Name: 遺伝子療法ポリカチオン コーティングに影響を与えた DNA 折り紙ナノ構造体の保護 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: 学ぶ DNAオリガミナノ構造体のキトサンおよびLPEIによるポリカチオンコーティング法。酵素分解から保護し細胞取り込みを向上させ、遺伝子治療や診断への応用可能性を示す技術です。

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このプロジェクトは、付与契約第 686647 の下で欧州連合のホライゾン 2020年研究と技術革新プログラムから資金を受けています。80 でモルガーニの TEM 画像が記録された kV EM 施設でウィーン オ コア施設 GmbH (VBCF) の。我々 はワイヤ フレーム ナノ構造を設計するためのグラフィカルなデザインと Elisa デ LIano の支援のため Tadija Kekic を感謝したいです。

1. ポリカチオン在庫ソリューションを準備します。
<ol><li>LPEI 原液<ol>
<li>LPEI に含まれるガラス ビーカー 10 mg を追加 &lt; H2o ・ 10 mL</li>
		<li>LPEI を完全に溶解するには、まで達する pH 2.0 HCl (32%) を追加します。</li>
		<li>7.0 に pH を調整するには、水酸化ナトリウム (10 M) を追加します。</li>
		<li>最終濃度 1 mg/mL にボリュームを調整します。</li>
		<li>0.22 μ m 膜を介して LPEI 原液をろ過します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>キトサン原液<ol>
<li>キトサン ・ オリゴ糖・乳酸の 16.6 mg を溶解 (Mw ~ 5 kDa、60% オリゴ糖組成、90% のキチンからされたきちん) 1 mL の酢酸 (10%) 水溶液 10 Mg/ml の濃度のストック溶液を調製するのに。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. DNA 折り紙ナノ構造体の浄化
<ol><li>ミックス 100 μ L の DNA 折り紙サンプル (5 mM、1 mM EDTA 5 mM NaCl トリスバッファー (TB として表されます) の 18 mM MgCl2を含む) 22 mM MgCl 換算した容積で2 TB を補完 (100 μ L) 1.5 mL チューブに。</li>
	<li>浄化バッファー (15% (w/v) ペグ 8,000 5 mM トリス、1 mM EDTA と 505 mM NaCl) 200 μ L を追加します。管反転で優しく混ぜます。</li>
	<li>室温 (r. t.) 25 分で 16,000 × g でサンプルをスピンします。</li>
	<li>慎重に上澄みを廃棄し、16 mM MgCl2補足 TB バッファーでペレットを再懸濁します。上澄みとペレットは、それぞれ余分な短繊維と沈殿した DNA 折り紙を含まれています。</li>
	<li>R. t.、thermomixer で 650 rpm で、1 日のサンプルをインキュベートします。この手順は、DNA 折り紙の完全な再懸濁のためです。</li>
</ol>3. Agarose のゲルの電気泳動 (歳)
<ol><li>2% の agarose のゲルの準備にガラス ビーカーに 1.6 g アガロース、0.5 x TAE バッファー (20 mM トリス、0.5 mM 10 mM 酢酸 EDTA、pH 8) 80 mL を追加します。5 分間電子レンジは、水のお風呂で 1 分のビーカーの内容を旋回します。352 μ MgCl2 11 mm MgCl2ゲルを準備する (2.5 M) を追加します。DNA ゲル染色の 10 μ L をゲルを染色済み。</li>
	<li>乾燥ゲル ボックスにゲル溶液を注ぐ、ゲルの電気泳動の櫛を挿入します。15-30 分の常温固化ソリューションをしましょう。</li>
	<li>11 mm MgCl2実行バッファー (0.5 x TAE バッファー) を補足します。</li>
	<li>読み込みバッファー (30% (v/v) グリセロール、0.25% (w/v) ブロモフェノールの青、0.25% (w/v) キシレンシアノール FF) x 6 の 20% で 10-20 μ L のサンプルをミックス、agarose のゲルの井戸に読み込みます。</li>
	<li>70 V の 2.5 - 常温でゲルを実行 3 h。</li>
	<li>UV スキャナーを持つゲルを視覚化します。</li>
</ol>4 否定的な汚れの透過型電子顕微鏡 (nsTEM)
<ol><li>グロー放電炭素コーティング Cu400 TEM グリッドに希薄化後のナノ構造や、polyplex の 5 μ L を適用します。Ca の吸着せて 1 分。</li>
	<li>フィルター紙によるグリッドの端から余分な液体を排出します。</li>
	<li>2% ウラニル酢酸水溶液の 5 μ L を適用し、1 分待ちます。</li>
	<li>完全にグリッドの端から余分な液体を排出するのにフィルター ペーパー エッジを使用します。</li>
	<li>グリッド、TEM に注入する前に完全に乾燥しなさい</li>
</ol>5. Polyplex 形成
注: 例示例 DNA 折り紙・ N ・ P 0.01 8 比でキトサンを含む polyplex を準備するため。
<ol><li>フォーミュラ 1 (表 1) を使用してポリカチオンあたりアミンの数を計算します。</li>
	<li>260 超紫外線分光光度計を使用して精製 DNA 折り紙の濃度測定 nm。空白として TB バッファーの 2 μ L を使用すると、マシンを調整します。「リン酸の nmol」を計算式 2 を使用しています。</li>
	<li>リン酸の 1 nmol を含む DNA 折り紙構造の 15 μ L を準備します。</li>
	<li>キトサンは、N ・ P 0.01 8 で polyplex を準備するために必要な量を計算するのに式 3 を使用します。たとえば、N ・ P 8 polyplex を準備、キトサン (0.8 mg/mL) の 1.8 μ L は必要です (N ・ P は 8、リン酸の nmol は 1、キトサンの分子量は 5,000 g/mol、キトサン原液の濃度は 0.8 mg/mL、キトサンあたりアミンの数は 28)。キトサン (0.8 mg/mL) の 1.8 μ L に TB の 13.2 μ L を追加します。5.3 NP 8 DNA 折り紙キトサン polyplex を得るためのステップから 15 μ L の DNA 折り紙にキトサン液 (0.8 mg/mL) の 15 μ L を追加します。Polyplex が自発的に形成されます。</li>
	<li>5.4 別 N 比で polyplexes を準備する手順を繰り返します。</li>
