Name: プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: 学ぶ細菌病原体の細胞外排出効率を評価するin vitroおよびin vivo感染アッセイ法。この手法は宿主細胞内で増殖する病原体の挙動解析に有用です。

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ケアのため、すべての適切な政府ガイドラインに従ってマウスが人道的扱われ、国立衛生研究所の実験動物の使用とその使用方法は、この全体の研究のためのマイアミ大学の制度上の動物の世話が承認されましたおよび使用委員会 (プロトコル 16 053)。
1. 感染症の細胞を準備
<ol><li>DMEM 培養培地 10% 牛胎児血清 (今後 DMEM/FCS と呼ばれる) でマウスのマクロファージ様細胞ライン未加工 264.7 の伝達 125 mL フラスコと 37 °C/5% CO2で維持培養インキュベーターを使用しています。</li>
	<li>感染前に、の日は、拡張フラスコからセルを削除し、15 mL スクリュー キャップの円錐管の収集に細胞スクレーパーを使用します。800 x gで 10 分間で細胞を遠心、上清をデカントし (抗生物質) なし DMEM/FCS の 1 mL の細胞ペレットを中断し、検定または自動化された細胞カウンターを使用して抗体価を決定します。</li>
	<li>
2 x 106セル/mL に価を調整し、48 ウェル培養皿の井戸に 0.10 mL (2 x 10 の5セル) を追加します。細胞懸濁液が井戸の表面全体をカバーすることを確認します。
	<ol>
<li>プレート細胞調節されたメディアの後でソースの追加の井戸。また 'ないセル コントロール' として機能する 3 つの追加井戸に DMEM/FCS の 0.10 mL を配置します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>37 °C/5% CO2で組織文化のインキュベーターで一晩インキュベートします。菌接種が準備し、使用する準備ができているまで、インキュベーターから次の日には取り外さないでください。</li>
</ol>2. 感染症のリステリア菌(Lm) を準備します。
<ol><li>たてすじの寒天から単一コロニー脳心臓注入 (BHI) 2 mL を接種する (< 2 日) Lmの 130 回転/分の振動で 37 ° C で一晩インキュベートし、。</li>
	<li>次の日、追加 2 mL に一晩文化の 0.10 mL BHI で加温し、光学濃度 (OD600) が 0.4 と 0.6 まで揺れで 37 ° C で培養を続けます。</li>
	<li>経験的派生変換式を使用しておおよその細菌抗体価を決定します。私たちの研究室で BHI で指数関数的に成長のLm文化は約 1.3 × 109コロニー形成単位 (CFU)/OD600。細菌文化は、部屋の温度にさらされている時間の量を最小限に抑えます。</li>
	<li>感染の直前に 5 × 107 CFU/mL の希釈剤として予め温めておいた DMEM/FCS を使用して力価を調整します。</li>
</ol>3. 感染症
<ol><li>20 μ L を追加作業迅速かつ正確には、(1 x 106 CFU; MOI 感染症の多様性 = 5) 皿の少し傾斜上を覆うメディアのピペット先端部を慎重に配置することによって井戸に出来立てLm接種 (2.4 上記のステップ) の 注:ピペット先端部の井戸の壁には触れないでください。</li>
	<li>優しくをピペットで移しなさいように各ウェルの内容完了混合;振る、これが井戸の壁上のLmを分散大幅プレートを傾斜したりしないでください。細胞培養ディッシュを 37 °C/5% CO2インキュベーターに戻ります。</li>
	<li>感染していない井戸から調節されたメディアを使用して希釈液として 10 μ g/mL ゲンタマイシン溶液を調製します。</li>
	<li>30 分で感染症 (mpi) の記事、慎重にゲンタマイシン液 (最終濃度 2.5 μ g/mL) と優しくピペット 30 μ L に 37 °C/5% CO2インキュベーター戻り細胞培養ディッシュ、前に同様の内容を追加します。</li>
	<li>60 mpi で (それぞれ 4、5 のセクションで後述) として CFU の試金 (60 mpi 時点) または FCM 解析のいずれかの適切な井戸を収穫します。</li>
	<li>残りの井戸、ゲンタマイシン無料エアコン メディアの 150 μ L で取り外して交換井戸からメディアが完全する前に、または、 Lm出現の試金のための細胞を収穫どちらかその後の様々 な時。</li>
</ol>4. サンプリング CFU アッセイによる細胞内と創発のLmの処理と解析
<ol><li>収穫、料理を少し傾けるし、井戸からメディア全体を慎重に取り外します。井戸に 0.50 mL 滅菌蒸留水 (dsH2O) を追加します。30 後 s、結果水のライセートを転送 (100) 1.5 mL 容マイクロ チューブと精力的に 10 の渦に s。</li>
	<li>準備 10-1および 10-2希薄か 4.5 μ L または dsH2O の 450 μ L に溶解水の 50 μ L と簡単に渦徹底的な混合を確実を追加します。</li>
	<li>10 の 50 μ L を広めるホストゲノム スープ (LB) 寒天培地プレート 10-2サンプルや 10-1 0。</li>
