Name: 病抑制のクイックの予備評価として板競争の試金 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: 学ぶ土壌病原菌Rhizoctonia solaniの生育抑制を評価するプレート競争アッセイ法。堆肥の病害抑制効果を2〜3日で迅速にスクリーニングし、生物学的防除の可能性を検証する実用的な手法です。

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調査の資金をバーモント州農業試験場競争力のあるハッチング プログラム VT-HO1609。リン牙はバーモント大学6で彼女の修士の学位論文の一部としてメソッドを使用します。

1. 事前に準備します。
<ol><li>マスター真菌培養 (テスト有機物)<ol>
<li>アメリカのタイプ文化コレクション微生物コレクション9、teleomorphあざ(フランク) (ATCC 10154)、ミャー 4031 から注文します。</li>
		<li>また: 者が行うローカル菌株を収集します。紅芯大根 (ダイコン) の苗が餌工場としても働くR. solaniによる減衰をオフまたはルートの腐敗の歴史があると知られている場所から土壌を収集します。土に種をまくし、苗が 3 〜 4 週間の古いルートの病変から分離します。<ol>
<li>土壌から苗を外し、水道水ですすいでください。葉と根 (図 1) の胚軸部の茶色の組織形態を探します。</li>
			<li>シングル エッジかみそりの刃を使用すると、茶色の色を持つ胚軸、またはルートの 1 cm セグメントをカットします。1 分、滅菌水で 10 秒すすぎ後の世帯の漂白剤の 10% の解決でセグメントをディップするのに火炎滅菌鉗子を使用します。 注: 滅菌シャーレの上下は、このステップの便利なコンテナーです。</li>
			<li>工場を移転する火炎滅菌使用鉗子のパットを乾燥させると水寒天 (1 L で 15 g) ペトリ皿のサーフェスに配置し、ペーパー タオルの内側に作品します。</li>
			<li>ふた付きプラスチック容器の中のシャーレを置き、室温 (約 20 ° C) で孵化させなさい。10% 漂白剤または 75% エタノールとコンテナーの内部を拭くし、皿を挿入する前に乾燥空気を入れます。</li>
			<li>(5 ° C) で (1 L で 17 g) 傾斜コーンミール寒天培地の最小媒体の長期貯蔵の菌株を維持します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58767/58767fig1.jpg"> 図 1: 病の症状です。R. solaniを含む土は、斑状の発芽と設立 (左) の結果します。ダイコン幼苗での現象は、胚軸 (右) で茶色の病変として発生します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58767/58767fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<ol start="2"><li>この版の試金のための接種材料のジャガイモ デキスト ロース寒天 (1 L で 39 g) を使用します。<ol>
<li>ジャガイモ デキスト ロース寒天培地の 1 つで赤色菌核病菌文化の娘文化を確立またはアッセイの前に 2 日間それを保証する、定着してアッセイの前に、培養プレート上。新鮮なポテト ・ デキスト ロース寒天培地 (図 2) のプレートの中心にマスターの文化から R. solaniの小片 (直径 10 mm) を転送することによって娘文化を開始します。 注: 層流フードや汚染のリスクを最小限に抑えるため 10% 漂白剤または 75% エタノールの実験室ベンチを拭いてください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>オートクレーブ 25 mL 試験管 10 mL の蒸留水 (2 x サンプル数) の因数を持つ。</li>
</ol>2. テスト用試料の調製
<ol><li>オートクレーブ水 25 mL 試験管 10 mL に各堆肥のテスト サンプルの 2 つの独立した 0.5 g サンプルを追加します。一晩、試験管を振る。<ol>
<li>ユニークなサンプル数と各メンバー (参照) または B (サンプル) としてペアの試験管のラベルします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>24 h 後 2 125 mLconical フラスコに蒸留水 90 mL にプレーン寒天 1.5 g を追加します。</li>
	<li>オートクレーブ、寒天と低速排気設定と 20 分のため各組の A サンプルの両方の三角フラスコ。</li>
	<li>オートクレーブ後平衡 (約 30 分) に達するまでに、寒天と三角フラスコを 45 ° C の水浴に配置します。それが 45 ° C に冷却するまで任意のサンプルのスラリーを風呂の水に入れないでください。</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58767/58767fig2.jpg"> 図 2: プロトコルのイラスト。R. solaniのプラグは、堆肥水抽出培養シャーレに配置されます。解像度とコントラストを改善するために実体顕微鏡を用いて 1-2 日後菌糸増殖の直径を測定します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58767/58767fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<ol start="5"><li>A 寒天培地フラスコの溶融の寒天に A サンプル (オートクレーブ参照) 合成物スラリーを注ぐ。寒天に堆肥を分散させるために旋回。</li>
	<li>B 寒天培地フラスコの溶融の寒天に B サンプル (サンプル生活) 合成物スラリーを注ぐ。寒天に堆肥を分散させるために旋回。</li>
	<li>直径 100 mm は、5 つのプラスチック シャーレに各フラスコの混合物を注ぐ。</li>
	<li>寒天が固まるので、一晩冷却プレートをしましょう。</li>
</ol>3.赤色菌核病菌挑戦を追加します。
<ol><li>サンプル寒天の各ペアに R. solaniの等しいサイズの部分の無菌技術を使用して、転送 (3 ~ 5 mm corkborer は等しい大きさで分類された部分によく動作します)。菌糸体は積極的に成長している保証するためにコロニーの外側の余白からコロニーの部分を取る。 注: 層流フードや実験室ベンチ 10% 漂白剤または 70% エタノールで拭きます。</li>
	<li>コロニーの成長は板の端に約半分の方法に到達するまで 1-2 日の室温でプレートを孵化させなさい。</li>
</ol>4. R. solani の成長の測定します。
<ol><li>透過照明を用いたステレオ顕微鏡クリア フラット定規で最も近い 1 mm 各プレートで菌糸体の半径を測定します。 注: 斜めまたは暗いフィールド照明やすくなりますし透明な菌糸を測定します。この時点で、抑制のゾーン表示される B プレートで堆肥フラグメント周り堆肥は抑制です。</li>
	<li>プレートごとの 3 つの場所の半径を記録し、代表的な測定として機能する 3 つの平均を計算します。</li>
	<li>B プレート、プレートからの平均値を減算します。場合 B &lt;イネ紋枯病菌を抑制、B プレートの微生物がありますし。</li>
	<li>平均半径の相対的な抑制率、1 日あたり mm 菌糸体としての単位を表すへの挑戦の日数で割ります。</li>
</ol>