	<li>ステップ 3 (図 1 a) で説明したように、時代を実行します。コントロールとして裸の DNA 折り紙があります。</li>
	<li>ステップ 4 (図 2) で説明したように、polyplex をイメージします。 式 1)ポリカチオンあたりアミン グループの数 <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq1.jpg"> 式 2)リン酸のほくろ =<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq2.jpg"> 式 3)ポリカチオン量 (μ L) =<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq3.jpg">
</li>
</ol>6. デキストラン硫酸をカプセル化解除
<ol><li>式 4 (表 2) を使用してデキストラン硫酸あたりの硫酸塩のグループの数を計算します。</li>
	<li>デキストラン硫酸を定義済みの polyplex の decomplexation に必要な量を計算する A/P 比式 5 を使用して。A/P 充電率と DNA 折り紙のリン酸基 (P) に polyanion (A) の硫酸塩のグループの間の比率です。デキストラン硫酸の過剰量 (例えば500 1,000) polyplexes の効率的な decomplexation が必要です。たとえば、decomplex、polyplex セクション 5 で用意 (polyplex を含むリン酸の 1 nmol) で P 1,000、デキストラン硫酸 40 kda (50 mg/mL) 3.6 μ L が必要です/(A/P は 1,000、リン酸の nmol が 1、デキストラン硫酸の分子量は 40,000 g/mol、デキストラン硫酸原液の濃度は 50 mg/mL と硫酸の数は 220)。ステップ 5.4 から、polyplex にデキストラン硫酸塩 (50 mg/mL) の 3.6 μ L を加え、よく混ぜます。</li>
	<li>キトサン polyplex で作業する場合は、decomplexation プロセスを容易にする水酸化ナトリウムを追加します。10 mM の最終濃度の水酸化ナトリウムを追加します。LPEI polyplexes に対してこの手順をスキップします。</li>
	<li>ステップ 3 (図 1 b) で説明されているように、時代を実行します。コントロールとして裸の DNA 折り紙と polyplex が含まれます。 式 4)polyanion あたりの硫酸塩のグループの番号 = <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq4.jpg"> 式 5)デキストラン硫酸の量 (μ L) =<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq5.jpg">
</li>
</ol>7 Mg 枯渇に向かって安定性
<ol><li>4 x 600 μ L Mg 0 バッファー (5 mM トリス、1 mM EDTA と 30 mM NaCl) の DNA 折り紙または対応する polyplex (2 nmol のリン酸を含む) の 20 μ L を洗う限外濾過カラムを用いた (MWCO ~ 3 kDa)。3-5 分の r. t. で 14,000 × g で各洗浄をスピンします。</li>
	<li>残りの溶液 (80 μ L) を収集し、thermomixer で 650 rpm で 1 日, 37 ° C で。</li>
	<li>LPEI polyplex をテストする場合は、16 mM MgCl2の最終的な集中の MgCl2 (500 mM) の 2.5 μ L を追加します。デキストラン硫酸 40 kDa (50 mg/mL) の 7 μ L を追加し、(A と同等/P 1,000) コア DNA ナノ構造を解明する (カプセル化解除、ステップ 6 を参照してください)。 キトサン polyplex または裸の DNA 折り紙を使用注: この手順を省略します。</li>
	<li>ステップ 3 (図 2) で説明した nsTEM イメージングに従ってください。</li>
</ol>8. DNase 私裸の DNA 折り紙ナノ構造の滴定分析
<ol><li>ミックス 3 μ L の 10 倍の 2 μ L で 1 nmol のリン酸塩を含む裸の DNA 折り紙 DNase 私バッファー (100 mM トリス-HCl、25 mM MgCl2, 5 mM の CaCl2、pH 7.6)、1 μ L MgCl2 (250 mM)、0.2 mL PCR の水の 12 μ L のチューブします。DNase の 2 μ L を追加私 (10 倍)。DNase のストック濃度を調整 (10 x) 最終 DNase を取得する私私濃度 0.25 2 U/mL。</li>
	<li>37 ° C、たちで 1-2 時間でサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>氷のサンプルを浸すし、500 mM ジチオトレイトール (DTT) の 2 μ L の追加によって修飾アミノ酸アクティビティを非アクティブ化、グリコールエーテルジアミン四酢酸 (33 mM) の 2.5 μ L。</li>
	<li>手順 3 で説明されているように年齢を使用してサンプルを分析します。</li>
</ol>9. DNase に向かって Polyplexes の安定性私
<ol><li>(異なる N 比で合成したリン酸の 1 nmol を含む) polyplex のミックス 4 μ L (10 倍) をバッファー私、DNase の 1.5 μ L で、TB の 8 μ L と DNase の 1.5 μ I (100 U/mL) 0.2 mL PCR チューブします。</li>
	<li>たちの 37 ° C で 24 時間のサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>プロティナーゼ K (20 mg/mL)、たちの 37 ° C で 30 分間インキュベートする DNase I. を消化するための 2 μ L を追加します。 注: 代わりに酵素消化、DTT (500 mM) の 1.5 μ L 追加して 2 μ L グリコールエーテルジアミン四酢酸 (33 mM) の私が行うことが DNase の停止等化学。</li>
	<li>デキストラン硫酸 40 kda (50 mg/mL) 3.6 μ L を追加 (A に相当/P 1,000) コア DNA ナノ構造を解明します。</li>
	<li>ステップ 3 (図 3 a図 3) で説明した年齢を実行します。新鮮な DNA 折り紙を測定およびゲルのバンド強度を比較するためのコントロールとして含まれます。</li>
	<li>年齢や抽出圧搾による DNA 折り紙のサプライヤーによって提供されるプロトコルに基づいて抽出列を固定バンドを切除します。</li>
	<li>ステップ 4 (図 2) で説明されているように nsTEM イメージングを従ってください。</li>