	<li>創発的Lm (3.6 上記のステップ) の試金し、オーバーレイするメディアの 10 μ L を削除 2 つ 5 μ 因数に分割: 1 つの因数を追加 DMEM/FCS と 2 番目の約数を 5 μ L 5 μ G/ml ゲンタマイシンを含む DMEM/FCS の 5 μ L を追加。後者のコントロールを区別細胞外Lm (機密ゲンタマイシン) と細胞内Lm (ゲンタマイシン耐性) 以降 CFU で試金。</li>
	<li>室温で 5 分後に LB 寒天培地プレート上 dsH2O、10 s は積極的に渦の 90 μ L と拡散 50 μ L を追加します。</li>
	<li>次の 2 日の 37 ° c. で孵化 LB 寒天培地プレート上のLmコロニーを列挙します。</li>
</ol>5. サンプリング処理とフローサイトメトリー (FCM) による細胞内と創発のLmの解析
<ol><li>1.1 4 の手順で説明するように、未加工 264.7 のセルを準備します。1 x 106セル/mL にセルを調整し、6 ウェル培養皿の井戸に 1 mL (1 x 10 の6セル) を追加します。</li>
	<li>2.1 2.3 の手順で説明するように菌接種を準備し、50 (5 x 107 CFU) の慣性モーメントに対応する接種量と細胞に感染します。</li>
	<li>1.5 時間ポスト感染 (hpi)、井戸の最初のセットからメディアを収集し、すべての井戸が処理されるまで 4% パラホルムアルデヒド (PFA)、氷の上の場所の 500 μ L で 1.5 mL 遠心チューブに配置。</li>
	<li>細胞内Lmを収集するために井戸の中に、60 歳以降後に dsH2O の 1 mL を追加 s、4% の 500 μ L で 1.5 mL 遠心チューブに生じる水ライセートを転送 PFA。10 s およびすべての井戸が処理されるまで氷の上場所は積極的に渦。(サンプル処理は 5.8 以下の手順で説明します)。</li>
	<li>残りの井戸のメディアを取り出し、細胞外Lmを殺すために、速やかに細胞をインキュベーターに戻ります 5 μ G/ml ゲンタマイシンと DMEM/FCS の 1 mL に置き換えます。</li>
	<li>30 分 (2 hpi) 後にメディアを取り出し、ゲンタマイシンなし DMEM/FCS に置き換えます。</li>
	<li>2 と 4 h (4 と 6 の hpi) 後 2 番目と 3 番目 5.3 および 5.4 の手順としてメディアと溶解液を集めることによってポイントを時間します。</li>
	<li>不穏なペレットなし 7 分削除清 10,000 x gでチューブを遠心します。</li>
	<li>4% の 50 μ L のカクテルを染色でペレットを中断 PFA とファロイジン 15 μ L。4 ° C、20 分で暗闇の中のチューブを孵化させなさい。</li>
	<li>孵化後各管し、ミックスを上下にピペット 1 mL の FACS バッファーを追加します。</li>
	<li>不穏なペレットなし 7 分削除清 10,000 x gでチューブをスピンします。</li>
	<li>すぐに使用、FACS バッファーの 400 μ L または FACS バッファーの 200 μ L、200 μ L 4% のペレットを中断 PFA を後で分析を格納する場合。</li>
	<li>Cytometry 流れのサンプルを実行し、収集されたデータを分析します。</li>
</ol>6. サンプリング処理とLm植民地化し、肝臓でのホスト応答の解析
<ol><li>2.1 2.3 の手順で説明するよう、感染症のLmを準備します。</li>
	<li>3 × 106 CFU/mL の希望価のサブカルチャーの必要量を計算します。</li>
	<li>感染の直前に計算される細菌で予め温めておいたハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) 1 mL の最終巻での量を希釈します。これは、マウスに注入される入力の接種です。</li>
	<li>28 G½ 100U インスリン注射器を使用して、入力菌の 100 μ L (3 x 105 CFU) を描画し、目に見える空気の泡を削除します。</li>
	<li>持株拘束にマウス (緊張 C57BL/6; 6 および 12 週古い間の男性) を配置、尾静脈を拡張する暖かい水 (45 ° C 以上) を使用し、入力の接種を静脈に注入します。</li>
	<li>プレート 10-2と LB 寒天の 10bcm に入力の接種の 10-3希薄と実際の入力の量を決定するための 37 ° C で一晩インキュベートします。</li>
	<li>18 hpi の人道的安楽死させるマウス (CO2窒息頚部転位続いて) と外と内のピンセットとはさみの別のペアを使用して肝臓の前頭葉を収集する滅菌はさみカット オープン マウス腹膜を使用マウス。6 cm シャーレ氷の上に肝臓を配置します。</li>
	<li>小さなキューブに肝臓を切り取り、電磁攪拌棒とガラスの瓶に。2 mg/mL コラゲナーゼ FCS なし DMEM で再構成した D の 2 mL を追加します。マグネチックスターラー 30−45 分の 37 ° C でバイアルを孵化させなさい。組織をホモジナイズ DMEM/fcs、コラゲナーゼを不活化する 3 mL を追加します。</li>
	<li>セルを 70 μ m セル ストレーナーより DMEM/FCS を必要に応じて追加、円錐管にフィルターします。</li>
	<li>10 分のための 4 ° C でペレット、上清を除去および赤血球を溶解する ACK バッファーの 500 μ L の細胞ペレットを中断する 800 x gで細胞を遠心します。</li>