<ol><li>Gonzalez Garcia, G., Onco, M. A. P., Susan, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review.+Biology+and+systematics+of+the+form+genus+Rhizoctonia%5BTitle%5D)+AND+%22Spanish+Journal+of+Agricultural+Research%22%5BJournal%5D)">Review. Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia.</a> Spanish Journal of Agricultural Research. 4 (1), 55-79 (2006).</li>
<li>Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+soilborne+fungal+diseases+with+organic+amendments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments.</a> Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).</li>
<li>Noble, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risks+and+benefits+of+soil+amendment+with+composts+in+relation+to+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Australasian+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Risks and benefits of soil amendment with composts in relation to plant pathogens.</a> Australasian Plant Pathology. 40, 157-167 (2011).</li>
<li>Wichuk, K. M., McCartney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compost+stability+and+maturity+evaluation+-+a+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Civil+Engineering%22%5BJournal%5D)">Compost stability and maturity evaluation - a literature review.</a> Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).</li>
<li>Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+composted+olive+mill+wastes+to+predict+potential+plant+disease+suppressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness.</a> Biological Control. 3, 199-207 (2011).</li>
<li>Fang, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biological+indicators+of+compost-mediated+disease+suppression+against+the+soilborne+plant+pathogen+Rhizoctonia+solani%22">Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani</a>. , University of Vermont. M.S. Thesis (2015).</li>
<li>Bonanomi, G., Antignani, V., Capodilupo, M., Scala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+characteristics+of+organic+soil+amendments+that+suppress+soilborne+plant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42, 136-144 (2010).</li>
<li>Neher, D. A., Fang, L., Weicht, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecoenzymes+as+indicators+of+compost+to+suppress+Rhizoctonia+solani%5BTitle%5D)+AND+%22Compost+Science+and+Utilization%22%5BJournal%5D)">Ecoenzymes as indicators of compost to suppress Rhizoctonia solani.</a> Compost Science and Utilization. 25 (4), 251-261 (2017).</li>
<li>American Type Culture Collection. ATCC® Mycology Culture Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx">https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx</a> (2018).</li>
<li>Berns, A. E., Phillip, H., Narres, H. -D., Burauel, P., Vereecken, H., Tappe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+gamma-sterilization+and+autoclaving+on+soil+organic+matter+structure+as+studied+by+solid+state+NMR%2C+UV+and+fluorescence+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Soil+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of gamma-sterilization and autoclaving on soil organic matter structure as studied by solid state NMR, UV and fluorescence spectroscopy.</a> European Journal of Soil Science. 59, (2008).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