</ol>10. 安定性ウシ胎児血清 (FBS) の方
<ol><li>TB + 10 μ L で裸の DNA 折り紙や (リン酸の 1 nmol を含む)、対応する polyplex のミックス 4 μ L FB 0.2 mL PCR の管します。新鮮な解凍 FBS を使用します。</li>
	<li>37 ° C 24 時間サーマルサイクラーにサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>氷浴でサンプルを浸します。</li>
	<li>Polyplex をテストした場合、カプセル化解除プロセスを実行するには、デキストラン硫酸 40 kda (50 mg/mL) 3.6 μ L を追加します。さらに、キトサン polyplexes (ステップ 6.3 を参照) を使用して場合水酸化ナトリウムを追加します。</li>
	<li>手順 3 で説明されているように、時代を実行します。新鮮な DNA 折り紙を測定およびゲルのバンド強度を比較するためのコントロールとして含まれます。</li>
	<li>年齢にバンドを消費税し、スクイズ凍結抽出列によって DNA 折り紙を抽出します。</li>
	<li>0.2 mL PCR チューブで抽出された DNA 折り紙ソリューション (20 μ L) にプロティナーゼ K の 2 μ L (20 mg/mL) を追加します。ナノ構造にバインドされている血清タンパク質を消化するたちで 37 ° C で 30 分間インキュベートします。</li>
	<li>16 mM MgCl2遠心列の使用を含む TB の 5 x 500 μ L のサンプルを洗う (MWCO 〜 100 kDa), プロテイナーゼ K を洗う (MW ~ 28.9 kDa) 離れて。3-5 分の r. t. で 14,000 × g で各洗浄をスピンします。</li>
	<li>NsTEM イメージング手順 4 (図 3) に記載されているを実行します。 注: ステップ 10.6 からのゲルの抽出されたサンプルは、直接 nsTEM イメージングのため使用する可能性があります。しかし、イメージングは血清蛋白の DNA 折り紙ナノ構造への愛着のため非常に困難かもしれない。したがって、イメージング プロセスを容易にするためには、プロテイナーゼ K 処理 (手順 10.7 10.9) の使用をお勧めします。</li>
</ol>11. 西洋わさびの過酸化酵素酵素 (HRP) のアドレスの指定可能性をテスト-ポリカチオンとコーティング時に DNA 折り紙を官能基化
<ol><li>ステップ 2 で説明したように自己組織化ビオチン化-NR (ビオチン NR) を浄化します。</li>
	<li>精製ビオチン NR の 200 μ L を孵化させなさい (36 nM、16 mM で補った TB バッファー) HRP 標識ストレプトアビジンの 200 μ L で (540 TB バッファー内の nM)。14 mM の最終的な集中に MgCl2 (500 mM) の 4.8 μ L を追加します。R. t.、thermomixer で 650 rpm で 12 時間インキュベートします。</li>
	<li>HRP 修飾 NR (HRP NR) 非連結の HRP 酵素を削除する (前述の手順 2) に、ペグの精製法による浄化します。16 mM MgCl2を含む TB で沈殿した HRP NR を再懸濁します。</li>
	<li>精製された HRP NR のミックス 6.5 μ L (36 nM) 1、2、4、10、20 (式 3を使用して) の N 比で polyplex を準備するバリアント濃度ポリカチオンの 6.5 μ L で。</li>
	<li>非ビオチン化 NR に 11.2 11.4 手順を繰り返します。HRP の酵素が DNA 折り紙, 非ビオチン化 DNA 折り紙に非具体的バインド HRP 酵素とペグと扱われますが精製 (ビオチン NR に類似)、試金の制御となります。</li>
	<li>1、2、4、10、20 の N ・ P 比率に対応するバリアントの濃度のポリカチオンの 6.5 μ L で蒸留水のミックス 6.5 μ。論文サンプルは、空のグループとして機能します。</li>
	<li>11.4 11.6 (12.5 μ L) の手順で調製した溶液を HEPES 緩衝液の 72.5 μ L を含む 96 ウェル プレートに追加 (25 mM 20 mM 200 mM の NaCl、KCl HEPES 0.05% トリトン X-100, 1 %dmso、pH 7.4) とよく混ぜます。</li>
	<li>2, 2'-児島-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (15 mM) の 10 μ L を追加します。</li>
	<li>H2O2 (12 mM) の 5 μ L を追加し、上下にピペッティングでよく混ぜます。H2O2は反応を開始します。</li>
	<li>421 で吸光度を測定 nm マルチモード プレート リーダー (図 4 a) で 4 h 以上。</li>
</ol>12. ヘミン結合アプタマー (HBA) のアドレスの指定可能性をテスト-ポリカチオンとコーティング時に DNA 折り紙を官能基化
<ol><li>ステップ 2 で説明したように HBA 官能基化-NR (HBA NR) を浄化します。6 mM MgCl2 (HBA NR の集約に高い鉛塩濃度) を添加した TB で沈殿した HBA NR を再懸濁します。</li>
	<li>HBA NR のミックス 10 μ L (40 nM) 1、2、10 および 20 の N ・ P 比率の polyplex を準備するさまざまな濃度でポリカチオンの 10 μ L で。</li>
	<li>裸 NR のミックス 10 μ L (40 nM) または 1、2、10 および 20 の N ・ P 比に対応するさまざまな濃度でポリカチオンの 10 μ L の蒸留水。</li>
	<li>HEPES 緩衝液 60 μ L を含む 96 ウェル プレートに 12.2、12.3 の手順から 20 μ L を準備ソリューションの追加 (25 mM 20 mM 200 mM の NaCl、KCl HEPES 0.05% トリトン X-100, 1 %dmso、pH 7.4) とよく混ぜます。水 (12.2、12.3 の手順) から 20 μ L の polyplex またはポリカチオンのソリューションに置き換えるを少なくとも 1 つの空白のサンプルがあります。</li>
	<li>ATBS (15 mM) を 10 μ l 添加に続いてヘミン (0.04 mM) の 5 μ L を追加します。5 分間軌道シェーカーにプレートを配置します。</li>
	<li>H2O2 (12 mM) の 5 μ L を追加し、上下にピペッティングでよく混ぜます。</li>
	<li>マルチモード プレート リーダー (図 4 b) と 421 nmover 30 分で吸光度を測定します。</li>
</ol>

