCLAの研究者は、成体幹細胞の集団の単離を説明した脂肪組織から、脂肪由来幹細胞またはASCをと呼ばれる。この記事では、コラゲナーゼを使用して手動、酵素消化プロトコルを使用して脂肪吸引物からASCの分離の概要を説明します。...

人間の脂肪吸引物からの脂肪由来幹細胞を手動で隔離

リンパ節は免疫応答を調整する免疫組織であり、ワクチンの重要な標的です。バイオマテリアルは、より良いリンパ節を標的とし、抗原またはアジュバントの送達を制御するために採用されてきた。本論文では、これらのアイデアを組み合わせて、生体適合性ポリマー粒子をリンパ節に注入する技術について述べる。...

生分解性高分子粒子のリンパ節内注入

ここでは、脂肪組織由来の間質血管分数と変形性関節症の軟骨様組織の再生によって膝機能の改善への応用を生成するプロトコルを提案する.

潜在的な軟骨再生のための脂肪組織由来間質血管分数の生産の臨床プロトコル

方法およびプロトコルの正確な開示は、幹細胞療法の大規模な取り込みにとって極めて重要である。ここでは、根治的前立腺切除術(RP)後の勃起不全(ED)の治療として単回海綿内注射に使用される脂肪由来再生細胞を単離するためのプロトコールを提示する。...

根治的前立腺切除術後の勃起不全治療のための脂肪由来再生細胞の単離

ここでは、閉じたシステム装置を用いて酵素フリーの微細断片化をヒト脂肪組織に提示する。この新しい方法は、生体内移植、インビトロ培養、およびさらなる細胞単離および特性化に適した脂肪組織のサブミリメートルクラスターの取得を可能にする。...

細胞表現型と分泌性特性化のためのヒト脂肪組織微細断片化

本プロトコルは、文献と比較して時間的増加を伴う途方もない細胞収量をもたらすADSC単離のための改良された方法論を記載する。この研究はまた、長期凍結保存後に比較的多数の生細胞を得るための簡単な方法を提供します。...

脂肪組織から間葉系幹細胞を得る技術および長期凍結保存における間質血管画分のキャラクタリゼーション

機械的に単離された間質血管画分(SVF)とフィブリンハイドロゲルの組み合わせは、組織工学や創傷治癒目的など、さまざまな適応症で生存脂肪由来の間質細胞の容易で効率的なキャリアを提供します。ここでは、トランスレーショナルリサーチおよび臨床応用のための機械的SVF(mSVF)-フィブリンハイドロゲルコンストラクトの調製について紹介します。...

機械的に単離されたStromal Vascular画分およびFibrinのヒドロゲルの組合せ:処理のプロトコール

ここでは、自家脂肪組織を異なる物理化学的特性と機能を持つさまざまな脂肪成分物質に変換できるプロトコルを紹介します。...

脂肪を特殊な成分に変換するための革新的な脂肪組織分画

このプロトコルは、カプサイシンを充填したα-ラクトアルブミンナノミセルを用いて溶解可能なマイクロニードルパッチの製造を説明しています。この方法は、疎水性バイオアクティブ成分を脂肪組織に標的的に経皮送達するための再現可能かつ低侵襲的なアプローチを提供し、効率的な局所脂肪削減を促進し、肥満管理への応用拡大を可能にします。...

経皮カプサイシン送達および脂肪組織還元のためのα-ラクトアルブミンナノミセルを充填した溶解可能なマイクロニードルパッチの製作

学ぶコラゲナーゼ不使用の機械的手法による脂肪組織からのSVF抽出法。遠心分離と乳化プロセスで細胞外マトリックスを保持し、再生医療研究の汚染リスクを低減する革新的プロトコルです。

成人再生療法のための機械的微細化

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