	<li>セル ACK バッファーで 5 分間室温で孵化させなさい。DMEM/FCS の 1 mL の細胞を中断します。</li>
	<li>4 ° c 10 分のペレット、上清を除去および DMEM/FCS の 1 mL に中断する 800 x gで細胞を遠心します。次に、診断または自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。</li>
	<li>餌のためにスピンして 1.5 mL 遠心チューブに 1 x 10 の6セルを転送します。DsH2O と、細胞を溶解する渦の 1 つの mL で、停止します。原液で LB プレートに 50 μ L および 10-2希薄をプレートし、CFU 解析のLmを列挙する 37 ° C で孵化させなさい。</li>
	<li>セルのカウントによると各組織サンプルの FACS チューブに 1 x 10 の6セルを転送し、FACS バッファーの 1 つの mL で洗います。</li>
	<li>800 × g 10 分のための 4 ° C でペレット、上清を除去し、細胞を遠心します。</li>
	<li>各抗体および FACS バッファーの推奨濃度に基づく興味の抗体を含む抗体カクテルを準備します。分析で使用推奨量の材料表を参照してください。</li>
	<li>抗体カクテルの 100 μ L でペレットを中断し、30 分のための 4 ° C で暗闇の中のチューブを孵化させなさい。</li>
	<li>インキュベーション後、各管に 2 mL の FACS バッファーを追加し、細胞を中断します。</li>
	<li>4 ° C でペレット、上澄みを廃棄し 800 x gで細胞を遠心します。すぐに使用、FACS バッファーの 400 μ L または FACS バッファーの 200 μ L、200 μ L 4% のペレットを中断 PFA 後保管する場合。</li>
	<li>フローサイトメトリーによる細胞を分析 (手順 5.13 参照)。</li>
</ol>

<ol><li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).</li>
<li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+on+the+inside%3A+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).</li>
<li>Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+impact+of+mutational+activation+on+the+Listeria+monocytogenes+central+virulence+regulator+PrfA%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA.</a> Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).</li>
<li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).</li>
<li>Gregory, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+adhesion+molecules+promote+neutrophil-Kupffer+cell+interaction+and+the+elimination+of+bacteria+taken+up+by+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver.</a> Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).</li>
<li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+trafficking+to+hepatic+sites+of+bacterial+infection+is+chemokine+independent+and+directed+by+focal+intercellular+adhesion+molecule-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression.</a> Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).</li>
<li>Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+from+Both+Susceptible+and+Resistant+Mice+Efficiently+Kill+Opsonized+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes.</a> Infection and Immunity. 86, 00085(2018).</li>
<li>Carr, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+depletion+reveals+a+novel+role+for+neutrophil-mediated+protection+in+the+liver+during+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection.</a> European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).</li>