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</ol>

著者はこの報告に関連する利益相反を宣言しません。

自己集合 DNA 折り紙の定番のストランドに通常追加される 5-10 過剰率で足場。ポリカチオンとフォーム polyplexes monometer 範囲で DNA 折り紙 polyplexes から分離することは困難で、さらに、これらの余分な短鎖連結もできます。したがって、polyplex の形成の重要なステップは、余分な短繊維を削除し、よく精製 DNA 折り紙ナノ構造体を使用します。
他の方法は、クリック反応26を介して DNA 鎖の環化など DNA ナノ構造を安定化するために開発されています。アルキンとアジド変更短鎖はインタロックされた単一座礁させたリングの形成に必要で、この手法はこのような DNA のカテナン、小さなナノ構造の安定化のために限られた、それは容易に大きい DNA 折り紙のスケーラブルではありません。このプロトコルで使用されるような構造。最近、Gerling et、l.27コバレントマテリアル シクロブテン ピリミジン二量体 (CPD) 紫外線照射による DNA ナノ構造内の隣接 thymidines 絆を作成するための手法について報告します。このメソッドは、サイト選択的かつスケーラブルな DNA 折り紙を保護する上での効率がポリカチオン コーティングよりはるかに低いです。たとえば、CPD 安定 DNA 折り紙オブジェクトに耐える 0.4 U/mL DNase 私は 1 h の polyplexes が安定した 10 U/mL DNase の存在下で私、少なくとも 1 日だけ。
簡単に言えば、遺伝子療法に影響を与えたキトサンと LPEI コーティングは、低コスト、ワンステップと Mg 消耗され、ヌクレアーゼ リッチ メディアで DNA 折り紙ナノ構造の長期的な安定性に対処するための効率的な方法です。Polyplex 形成の可逆性を容易に修飾アミノ酸分解や塩枯渇に対する DNA 折り紙の保護は 1 つの手順で重要ですが、DNA など他のステップで問題が発生する可能性があります、マルチ ステップ診断テストへの応用増幅。また、ポリカチオン コーティング、薬物送達アプリケーション28DNA 折り紙ナノ構造の細胞内取り込みを強化するため潜在的なアプローチです。