以前の研究から知っている特定の堆肥はR. solaniの抑制に効果的な抑制効果がコンポストに住む微生物堆肥6,8の非生物的プロパティではなくのためであります。'' 細菌を殺すためにオートクレーブの使用は、メディア10の炭素化学に影響を与えるために批判されています。ワットマン第 1 稿による真空ろ過するオートクレーブの使用を比較しました。フィルターもオートクレーブもなく治療は、 R. solani成長6の最大の抑制を示した。ろ過には、どうやら微生物の生産可能性が高い遺伝子抗生物質による病抑制に重要だったより大きい、固体粒子が削除されます。
メソッドの利点は、シンプルさと手頃な価格です。結論と推奨事項アルファーノらのよう2、板競争の試金は発病抑制がないスタンドアロンの試金とし...

赤色菌核病菌を表しますどのあざ(フランク) のウイスキーの菌類の広い複合体 (アナモルフ枯kühn-=) 根腐病や立枯1の原因病原体は。イネ紋枯病菌は積極的な病原体、不利な環境条件1の下で菌核として生き残ることができる腐生植物です。その結果、グローバルな販売・ ナス科、マメ科、キク科、アブラナ科の深刻な経済的損失の結果を含む植物のホストの広い範囲で病気を引き起こすことができます。
堆肥は、ハーバーの特定植物病原体2の生物防除剤能力を持っています。ただし、すべての堆肥は似ているも、すべての病原体にも影響同様に3。木質炭素は干し草またはわら炭素ベースの堆肥よりも高いリグニン セルロース比率を。R. solaniわらは、容易に利用可能な炭素を好みます。対照的に、生物的防除菌、トリコデルマ属菌などは炭素がより容易に利用できるときに効果的です。有益なカビや細菌堆肥には、競争、対立または植物成長3の調整による病害を抑制できます。提案法は、主に抗生物質、ecoenzymes または病原体に有害であるキレート剤の生産によって作成された対立を検出します。
植物の生物検定は、堆肥を支持または植物成長4を抑止するかどうかを決定するためのゴールド スタンダードです。ただし、植物生物検定は時間がかかる (数ヶ月に週間) 以上必要し、根系の厳しさを定量化する根を持つ植物を抽出するより多くの労働を必要とする可能性がありますを完了します。比較的堅牢なより速く (日) 試金は品質管理プログラムに最適でしょう。このホワイト ペーパーの目標は、堆肥の抑制の可能性を予測する比較的迅速かつ正確なテストを示すことです。メソッドはアルファーノらにならってください。2 つの例外を除いて、堆肥エキス5が希釈し、寒天培地は、ポテト ・ デキスト ロース寒天培地 (PDA) の代わりに使用されました。PDA 昇格細菌や汚染文化6他のカビの増殖に対し、 R. solaniは簡単な水寒天に急速に育ちます。
この版の試金は土壌腐生植物の褐色根腐病や疫病菌根腐病、萎ナシ早い虫害R. solani7として生き残る植物病原体の範囲に適用される抑制のインジケーターとして機能します。版の競争の試金は、土壌病原体の生物的制御因子としての微生物のコミュニティを含むため堆肥製品の範囲を画面に便利です。アッセイ商業堆肥製品6,8疾患抑制の最も一貫した指標の一つであった。レシピ、成熟、および製造プロセスで彼らの変化の製品を選択しました。