<li>Blériot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-resident+macrophage+necroptosis+orchestrates+type+1+microbicidal+inflammation+and+type-2-mediated+tissue+repair+during+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection.</a> Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).</li>
<li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+are+the+predominant+cell+type+associated+with+Listeria+monocytogenes+in+the+gut%2C+but+they+do+not+serve+as+an+intracellular+growth+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche.</a> Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).</li>
<li>Agaisse, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li>
<li>Cheng, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).</li>
<li>Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GILT+is+a+critical+host+factor+for+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection.</a> Nature. 455, 1244-1247 (2008).</li>
<li>Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation+of+vacuolar+maturation+promotes+listeriolysin+O-independent+vacuolar+escape+during+Listeria+monocytogenes+infection+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells.</a> Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).</li>
<li>Shrestha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host-encoded+Heme+Regulated+Inhibitor+%28HRI%29+facilitates+virulence-associated+activities+of+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens.</a> PLoS One. 8, 68754(2013).</li>
<li>Bahnan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eIF2%CE%B1+Kinase+Heme-Regulated+Inhibitor+Protects+the+Host+from+Infection+by+Regulating+Intracellular+Pathogen+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking.</a> Infection and Immunity. 20, 00707(2018).</li>
<li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734(2017).</li>
<li>VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Gentamicin+Concentration+and+Exposure+Time+on+Intracellular+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505(2017).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

その迅速かつプロセッシブ細胞感染プログラムLm感染に影響を与える細胞の活動を調査する理想的な病原体です。ホストの要因の数が肯定的または否定的に影響を与えるLm細胞感染11,12,13,14に同定されています。2 つのような宿主因子研究室、パーフォリン 2 とヘム調節剤の特徴 (P2、こんにちは)、 Lmの感染過程の個別の機能を調節します。P2 欠損細胞はLmに非常に敏感、図 3のように、そしてこの高められた感受性はまた P2 ノックアウト マウス4の真実です。P2 表現と P2 欠損マクロファージの詳細な比較研究を示した後者のセルが強く酸性Lmを形成-病原性遺伝子発現を強化につながったファ...