DNA は、プログラム可能な自己組織化ナノ構造1の多彩な建物ブロックです。DNA ナノ構造を作成するための最も人気のある方法は DNA の折り紙の技術に基づいている、自己集合長円形、単一鎖 DNA の短い合成形状決定の定番の何百もの助けを借りて足場ストランド2。今日では、ほぼ任意の形状と形態の DNA ナノ構造の創製は容易に可能です。DNA ナノ構造は、高精度3,4 site-specifically 機能することができ、アロステリック構造変化5,6を受けることをプログラムすることができます。したがって、建築材料として DNA を用いたバイオセンシング、診断、薬物送達用プログラマブルと応答のカスタム設計されたナノを作成するユニークな機会を提供しています。ただし、DNA ナノ構造体、エキソ- と遠藤による消化を受けやすい-高塩分バッファー必要になります一般的に核酸と 3 D の DNA 折り紙ナノ構造の格子ベース (例えば、5-20 mM Mg+2) 維持するために、。整合性7,8。
核酸血液や細胞外マトリックスに存在によって DNA の急速な劣化は、遺伝的製品の効率的な体内配信セル9への大きな障害です。非ウイルス性遺伝子導入では、この制限を克服するために DNA は定義された N ・ P 無料 (DNA のリン酸塩にポリカチオンのアミンの比)10でカチオン性ポリマーと混合されます。カチオン性ポリマー、polyplex、として知られていると DNA の複合体の劣化はヌクレアーゼを介した DNA を保護し、その細胞内取り込み11を高めます。遺伝子配達進歩、oligolysine12、oligolysine ポリエチレン グリコール (PEG) 共重合体13、論文ポリエチルメタクリ 2-ジメチルアミノ-) (PDMAEMA) に触発されて-ベースのポリマー14とウイルス キャプシド蛋白質15DNA 折り紙ナノ構造の安定化に使用されています。
最近では、Mg 枯渇 DNA 折り紙ナノ構造の保護法を報告した、天然カチオン性多糖類キトサンおよび合成の線形ポリエチレンイミン (LPEI) を用いたヌクレアーゼ リッチ メディアは報告された16。この記事は、以前の適応 polyplexes、特性評価、減塩やヌクレアーゼ リッチ メディアで裸で保護されたナノ構造の安定性のテストを調べることの準備のための詳しいプロトコルについて説明します、ポリカチオン コーティング時の DNA 折り紙のナノ構造の酵素とアプタマー修飾のアドレス。

<table><tbody><tr><td>10回;DNase I 反応バッファー</td><td>ニューイングランド バイオラボ (NEB)</td><td>B0303</td><td></td></tr><tr><td>ABTS (2&prime;-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸) ジアンモニウム塩)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J65535</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 超遠心カラム</td><td>メルクミリポア</td><td>UCF500308、UCF510024</td><td></td></tr><tr><td>キトサン オリゴ糖乳酸 (Mn ~ 4000-6000、> 90% 脱アセチル化、60% 組成オリゴ糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>523682</td><td></td></tr><tr><td>デザイン専用ステープルストランド</td><td>インテグレートDNAテクノロジーズ (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デキストラン硫酸ナトリウム塩 (Mr ~ 4 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75027</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン硫酸ナトリウム塩 (Mr ~ 40 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42867</td><td></td></tr><tr><td>DNA ゲルローディング色素 (6&times;)</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (RNase free)</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>M0303</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N&prime;,N&prime;-四酢酸 (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) BioUltra, 無水, &ge;99% (滴定)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Freeze'N Squeeze DNA ゲル抽出 スピンカラム</td><td>Biorad</td><td>7326165</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9039</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>水素ペロワクスデ slution (32 wt%)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>LPEI-25 kDa</td><td>Polysciences, Inc</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGEサンプル還元剤(500 mMジチオスレイトール(DTT))</td><td>ThermoFischerシーンティフィ</td>ック<td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール(PEG、MW~8000 Da)</td><td>カールロス</td><td>O263.1</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレン、線形、平均10,000、PDIおよびle;1.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>765090</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレン、線形、平均 Mn 5,000、PDI &le;1.3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>764582</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K溶液(20 mg / ml)</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>AM2548</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン結合HRP</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>N100</td><td></td></tr><tr><td>SYBER安全DNAゲル染色</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>S33102</td><td></td></tr></tbody></table>

遺伝子療法ポリカチオン コーティングに影響を与えた dna 折り紙ナノ構造体の保護

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

DNA 折り紙ナノ構造は、生物学および医療アプリケーション用に巨大な潜在性を保持します。ただし、低塩分条件と生理流体核酸変性および自己組織化 DNA ナノ構造体の劣化を誘発します。非ウイルス性遺伝子導入 DNA の酵素的分解は、カチオン性シェルで負荷電 DNA のカプセル化によって圧倒されます。ここで、遺伝子配達の進歩は、単純な触発ワンステップと堅牢な方法論が提示 DNA 折り紙ナノ構造の安定化のためキトサンおよび線形ポリエチレンイミンでコーティングすること。ポリカチオン コーティングは効率的に DNA 折り紙系ナノ構造 Mg 枯渇やヌクレアーゼ リッチ ・ メディアを保護します。このメソッドでは、酵素とアプタマーを用いた DNA ナノ構造体の高機能化による駆動も保持されます。