<table><tbody><tr><td>オートクレーブナローネックガラス円錐フラスコ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10-040D</td><td>125mL</td></tr><tr><td>オートクレーブガラス試験管</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-925J</td><td>25mL</td></tr><tr><td>脱水粒寒天</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>DF0145-17-0</td><td>500g個</td></tr>耐<tr><td>熱手袋</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td>ック MEMGG1314WL</td><td>数ブランドご用意しております</td></tr><tr><td>パラフィルム(幅2-3センチメートルのストリップ)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>PM992 13-374-16</td><td>5または10センチメートル幅は使い捨て</td></tr><tr><td>ポリスチレンシャーレ</td>作業フィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>R80116</td>は<td>、20 / eaのスリーブまたは500</td></tr>脱<tr><td>水ポテトデキストロース寒天</td>のケースで来ますフィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>DF0013-15-8</td>は<td>、100、500と2000グラム</td></tr>の<tr><td>ベンチトップレシプロシェーカー</td><td>トーマスサイエンティフィックの量で来ます</td><td>1227Y31</td><td>他のモデルは、</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>ThermoScientific</td><td>S37363</td><td>5L汎用</td></tr><tr><td>クリア定規、フラット、少なくとも10 cm</td><td>任意の</td><td></td><td>使用メートル法ルール</td></tr><tr><td>ATCC文化</td><td>アメリカンタイプカルチャーコレクション</td><td>ATCC 10154</td>テレ<td>オモルフThanatephorus cucumeris(フランク)(ATCC 10154)またはMYA 4031で動作します。</td></tr><tr><td>ラボテープ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15935</td><td>オートクレーブおよび取り外し可能、1インチ幅の優先</td></tr><tr><td>耐水性マーカー</td><td>オフィスまたは科学供給</td><td>シャーピー細い先端</td><td>テープにサンプル番号を書き込み</td></tr></tbody></table>ます

病抑制のクイックの予備評価として板競争の試金

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

目標は、開発し、苗立ち枯れ病菌イネ紋枯病菌に対する特定堆肥の病抑制能力を検出する単純な手頃な価格、かつ効果的なバイオアッセイを最適化することでした。R. solaniは、植物のホストの世界の広い範囲の病原体です。菌は土壌、腐生植物として存続し、簡単な水寒天に急速に成長します。版の試金は、堆肥 R. solaniの成長を遅らせる能力を比較する迅速な方法です。アッセイも Pythium 根腐疫病菌根腐病、萎ナシ早い虫害など土壌中における腐生植物として生き残る他の土壌伝染性の病原菌の抑制とよく相関します。

終了する合成物は安定で、2 つの頻繁に使用される交換できるように、安全にパッケージ化して輸送できるので条件とない原因副作用その最終用途4の間に成熟しました。安定性分解への抵抗であり、通常微生物活性の指標を使用して決定されます。微生物の呼吸の一般的な措置の積極的な病原体とR. solani7などの腐生植物病抑制は必ずしも堆肥安定を測定します。本研究は、材料は特定の使用の準備ができているし、園芸用植物の発芽と成長の試金によって決定されます推測成熟度に焦点を当てた。
生活堆肥の抽出物抑制R. solani成長大幅オートクレーブ サンプル (P ≤ 0.0001) より。オートクレーブは、微生物、微生物を介した抑制を指すを殺します。これは、メソッドでプレート A が媒介微生物の生物的防除 (<s...

