Name: キメラ蛋白質の構築による機能性タンパク質領域の同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: 学ぶ キメラタンパク質構築法による機能性領域の同定手法。構造が類似したタンパク質間で領域を交換し、生物学的機能に重要な領域を特定する実験プロトコルを解説します。

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この作品は、マックス ・ プランク協会と Schüchtermann クリニック (悪い Rothenfelde、ドイツ) によって支持されました。本研究の一部は、元生物化学のジャーナルで出版されました。エイドリアン ・ Segarra、j. m.、シンドラー、(名)、Gajawada、p.、Lörchner、h.、ブラウン、t. & Pöling、j.AB ループと結合部位 III の人間オンコスタチン M (OSM) の D ヘリックス OSM 受容体活性化のために必要です。J. Biol. chem. 2018;18:7017-7029。 © 著者。

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<li>McDowell, D. G., Burns, N. A., Parkes, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localised+sequence+regions+possessing+high+melting+temperatures+prevent+the+amplification+of+a+DNA+mimic+in+competitive+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Localised sequence regions possessing high melting temperatures prevent the amplification of a DNA mimic in competitive PCR.</a> Nucleic Acids Research. 26 (14), 3340-3347 (1998).</li>
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キメラ蛋白質の生成は、サイトカイン受容体結合ドメイン13のモジュール性など質問に対処に切り捨てられた蛋白質の限界を超えて移動することができる汎用性の高い技術を構成します。キメラの設計学では、この種の重要なステップであり注意が必要です。機能ドメインを確立する予備研究一般に間必要になります最初の段階で幅広い領域の置換変数の長さより小さい置換は 1 つの地域の詳細な研究に適しています。機能サイト31,32を示すことが多いので、このステップでタンパク質ファミリー内で小さな節約されたモチーフの存在に特別な注意を与えべき。個人的な経験は、キメラ蛋白質の設計よりも 1 つのラウンドが必要なできることを示しますキー機能領域を絞り込むには、各ラウンドは、重要な必要とする時間 (週か月) 初期設計から機能試金テストします。
限り、興味の蛋白質に構造が似ているタンパク質が存在するが分岐の生物学的機能を有する、メソッド、関心の任意のシーケンス...

サイトカインや成長因子などのタンパク質のいくつかの種類は、家族メンバーが似たような三次元構造を共有ではしばしば明確な生物学的機能1,2でグループ化されます。この機能の多様性は、通常分子の活性部位3内のアミノ酸組成のわずかな違いの結果です。このようなサイトおよび機能の決定要因の同定のみを提供しない貴重な進化への洞察もアゴニスト阻害剤の詳細4を設計します。ただし、構造的に関連蛋白質の間に頻繁に見られる残基組成の相違の多数は、このタスクを複雑にします。何百もの突然変異体は可能、1 つの残基のすべての変化を評価する今日を含む大規模なライブラリを構築するにもかかわらず、それらの組み合わせは依然困難な時間のかかる努力5。
管理番号6に可能な残基の数を減らすために値の大きい蛋白質の領域の機能の重要性を評価する技術をします。切り捨てられたタンパク質は、この問題に取り組むために最もよく使われるアプローチをされています。したがって、地域の場合は調査の下でタンパク質の機能が特定の地域の7,8,9の削除によって影響を受ける機能に関連すると見なされます。ただし、このメソッドの主な制限は削除が折りたたみ、集計、目的の領域を研究することができないにつながるタンパク質の二次構造に影響を与えることができます。良い例は、サイトカイン オンコスタチン M (OSM)、内部の削除 7 残基がさらにできませんでした誤って折りたたまれた突然変異体の結果よりも大きいが10を勉強したの切り捨てられたバージョンです。
キメラ蛋白質の生成はより大きい蛋白質領域の解析を可能にする革新的な代替アプローチを構成します。このメソッドの目的は、特定の生物学的機能に置き換えられるセクションの貢献度を評価するために別のタンパク質に構造的に関連するシーケンスによって蛋白質の関心領域を交換することです。機能ドメイン11,12を識別する受容体シグナル伝達の分野で広く使用されているキメラ蛋白質が少しのアミノ酸のアイデンティティが保存された二次構造蛋白質家族の研究に特に有用。インターロイキン 6 (IL-6) 型サイトカインのクラスでインターロイキン-6 および毛様体神経栄養因子 (6% 順序のアイデンティティ)13または白血病抑制的な要因 (LIF) および OSM (20% のアイデンティティ)6のように、適切な例を見つけることができます、次のプロトコルに基づいています。