ナノロッド (NR)、nanobottle (NB) とワイヤ フレーム ナノ構造 (WN) が (ナノ構造の 3 D モデルは図 2に示す) を含む、さまざまな構成の 3 つの DNA 折り紙ナノ構造が設計されていた。NR と NB それぞれスクエア、ハニカム格子に基づいて設計された、ダイダロス ソフトウェア18を使用して作成された caDNAno17とワイアードを使用します。包括的なプロトコル設計と DNA ナノ構造体の自己集合となっていますすでに19,20,21,22を公開します。ストランドを命じられた、自己組織化と更に精製図形固有の主食はスタールらによって記述されたプロトコルに基づいています。23 (ステップ 2)。
Polyplexes は、ゲルの遅滞試金および nsTEM イメージングにより特徴づけられた.ポリカチオンと DNA 折り紙の混合、時に陰極の方裸ナノ構造帯シフト (図 1A) を認めた.これは、リン酸塩複合体の増加ポリカチオンと全体的なサイズへのバインド時にグループの負の電荷の対抗に起因することができます。デキストラン硫酸などポリアニオンの余分な量を追加する polyplex 形成を逆転できます。において, より高い分子量デキストラン硫酸 (MW 〜 40 kDa) 低分子量デキストラン硫酸と比較して decomplexation より効率性を示した (MW ~ 4 kDa) (図 1B)。
ウラニル酢酸負染色 TEM で LPEI polyplexes をイメージしながら任意の粒子をイメージすることは困難だった。仮説その LPEI DNA 折り紙のタイトなシールドによるリン酸塩のバックボーンにバインドから酢酸ウランを妨げる可能性があります。したがって、nsTEM イメージングの前にデキストラン硫酸塩の過剰量はきは polyplexes に追加されました。解明 DNA 折り紙ナノ構造欠陥も分解の兆候を示した。逆に、キトサン polyplexes 正常に撮像した polyanion 治療 (図 2) の必要はありません。
NsTEM イメージングによって確認された (彼らの異なる構成) に関係なくすべての裸の DNA ナノ構造は Mg 0 バッファー内の 37 ° C で培養 1 日後に完全に変性だった対照的に、LPEI または N/P≥1 でキトサンをコーティングしたナノ構造はそのまま残った。同様に、DNase 私滴定試金は酵素消化に向けて無防備なナノ構造体の感受性を示した。裸のナノ構造は 2 h、きまたはキトサン カプセル化 DNA 折り紙後泊まった内にそのまま 1 U/mL DNase の存在下で完全に消化された中 Mg 0 バッファーで補完 10 U/mL DNase 私を最低 1 日 (図 2)。修飾アミノ酸消化に向けて高い安定性は、N ・ P、polyplexes 比を増やすことによって達成されました。さらに、LPEI を保護する (図 3A図 3C)、キトサンと比較して効率的に DNA ナノよりおそらくきは、およびこうして、DNA24 への高い結合親和性の高い電荷密度のため.分子量の異なるの LPEI を使用している間差は認められなかった(図3B)。
高分子シェルでカプセル化した DNA ナノ構造機能グループのアドレスは重要な機能です。さらに、西洋わさびの過酸化酵素酵素 (HRP) とヘミン結合アプタマー (HBA) 修飾 DNA 折り紙ポリカチオン コーティングの互換性を検討しました。3 つのビオチン化短鎖 NR の面からはみ出した、HRP 標識ストレプトアビジン (DNA 折り紙あたり 3 酵素)、修飾します。高触媒活性 (Kd: 439 nM) HBA アプタマー PS2。M (5'-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3')25これらの実験ののために選ばれました。24 ステープル繊維まで長 5 nm リンカーと NR 面からはみ出したいた (5'-AAAAGAAAAGAAAAA-3') ps 2 版の順。M シーケンス (DNA 折り紙あたり 24 アプタマー)。酵素の顕著な支障のないアプタマー活動を HRP または HBA 修飾 DNA 折り紙 LPEI とバリアント N ・ P 比 (図 4A B)16でキトサンをコーティング時に観察したか。ただし、HRP の酵素の速度論的、劇的に変わりました DNA 折り紙 (図 4C) にバインドした後。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig1.jpg"> 図 1: Polyplex の形成およびカプセル化解除の時代の代表的なイメージ。(A) NB の電気泳動の移動性シフト試金は 0.01 8 の N 比でキトサンと混合します。各車線に 1 nmol 注意が含まれています最初のレーンは、参照注意です。(B)はポリアニオン デキストラン硫酸 (DS) によって polyplexes のカプセル化解除。この図は、以前に公開された図16から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig2.jpg"> 図 2: DNA 折り紙と polyplexes のネガティブ染色 TEM 顕微鏡写真。