感染症に基づく実験的モデル、ホスト、そして病原体、様々 な病原体の感染戦略と病原体がホスト主導するプロセスに結び付ける難易度の開始状態への依存のために本質的に挑戦結果に基づきます。菌リステリア菌(Lm) の遺伝学的および微生物学的少ない、その迅速かつプロセッシブ細胞感染戦略と比較的明確なのためのに対する宿主の防御をプローブする理想的な病原体となっています。その携帯と生体レベルの感染症の表現型間の関係。Lmの細胞感染を通過 4 段階1: (i) Lm ; 液胞で囲まれた中で結んで細胞浸潤(ii) Lm-液胞膜の溶解と細胞質; にLmの放出を指示(iii) intracytosolic レプリケーションそして (iv) 膜結果直接隣接する細胞 (上皮シートなど) のどちらかの感染または孤独な細胞は細胞外の環境にLmのリリースの物理的な侵入。特定Lmによって促進される、これらの各フェーズ-要因 ('病原因子」と呼ばれる) をエンコードされたが、削除されると、原因の感染欠陥細胞と動物のモデル。この一般的な感染戦略されて独立して進化しているいわゆる '細胞' 病原体2の数によって。
コロニー形成単位 (CFU) 試金は体外の両方を評価するため利用されています (すなわち、細胞) 同様の in vivo (すなわち、,) 感染症の結果。生体内での感染症のために特に感度が高くに加えて CFU の試金は病原体の侵入と細胞の生存/増殖のため明確な読み出しを提供します。CFU アッセイは、感染に影響を与えるLmとホストの両方の細胞の要因を分析するため広く使用されています。これらの先行研究は細胞浸潤と intracytosolic レプリケーションを分析されている有益 CFU の試金、我々 の知識を最大限に使用されていないLm感染プロセスの第 4 段階を追跡する: 細胞エスケープ。ここでは、比較的単純な CFU の試金 (およびフローサイトメトリーによって) (以下、出現') 携帯の脱出の手段を監視ことができ、どのように両方の病原体およびホストでエンコードされた要因の例を示す規制Lm のこの段階について述べる感染サイクル。携帯電話のLm感染サイクル ターミナル相の解析追加病原体および宿主細胞感染特異的因子と活動を識別することが可能になります。

<table><tbody><tr><td>ACKライジング</td><td>バッファーGibco&nbsp;</td><td></td><td></td>A1049201</tr><tr><td>ArCアミン反応性補償ビーズ&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズA10346</td><td></td></tr><tr><td>BHI(ブレインハートインフュージョン)ブロス</td><td>EMDミリポア</td><td>110493</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー、70&マイクロ;m</td><td>VWR</td><td>10199-656</td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼ D</td><td>ロシュ</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM培地&nbsp;</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>FACSチューブ&nbsp;</td><td>BDファルコン</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FBS-熱不活性化&nbsp;</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス'平衡塩溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>LB 寒天</td><td>成長細胞 MS</td><td>MBPE-4040</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 固定可能な黄色の死細胞染色キット&nbsp;</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>L349S9</td><td></td></tr><tr><td>ローダミン・ファロイジン&nbsp;</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャーR415</td><td></td></tr><tr><td>SP6800スペクトルアナライザー</td><td>ソニー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリンジ28 G 1/2 "1cc</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>TPP組織培養48ウェルプレート&nbsp;</td><td>MIDSCI</td><td>TP92048</td><td></td></tr><tr><td>TPP 組織培養 6 ウェルプレート&nbsp;</td><td>MIDSCI</td><td>TP92406</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td>抗原</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = PE