<table><tbody><tr><td>Labcycler thermocycler</td><td>Sensoquest</td><td>011-103</td><td>このプロトコルを実行するために、任意の従来のPCR装置を使用することができます</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c UV-Vis分光光度計</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-2000C&nbsp;</td><td>DNA定量</td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA ラダー</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SM0241</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler DNA ラダーミックス</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SM0331</td><td></td></tr><tr><td>AscI 制限酵素</td><td>New England Biolabs</td><td>R0558</td><td></td></tr><tr><td>PacI 制限酵素</td><td>New England Biolabs</td><td>R0547</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Hot Start II DNA ポリメラーゼ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F-549S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP set (100 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Promega</td><td>M1804</td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR clean-up kit</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td></td></tr><tr><td>MGC Human LIF Sequence-Verified cDNA (CloneId:7939578), グリセロールストック</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MHS6278-202857165</td><td></td></tr><tr><td>LE agarose</td><td>Biozym</td><td></td><td></td></tr><tr><td>840004プライマー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>カスタムオーダー</td></tr><tr><td>ヒト オンコスタチン M cDNA</td><td></td><td></td><td>Heike Hermanns 博士 (Department of Hepatology, University Hospital W&uuml;rzburg, Germany)&nbsp;</td></tr><tr><td>PacIおよびAscI制限部位</td><td></td><td></td>を持つpCAGGS<td>ベクターGift of Dr. Andr&eacute;シュナイダー(マックス・プランク心肺研究所、バート・ナウハイム、ドイツ)</td></tr></tbody></table>

キメラ蛋白質の構築による機能性タンパク質領域の同定

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

このプロトコルの目標には、タンパク質の異なる領域がこれらの領域の機能の重要度を決定するために構造が似ているタンパク質に対応するシーケンスに置き換えられてキメラ蛋白質の設計が含まれます。このようなキメラが重なり合う DNA のフラグメントを使用して入れ子になった PCR のプロトコルによって生成され、十分なネイティブの二次構造と翻訳後修飾ように哺乳類システム内でその式の前のプライマーを設計しました。
異なる領域の機能的な役割は、適切な読み出しアッセイにおけるキメラの活動の損失によって示されます。その結果、一連の重要なアミノ酸をかくまっている地域が特定される、相補的な技術 (例えばサイト指示された突然変異誘発) 分子の解像度を上げることができますさらに上映されました。異なる関数と構造的に関連蛋白質を見つけることができる場合に限られていますが、キメラ蛋白質を正常にサイトカインとサイトカイン受容体などの蛋白質の重要なバインド領域を識別するために採用されています。このメソッドは、タンパク質の機能領域が、完全に定義されない場合に特に適している、関心領域を絞り込むスクリーニング労力を削減し進化のアプローチの貴重な最初のステップを構成します。

建設とキメラタンパク質 (図 1) の生成は、最近出版された調査6の主題ではなかった OSM と LIF、インターロイキン 6 サイトカイン家族の 2 つのメンバーと例示が。これらのタンパク質の立体構造を図 2に示します。両方の分子は、私 (A ~ D と呼ばれる) 4 つのヘリックスとサイトカインはバンドル パック、ループ28参加クラスの特徴的な二次構造を採用します。人間蛋白質の一直線に並べられたアミノ酸の構造は、図 3Aで見ることができます。この例で BC ループ領域は OSM のアミノ酸シーケンス図 3Bに示すように OSM LIF キメラを作成する対応する LIF シ...