裸の DNA 折り紙ナノ構造 (列 1 および 2) の 3 D モデルと nsTEM 顕微鏡写真。nsTEM LPEI polyplexes (後にカプセル化解除) とキトサン polyplexes (列 3 と 4) の顕微鏡写真。裸で保護された DNA 折り紙 (polyplex) の nsTEM 画像を受ける Mg 枯渇 (5、6、7 の列)、酵素分解 (列 8 および 9)、37 ° C で 1 日血清消化 (10 と 11 の列)LPEI 5 kDa は、この試金で使用されました。裸の DNA ナノ構造劣化が見られた 1 U/mL DNase の存在下で年齢検出を超えて私 TB + 10%、37 ° C で 2 時間後 FBSスケール バー: 100 nm。この図は、以前に公開された図16から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig3.jpg"> 図 3: DNase の代表の結果私の保護試金。(A) DNase 私 LPEI 5 kDa、LPEI 10 kDa N/2、4、8 および 10 の比で作製した LPEI 25 kDa と WN の polyplexes のための保護試金。サンプルは 10 U/mL DNase を受けた私は 37 ° C で 24 時間の最後のレーンは、WN のコントロールです。Polyplexes は、ゲルにロードする前に互換だった。年齢イメージ A. から抽出した(B)正規化された平均バンド強度の異なる DNA 平坦の polyplexes の LPEIY 軸は正規化された平均バンド強度を表します。(C) 、DNase 私 N ・ P 1、2、4、10、20 の比率を用意してキトサン WN polyplexes の保護試金。サンプルは 10 U/mL DNase を受けた私は 37 ° C で 24 時間の車線 6 は制御 polyplex (N ・ P 20) です。最後のレーンは、WN のコントロールです。すべてキトサン polyplexes はゲルにカプセル化解除される事前読み込み.この図は、以前に公開された図16から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig4.jpg"> 図 4: DNA 折り紙の酵素-アプタマー修飾の比色試金の代表結果。(A)反応開始後キトサン 3.7 h を塗布した酵素修飾ナノ (HRP NR) の比色定量法。(B)反応開始後 6 分キトサンをコーティングしたアプタマー修飾ナノ (HBA NR) の比色定量法。Y 軸は正規化された吸光度を表します。(C)は、時間の経過とともに HRP と HRP NR の比色定量法を監視します。この図は、以前に公開された図16から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>カチオン性ポリマー</td>
			<td>キトサン</td>
			<td>LPEI 5 kDa</td>
			<td>LPEI 10 kDa</td>
			<td>LPEI 25 kDa</td>
		</tr>
<tr>
<td>ポリマー (kDa) の分子量</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>モノマー (g/mol) の生化学重量</td>
			<td>161</td>
			<td>43</td>
			<td>43</td>
			<td>43</td>
		</tr>
<tr>
<td>モノマー当たりのアミンの数</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>高分子あたりアミンの数</td>
			<td>28</td>
			<td>116</td>
			<td>232</td>
			<td>581</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1。ポリカチオンあたりアミン グループの数を計算します。
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>デキストラン硫酸 (kDa) の分子量</td>
			<td>4</td>
			<td>40</td>
		</tr>
<tr>
<td>(G/mol) のモノマーの分子量</td>
			<td>366</td>
			<td>366</td>
		</tr>
<tr>
<td>硫酸塩モノマー当たりの数</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>高分子あたりの硫酸の数</td>
			<td>22</td>
			<td>220</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2。Polyanion あたりの硫酸塩のグループの数を計算します。