提示する特定の合成物が含まれる細菌やカビイネ紋枯病菌の増殖を抑制する可能性があるかどうかを識別するためにプレートの競争の試金のためのプロトコルです。

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

この方法は、土壌中の植物病原体の生物学的制御に関連する重要な質問に答えることができます。堆肥のような試験材料のゴールドスタンダードは、植物に有毒であるかどうかをテストするための植物バイオアッセイを持つためです。しかし、それは3週間かかります。この方法は、約2〜3日で行うことができます。この技術の主な利点は、それが簡単で、手頃な価格で、効果的であるということです。このアッセイは、根球菌の成長を抑制する特定の堆肥の迅速なスクリーニングである。しかし、このアッセイは、フザリウム、ピシウム、フィトフトラスなどの他の土壌植物病原体に対しても使用できます。この方法の視覚的なデモンストレーションは、汚染を避けながら真菌の純粋な培養物を分離し維持するために注意を払うので重要です。隔離手順を実証することは、私の研究室の大学院生であるテイラー・レディハフです。私の研究室の学部生であるエマ・ライトが競争のアッセイを実演します。まず、R.solaniによって引き起こされる病気の既往歴を持つ既知の土壌に赤大根の種子をまきます。3~4週間後、土から苗を取り出し、水道水ですすい水にします。カミソリの刃を使用して、茶色の色を持つ低コチルと根の1センチメートルのセグメントをカットします。次に、炎殺菌鉗子を使用して、セグメントを10%漂白剤溶液に1分間浸します。この後、滅菌水でセグメントをすすいします。次に、炎の殺菌された鉗子を使用して、ペーパータオルにセグメントを移します。セグメントを乾かして、水寒天でペトリ皿に移します。蓋付きの容器の中にペトリ皿を置き、室温でセグメントをインキュベートします。娘の文化を確立するには、ジャガイモデキストロース寒天の新鮮なプレートの中心にセグメントの1つを転送します。この後、10ミリリットルの水を含む25ミリリットルの試験管をオートクレーブする。各試験サンプルの2つの0.5グラムサンプルを10ミリリットルの無菌水を含むオートクレーブ試験管のペアに追加し、一晩試験管を振ります。24時間後、円錐形のフラスコに1.5グラムのプレーン寒天と90ミリリットルの蒸留水を加えます。フラスコをオートクレーブした後、45°Cの水浴に30分間置きます。次に、オートクレーブ参照サンプルと生きたサンプルを溶融寒天に注ぎます。各フラスコの混合物を5つのペトリ皿に注ぎます。先住民族の微生物を保護するためには、寒天が熱すぎる間に堆肥を追加しないことが重要です。したがって、堆肥を追加する前に、寒天が摂氏45度まで冷却するようにします。無菌技術を使用して、R.solaniの各ペアのサンプルプレートに移します。その後、プレートを室温で1〜2日間インキュベートする。最後に、平らな定規とステレオ顕微鏡を使用して、各プレートの菌糸体の半径を最も近いミリメートルまで測定します。このプロトコルでは、生きた堆肥からの抽出物は、オートクレーブサンプルよりもR.solaniの増殖を有意に抑制し、その効果は微生物であり、栄養ベースではないことを実証した。抑制性は、オートクレーブ制御と比較して成長の減少として測定される。成長は、堆肥の成熟または硬化の持続時間によって影響を受けなかった。成長は、堆肥方法とレシピ成分、特にバーミコンポスト、ウィンドロウプロセス、およびハードウッド樹皮のレシピによって有意に影響を受けた。その開発後、この技術は、疾患抑制性のための堆肥の商業的認証の候補となる可能性がある。

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