構造的に関連蛋白質はよく明確な生物学的機能を発揮します。キメラ蛋白質を作成するためにこれらの蛋白質の相当領域の交換は、彼らの機能の相違に責任がある重大な蛋白質の領域を識別するために革新的なアプローチを構成します。

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

構造上類似したタンパク質の領域を交換してキメラを作り出すため、研究する分子の生物学的機能を担う領域の重要性を調べることができます。領域交換はタンパク質の一般的な二次構造を先取りし、その全体の構造に対する領域の重要な部分を生物学的機能を直接媒介するものと区別することができる。どの領域を置き換えるかを選択することができます。大きな交換から始めることは、タンパク質の主要な機能を特定するのに役立ちます。手順を開始するには、テキストプロトコルに詳述されているように、関心のあるタンパク質と領域を交換するためのドナーとして適切なタンパク質を選択します。次に、先ずref seqウェブページの遺伝子セクションにアクセスすることにより、レシピエントおよびドナータンパク質のタンパク質アミノ酸配列を参照配列データベースから取得する。検索ボックスに目的のタンパク質の名前を入力し、[検索] をクリックします。結果のリストで目的の種の遺伝子名をクリックします。ref seq セクションまでスクロールダウンして、文書化されているすべてのアイソフォームを表示します。対象のアイソフォームのシーケンス識別子をクリックします。下にスクロールしてcdsをクリックして、遺伝子のタンパク質コード領域を強調します。画面右下でFAFSDAをクリックし、遺伝子配列をコピーします。適切なDNA編集ソフトウェアを使用してDNA配列を保存します。自由に利用できる APE を使用する場合は、プログラムを開き、コピーしたシーケンスを空白のボックスに貼り付け、シーケンス名を選択して保存をクリックします。次に、別のキメラ構造で置換されるタンパク質領域を選択し、まず、別個の構造領域で目的とするタンパク質配列を分割します。そのためには、PDBeウェブサイトから目的のタンパク質の構造データをダウンロードしてください。タンパク質のPDBeページにアクセスし、画面の右側にあるダウンロードをクリックしてPDBeファイルをダウンロードします。Pymolのような分子可視化システムでPDBeファイルを開きます。Pymolでは、塩基配列を表示し、デフォルトの構造データを非表示にし、漫画のビューを選択して、タンパク質の構造特性を明確に視覚化します。画面の上部にある塩基配列をクリックして、分子の異なる部分を強調し、それぞれの特徴的な構造特徴に対応するアミノ酸を示します。次に、APEのDNA配列上の明確な構造領域にコメントを付け、DNA配列を開いて選択し、ORFをクリックして翻訳し、最初の領域の最後のアミノ酸をクリックしてDNA配列内の位置を強調し、その領域のヌクレオチドのコードを選択します。選択を右クリックし、新しい機能を選択して名前と色を付けます。前の手順で特定した構造領域ごとに、この手順を繰り返します。2つのタンパク質の残基配列を整列させるには、まず、APE中のドナーおよび受容体タンパク質の完全なアミノ酸配列を得る。以前と同様に、ドナーDNA配列を開いて選択し、ORFをクリックして翻訳します。次に、Clustal Ω ウェブページにアクセスし、2 つのタンパク質のアミノ酸配列を入れます。各配列は、適切に識別されるタンパク質名を持つテキスト行によって進める必要があります。下にスクロールして[送信]をクリックします。[ダウンロードアライメント ファイル] タブをクリックして、アライメント ファイルを取得し、保存します。このファイルは、任意のテキスト編集プログラムで開くことができます。アライメントファイルを基準として使用し、そのDNA配列内のドナータンパク質の対応する構造領域にアポイントメントを付ける。受容体タンパク質のアセトDNA配列のコピーを作成し、キメラタンパク質として名前を変更します。名前を変更した DNA 配列を APE で開きます。ドナータンパク質で交換される領域を選択し、次に、リ名称変更された受容体タンパク質内の対応する領域を選択する。ドナータンパク質DNA配列を貼り付け、変更を保存します。APEなどのDNAエディタを使用して、末端プライマーを設計します。新しいDNAファイルを作成し、リーダーシーケンスでエンドターミナルプライマーを開始します。その後、目的の遺伝子の初期18〜27塩基対においてMCSおよび任意のスペーサーのベクターで選択された第1の制限部位が続く。新しいDNAファイルでは、C末端プライマー配列を、対象遺伝子の最終的な18〜27塩基対から始め、その後にオプションのスペーサー、選択された2番目の制限部位、およびリーダー配列を設計する。シーケンス全体をハイライト表示し、右クリックして逆補完を選択してリバースプライマーを取得します。さて、キメリ構造の境界領域ごとにプライマーを設計します。