ここでは、DNA 折り紙系ナノ構造天然カチオン性多糖類のキトサンと合成線形ポリエチレンイミン (LPEI) コーティングを使用して Mg 枯渇やヌクレアーゼ リッチ ・ メディアを保護するためのプロトコルが表示されます。

遺伝子療法ポリカチオン コーティングに影響を与えた DNA 折り紙ナノ構造体の保護

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...

DNAナノ構造体の生物学的安定化は、標的薬物送達などの将来のインビボ用途に不可欠です。しかし、DNAは様々な酵素によって体内で分解されます。ここでは、酵素分解からDNAナノ構造体を保護するコーティング技術を紹介します。主な利点は、我々のコーティングは、すでに生物に使用されている非毒性化合物を含み、表面の機能化が可能なままであるということです。この機能化は、ターゲット認識のための分子センサーと、医薬品貨物放出用のスイッチを組み込むために重要です。ポリカチエーションコーティングは、カプセル化されたDNA折り紙構造の細胞取り込みが著しく増加するため、この方法は診断および治療におけるDNAオリガミスの適用のための扉を開くことができます。細胞の取り込みは、DNAナノテクノロジーの潜在的な遺伝子送達用途にも必要です。私は、この方法は非常に簡単で、簡単に習得できると考えています。まず、精製されたDNA折り紙の濃度を測定する。紫外線分光光度計を校正するために、ブランクとして2マイクロリットルのTBバッファーを使用してください。そして、260ナノメートルでDNA折り紙濃度を測定します。次に、精製されたDNA折り紙溶液中のリン酸塩の量を、原稿に記載されているように式2を用いて計算する。1つのナノモルのリン酸塩を含み、希釈用の結核バッファーを用いて、DNA折り紙構造の15マイクロリットルを調製する。13.2マイクロリットルを1.8マイクロリットルのキトサンにTBに加えます。そして、15マイクロリットルのDNA折り紙にキトサン溶液を15マイクロリットル加え、N/P比8のDNA折り紙キトサンポリプレックスを開発する。原稿に記載されている計算を使用して、異なるN/P比のポリプレックスを準備し続けます。2%アガロースゲルのためのチューブの80ミリメートルを調製します。塩化2.5モルの塩化マグネシウム352マイクロリットルを加え、10マイクロリットルのDNAゲル染色で予染色します。乾燥したゲルボックスにゲル溶液を注ぎます。ゲル電気泳動コームを挿入し、室温で15〜30分間固めます。一方、11ミリモル塩化マグネシウムでランニングバッファを補います。各サンプルの10~20マイクロリットルを6Xの負荷バッファの20%と混合します。コントロールとして裸のDNA折り紙を含むアガロースゲルウェルにサンプルをロードします。ゲルを室温で70ボルトで2時間半から3時間動かします。次に、UV スキャナを使用してゲルを視覚化します。DNase I保護アッセイを実行するには、異なるN/P比で比較した各ポリプレックスの4マイクロリットル、10X DNase Iバッファーの1.5マイクロリットル、8マイクロリットルの結核、および1.5マイクロリットルのDNase Iを別々の2ミリリットルPCRチューブに加えます。その後、サーモサイクラーで摂氏37度で同じを24時間インキュベートします。DNase Iを消化するには、1ミリリットル当たり20ミリグラムの2マイクロリットルをプロテナーゼKに加え、サーモサイクラーで摂氏37度で30分間インキュベートします。次いで、コアDNAナノ構造体を解明するために、1ミリリットル当たり50ミリグラムの3.6マイクロリットルを40キロダルトンデキストラン硫酸塩を添加する。次に、これらのサンプルと新鮮なDNA折り紙を制御として使用し、前述のようにアガロースゲル電気泳動を行う。ゲルからロードされたサンプルに対応するバンドを物品化します。DNA折り紙を抽出するには、スクイーズ凍結抽出カラムを使用し、製造業者の指示に従い、原稿に記載されているように負の染色透過電子顕微鏡イメージングを続けます。精製された36ナノモルHRP-NRの6.5マイクロリットルを、様々な濃度のポリカチ処理の6.5マイクロリットルと混合します。1、2、4、10、および20のN/P比でポリプレックスを調製するには、6.5マイクロリットルの蒸留水を、1、2、4、10、および20のN/P比に対応する様々な濃度のポリカレーションの6.5マイクロリットルを混合してブランク基を調製する。次に、これらの調製された溶液のそれぞれ12.5マイクロリットルを96ウェルプレートの別々のウェルに加えます。その後、各ウェルにHEPESバッファーの72.5マイクロリットルを追加し、混合します。15ミリモルABTSの10マイクロリットルを加え、12ミリモル過酸化水素を5マイクロリットルずつ各ウェルに加え、上下にピペットで混ぜます。最後に、マルチモードプレートリーダーを使用して、4時間にわたって421ナノメートルの吸光度を測定します。ゲル遅延アッセイを用いてポリプレックスを解析した後、ポリケーションに結合する際のリン酸基の負電荷の逆平衡化と複合体のサイズ増加により、裸のナノ構造が陰極に向かってシフトした。余分な量のポリアニオン(硫酸デキストランなど)を添加した場合、ポリプレックス形成が逆転した。より高分子量のデキストラン硫酸は、より低分子量に比べてより効率的であることが示された。負の染色透過電子顕微鏡を用いてポリプレックスを分析した後、顕微鏡写真は、裸のDNA折り紙ナノ構造、脱カプセル化後の線形ポリエチレンイミンポリプレックス、キトサンポリプレックス、裸で保護されたDNA折り紙の画像をマグネシウム枯渇、酵素分解、血清消化を示した。DNase Iの存在下では、2時間後に裸のナノ構造が完全に消化されたのに対し、キトサン封入DNA折り紙の直鎖ポリエチレン化ポリプレックスは、1ミリリットル当たり10単位のDNase I.Linearポリエチレンイミンポリプレックスの存在下でそのまま残り、キトサンと比較してより効率的にDNAナノ構造を保護した。ポリプレックスのN/P比が大きくなると、DNA消化が低くなった。酵素をコーティングした後、またはより機能的なDNA折り紙の後、変異型N/P比で直鎖状ポリエチレン化ポリプレックスおよびキトサンを有し、酵素活性に顕著な干渉は認められなかった。一方、HRP酵素の動態はDNA折り紙に結合した後に劇的に変化した。よく精製されたDNA折り紙構造から始めるのが重要です。ポリカチにも結合できる安定したストランドが存在する。それらはDNA折り紙ポリプレックスから分離することは困難である。当社のコーティング分子は、遺伝子治療用途にも使用されています。これは、DNAナノ構造が将来、生物のゲノムを改変するために使用できることを意味します。アガロースゲル染色の場合、通常、DNAをインターカレートする分子が使用され、変異原性を有する可能性がある。DNA染色の際は、研究室の安全指示に従ってください。

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