Cy5, 希釈率 = 1/100, クローン = M1/70</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = AF 647, 希釈率 = 1/100, Clone = N418</td></tr><tr><td>CD45</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = APC Cy7, 希釈率 = 1/100, Clone = 30-F11</td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8</td></tr><tr><td>Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>フルロクロム=AmCyN、希釈率=1/100</td></tr><tr><td>Ly6C</td><td>バイオレジェン</td><td></td>ド <td>フルロクロム=PacBlue、希釈率=1/200、クローン=HK1.4</td></tr><tr><td>MHC II</td><td>バイオレジェン</td><td></td>ド <td>フルロクロム=AF700、希釈=1/200、クローン=M5/114.15.2</td></tr><tr><td>NK1.1</td><td>バイオレジェンド</td><td></td><td>フルロクロム=BV605、希釈=1/100、クローン=PK136</td></tr></tbody></table>

プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

細菌性病原体が存続し、かつて真核生物の細胞内増殖を採用戦略のさまざまながあります。いわゆる '細胞' 病原体 (リステリア菌赤痢菌、細菌病菌 pseudomallei、野兎病菌、リケッチア属) による感染細胞の細胞質へのアクセスします。物理的に、酵素によってプライマリの液胞膜を分解します。一度、細胞質でこれらの病原体増殖し同様両方新しい細胞を感染させるために宿主細胞の細胞膜を貫通する十分な機械的な力を生成します。ここで、菌、リステリア菌(Lm) の細胞感染サイクルのこの最終段階のコロニー形成単位アッセイとフローサイトメトリーにより定量化することができ、これ両方の病原体およびホストでエンコードされた要因の影響の例を与える方法を紹介します。プロセス。また, Lm感染培養細胞動態の近い対応が生体外で感染しているし、感染肝細胞に由来するマウスの体内.これらの関数に基づく試金は比較的単純であり、真核生物細胞の機能の変調器のための高スループット画面の検出ベース容易に拡張できます。

病原体と感染細胞に影響を与えるホスト エンコード要因の役割を評価します。 上記の感染条件を使用して、入力の野生型Lmの 0.15% は 1.5 h 培養マクロファージ (図 1A) と共同の孵化の後回復します。共同インキュベーション (3 h ポスト感染、hpi) の後続の 1.5 h で実行可能なLmの回復で 4 倍の増加があったし、3 6 hpi から実行可能なLmの回復の追加 7.5-fold 増加があった。以来、細胞外Lmをなくす 1 hpi で共培養する細胞不浸透性の抗生物質のゲンタマイシンを追加すると、1.5 〜 6 hpi の間に実行可能なLmレベルで 30 倍の増加は専ら細胞内増殖を表します。
Lm...

ホスト エンコード要因の活動を分析する使用ことができます両方生体外でそして生体内で感染の試金を記述します。

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

細胞内で複製する微生物病原体は、最終的に感染した細胞から出て行かなければならない。これは、宿主病原体相互作用の他の局面と比較すると、比較的研究が行われている。ここでは、病原体流出を解析する手法について述べている。我々は、比較的単純なアッセイを使用して流出効率を評価するか、またはポスト・エフラックス病原体を特徴付けることができる方法を示す ここで説明する一般的な技術は広く適用可能であるが、特定の病原体宿主細胞モデルは運動、用量、およびおそらく読み出しで異なる可能性がある。実験システムの設定と同様に、実験サンプルやコホートで本物の生物学的プロセスが確実に観察されるように明確な制御が確立することが不可欠です。手順を実証するのは、私の研究室の大学院生であるペトリア・ゲイルです。感染実験から始めるには、ピペットを使用して、準備したてのLm接種物の20マイクロリットルを井戸に加え、皿をわずかに傾け、ピペットチップを慎重に上の媒体に入れます。ピペットチップで井戸の壁に触れないようにしてください。完全な混合を確実にするために、各ウェルの内容物を穏やかにピペット。ウェルの壁にLMを広がらないように、プレートを揺らすか、または大幅に傾けないでください。細胞培養皿を摂氏37度、5%の二酸化炭素インキュベーターに戻す。希釈剤として未感染細胞からのコンディションされた培地を使用して、1ミリリットルのゲンタマイシン溶液あたり10マイクログラムを調製する。感染後30分で、1ミリリットル当たり2ポイント5マイクログラムの最終濃度に達するために、30マイクロリットルのゲンタマイシン溶液を皿に慎重に加える。