キメラの DNA 配列で、元の配列と挿入された配列が接触しているゾーンで、30 個の塩基対領域をハイライトします。これは、各シーケンスの15塩基対で構成されています。領域をコピーし、新しい DNA ファイルに貼り付けます。このシーケンスは、フォワードプライマーになります。前の手順で生成されたフォワード プライマーのコピーを作成し、リバース プライマーとして名前を変更します。プライマー シーケンスをハイライト表示し、右クリックして、逆の補間を選択して、逆プライマー シーケンスを生成します。キメラDNA配列の接触ゾーンごとにこれらの手順を繰り返します。一般的に、N端子またはC末端領域で置換が行われない限り、1つのキメラを生成するために2組のフォワードリバースプライマーが必要です。キメラタンパク質を構成する各フラグメントについて、個々のPCR反応混合物を調製します。まず、1ポイント5ミリリットルマイクロフューズチューブを氷上にセットし、テキストプロトコルに記載されている順序でPCR混合物の異なる試薬をピペットします。PCR反応ごとに正しいプライマーとテンプレートが採用されていることを確認します。各反応に対して2つの薄い壁面ゼロ点2ミリリットルPCRチューブをラベル付けし、各チューブに対応するPCR混合物の20マイクロリットルを転写します。PCR チューブを PCR サーモサイクラーに移し、テキスト プロトコルで詳細に説明されているようにプロトコルを開始します。PCR反応が完了したら、各チューブに6個のxDNAローディングバッファーを4マイクロリットルずつ加えます。1%のアガロスゲルを電気泳動ユニットに挿入し、TAEバッファーでカバーします。慎重に分子量後者と一緒にゲルにサンプルをロードします。80~120ボルトで20~45分間ゲルを動かした後、電気泳動部の電源を切り、アゴロスゲルを取り外します。UV光の下で増幅されたDNAバンドを視覚化します。カミソリの刃を使用して、ゲルから個々のDNA断片を切り取り、それらを2つのミリリットルマイクロフューズチューブに転写する。PCRクリーンアップキットを使用してDNA断片を精製した後、分光フェトメーターで260ナノメートルと340ナノメートルのサンプルの吸光度を測定することによって回収されたDNAの量を定量化します。ここで、キメラDNA配列を生成するためにPCR増幅を行う。まず、50マイクロリットルのPCR反応を設定し、キメラの別々の成分を以前のように融合します。N末端およびC末端プライマーを、増幅されたDNA断片のそれぞれ10ナノグラムと共に採用する。精製されたDNA断片を、30マイクロリットルの核自由水で回収し定量化する。この断片は、末端プライマーに含まれる制限部位によって横たわるキメラDNA配列を含む。キメラタンパク質の生成は、2つの中間ルークと6つのシトカインファミリーのメンバーと一緒に例示される。白血病抑制因子におけるオンコスタテンM.OSMリフトキメラは、OSMのBCループ領域を対応するリフトシーケンスと交換した結果です。最初のPCR増幅ステップは、3つの別々の反応で構成されていました。N末端 OSM フラグメントは、N 端末 OSM フォワードおよび BC 起動リバースプライマーを必要とし、OSM をテンプレートとして使用しました。LIF BCループは、テンプレートとしてLIFを使用してBC開始フォワードとBC Nリバースプライマーを介して得られました。C 端末 OSM フラグメントは、テンプレートとして BC エンドフォワードと C 端末 OSM リバースプライマーと同様に OSM を使用しました。これらの精製フラグメントは、次に、N末端OSMフォワードおよびC末端OSMリバースプライマーとともに第2のPCR反応の鋳式として使用され、対応するOSM LIF BCループ遺伝子配列を増幅した。精製および大腸菌への変換の後、個々のプラスミドを単離し、DNA断片を適切に挿入するための制限酵素消化によってスクリーニングした。ゲル電気泳動は、シーケンス検証のために送られた正のヒットを明らかにした。キメラタンパク質は、完全な派閥系で測定し、活性を生成する必要があります。その特定の派閥の置き換えられた地域の重要性を判断するために。この技術は、非常に有用であり、頻繁に適用され、主要な機能ドメインおよび受容体認識部位を同定するためにシグナル受容体の干渉を受けている。DNA電気泳動に使用する番号は、使い捨て手袋、実験室用コート、保護眼鏡を使用して処理する必要があります。

identification-functional-protein-regions-through-chimeric-protein

Research

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Biochemistry

生物化学

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