ウェルの内容物を軽くピペットし、培養皿を培養液に還元します。収穫するには、皿を少し傾け、慎重に井戸からメディア全体を取り除くためにピペットを使用しています。蒸留された無菌水のポイント5ミリリットルを井戸に加えます。30秒後、得られた水を1ポイント5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移し、渦を10秒間激しく移動させます。4ポイント5マイクロリットルと50マイクロリットルの水溶出液を450マイクロリットルの蒸留された無菌水に加え、10倍および100倍の希釈液を調製します。徹底的な混合を確実にするために簡単に渦。元の10倍希釈したサンプルと100倍希釈したサンプルをリソゲニーブロス寒天プレートに50マイクロリットル加え、プレートスプレッダーを使用して広げます。新興LMのアッセイのために、皿から重ね合う媒体の10マイクロリットルを抽出し、2つの5マイクロリットルのアリコートおよびマイクロ遠心分離管に分ける。DMEM/FCSの5マイクロリットルを1つのアリコートに加え、ミリリットルゲンタマイシンあたり5マイクロリットルを含むDMEM/FCSの5マイクロリットルをコントロールとして2番目のアリコートに加えます。室温で5分待ちます。各アリコートに90マイクロリットルの蒸留無菌水を加え、2つを10秒間激しく渦液化します。LB寒天プレートにサンプル50マイクロリットルを加え、プレートスプレッダーを使用して広げます。Lmコロニーを列挙する前に、プレートを摂氏37度のインキュベーターで2日間保存します。自動セルカウンターを使用して、調製された生の2-6-4ポイント7細胞を10倍から6番目の細胞/ミリリットルの濃度に調整します。6ウェル組織培養プレートの井戸にサンプル1ミリリットルを加えます。50の感染の多重度に対応して、調製されたLm接種で細胞を感染させる。感染後1ポイント5時間で、PFA4%の500マイクロリットルで満たされた1点5ミリリットルマイクロ遠心チューブで、井戸の最初のセットから培地を収集し、チューブを氷の上に置く。細胞内Lmを収集するには、各井戸に蒸留された無菌水を1ミリリットル加えます。60秒後、得られた水のライセートを、4%PFAの500マイクロリットルの1ポイント5ミリリットルマイクロ遠心分離管に移します。チューブを10秒間激しく渦を出し、氷の上に置きます。残りの井戸の場合は、培地を取り除き、1ミリリットルのDMEM/FCSを5マイクログラム/ミリリットルのジェンタマイシンで交換して細胞外Lmを殺します。30分後、メディアを取り外し、ゲンタマイシンなしでDMEM/FCSに交換してください。さらに2時間と4時間後、2回目と3回目のポイントをチューブにライセートしてメディアを収集し、氷の上に置いて冷やします。遠心管は10,000倍Gで7分間用いた。ピペットを使用して、ペレットを邪魔することなく上清を除去する。4%PFAの50マイクロリットルと15マイクロリットルのファロイジンを含む染色カクテルをチューブに加え、混合して各ペレットを懸濁します。暗闇の中でチューブを摂氏4度で20分間インキュベートします。インキュベーションの後、各チューブにFACSバッファーの1ミリリットルを加え、ピペットを上下に加えて混合します。遠心分離機のスピンチューブを10,000倍Gで7分間回転させる。ペレットを邪魔することなく上清を除去します。すぐに使用するには、各ペレットを400マイクロリットルのFAXバッファにサスペンドします。後で分析するために保管する場合は、200マイクロリットルのFAXバッファと4%PFAの200マイクロリットルをチューブに加え、混合して中断します。抗生物質ジェンタマイシンによる短時間治療における感染条件を使用して非内在Lmを排除し、野生型Lmのゼロポイント-1-5%は、培養マクロファージとの共培養の1ポイント-5時間後に回収される。その後の共培養では、細胞内増殖のみを表す実行可能なLmの回収率が4倍、7ポイントの5倍の増加があった。初期感染時に過大性のprfAを有するLm株に対して同等のプロファイルが観察されたが、3〜6回のHPIの間では観察されなかった。prfAがLm株から削除されたとき、長期の共培養後の歪みの回収に続く減少がある。ゲンタマイシンが6つのHPIでウェルから取り除かれると、細胞外Lmは野生型および過毒性のprfA株の両方について1時間後に検出することができるが、prfAを有する株は削除されない。感染していないマクロファージと感染したマクロファージの両方を重ねたメディアには、光散乱、細菌サイズの粒子状物質が含まれていました。しかし、感染したマクロファージからの培地のみが、サイズの格言内にGFP陽性信号を有していた。フェロイジン陽性Lmの出現の時間依存性の増加は、感染したマクロファージで観察された。48ウェル組織培養皿でマクロファージをめっきする場合は、細胞なしでいくつかの井戸を残します。これらの非細胞制御井戸は、病原体、抗生物質などを加えて細胞含有ウェルとまったく同じように処理され、実験シグナルが宿主細胞の存在に依存することを保証する。図1および3に示す実験と同様に、病原体または宿主因子およびまたは小分子は、病原体細胞流出に対する影響について試験することができる。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答

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