Name: 生きている細胞の単一テロメアから表現されるテロメア繰り返し含む RNA テラを視覚化するがん細胞クローンの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 学ぶ単一テロメア由来のTERRA可視化法。がん細胞クローンを用いて生細胞内のテロメア関連非コードRNAをリアルタイムで観察し、テロメア機能とがん生物学の理解を深める革新的アプローチです。

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CIBIO トレント大学での高度なイメージング機能、ウィーンの BioOptics 光顕微鏡施設 Max F. ペルーツ研究所 (MFPL) でのスタッフに感謝しております。これらの結果につながる研究資金を受けている Mahlke-谷、同財団、研究、技術開発およびデモンストレーションのため欧州連合の第 7 フレームワーク プログラムから付与契約の下でない 609431 ecEC は、大学教育と研究 (MIUR) のイタリア省からリタ レヴィ モンタルチーニ交わりによってサポートされます。

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<li>Arnoult, N., Van Beneden, A., Decottignies, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+length+regulates+TERRA+levels+through+increased+trimethylation+of+telomeric+H3K9+and+HP1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Telomere length regulates TERRA levels through increased trimethylation of telomeric H3K9 and HP1alpha.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 19 (9), 948-956 (2012).</li>
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<li>Arora, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNaseH1+regulates+TERRA-telomeric+DNA+hybrids+and+telomere+maintenance+in+ALT+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">RNaseH1 regulates TERRA-telomeric DNA hybrids and telomere maintenance in ALT tumour cells.</a> Nature Communications. 5, 5220(2014).</li>
<li>Balk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+RNA-DNA+hybrids+affect+telomere-length+dynamics+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Telomeric RNA-DNA hybrids affect telomere-length dynamics and senescence.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 20 (10), 1199-1205 (2013).</li>
<li>Graf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+Length+Determines+TERRA+and+R-Loop+Regulation+through+the+Cell+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomere Length Determines TERRA and R-Loop Regulation through the Cell Cycle.</a> Cell. 170 (1), 72-85 (2017).</li>
<li>Lee, Y. W., Arora, R., Wischnewski, H., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRF1+participates+in+chromosome+end+protection+by+averting+TRF2-dependent+telomeric+R+loops%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">TRF1 participates in chromosome end protection by averting TRF2-dependent telomeric R loops.</a> Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).</li>
<li>Moravec, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TERRA+promotes+telomerase-mediated+telomere+elongation+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">TERRA promotes telomerase-mediated telomere elongation in Schizosaccharomyces pombe.</a> EMBO Reports. 17 (7), 999-1012 (2016).</li>
<li>Cusanelli, E., Romero, C. A., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+noncoding+RNA+TERRA+is+induced+by+telomere+shortening+to+nucleate+telomerase+molecules+at+short+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Telomeric noncoding RNA TERRA is induced by telomere shortening to nucleate telomerase molecules at short telomeres.</a> Molecular Cell. 51 (6), 780-791 (2013).</li>
<li>Moradi-Fard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smc5%2F6+Is+a+Telomere-Associated+Complex+that+Regulates+Sir4+Binding+and+TPE%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Smc5/6 Is a Telomere-Associated Complex that Regulates Sir4 Binding and TPE.</a> PLoS Genetics. 12 (8), e1006268(2016).</li>
<li>Chu, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TERRA+RNA+Antagonizes+ATRX+and+Protects+Telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TERRA RNA Antagonizes ATRX and Protects Telomeres.</a> Cell. 170 (1), 86-101 (2017).</li>
<li>Lai, L. T., Lee, P. J., Zhang, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+protects+RNA+signals+in+simultaneous+RNA-DNA+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence protects RNA signals in simultaneous RNA-DNA FISH.</a> Experimental Cell Research. 319 (3), 46-55 (2013).</li>
<li>Zhang, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+RNAs+mark+sex+chromosomes+in+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Telomeric RNAs mark sex chromosomes in stem cells.</a> Genetics. 182 (3), 685-698 (2009).</li>
<li>Gallardo, F., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+mRNAs+in+fixed+and+living+yeast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Visualizing mRNAs in fixed and living yeast cells.</a> Methods in Molecular Biology. 714, 203-219 (2011).</li>
<li>Querido, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+fluorescent+proteins+to+study+mRNA+trafficking+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Using fluorescent proteins to study mRNA trafficking in living cells.</a> Methods in Cell Biology. 85, 273-292 (2008).</li>
<li>Cusanelli, E., Chartrand, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomeric+noncoding+RNA%3A+telomeric+repeat-containing+RNA+in+telomere+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Telomeric noncoding RNA: telomeric repeat-containing RNA in telomere biology.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 5 (3), 407-419 (2014).</li>
<li>Perez-Romero, C. A., Lalonde, M., Chartrand, P., Cusanelli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+relocalization+of+telomeric+repeat-containing+RNAs+during+diauxic+shift+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Induction and relocalization of telomeric repeat-containing RNAs during diauxic shift in budding yeast.</a> Current Genetics. , (2018).</li>
<li>Avogaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+reveals+the+dynamics+and+function+of+single-telomere+TERRA+molecules+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging reveals the dynamics and function of single-telomere TERRA molecules in cancer cells.</a> RNA Biology. , 1-10 (2018).</li>
<li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+nicking+by+RNA-guided+CRISPR+Cas9+for+enhanced+genome+editing+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity.</a> Cell. 154 (6), 1380-1389 (2013).</li>
<li>Yamada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+analysis+with+a+genetically+encoded+fluorescent+RNA+probe+reveals+TERRA+function+around+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal analysis with a genetically encoded fluorescent RNA probe reveals TERRA function around telomeres.</a> Scientific Reports. 6, 38910(2016).</li>
<li>Deng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+telomeric+repeat-containing+RNA+%28TERRA%29+foci+in+highly+proliferating+mouse+cerebellar+neuronal+progenitors+and+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Formation of telomeric repeat-containing RNA (TERRA) foci in highly proliferating mouse cerebellar neuronal progenitors and medulloblastoma.</a> Journal of Cell Science. 125 (Pt 18), 4383-4394 (2012).</li>
<li>Casini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+specific+SpCas9+variant+is+identified+by+in+vivo+screening+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A highly specific SpCas9 variant is identified by in vivo screening in yeast.</a> Nature Biotechnology. 36 (3), 265-271 (2018).</li>
<li>Nergadze, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG-island+promoters+drive+transcription+of+human+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">CpG-island promoters drive transcription of human telomeres.</a> RNA. 15 (12), 2186-2194 (2009).</li>
<li>Porro, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+the+TERRA+transcriptome+at+damaged+telomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of the TERRA transcriptome at damaged telomeres.</a> Nature Communications. 5, 5379(2014).</li>
<li>Farnung, B. O., Brun, C. M., Arora, R., Lorenzi, L. E., Azzalin, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+efficiently+elongates+highly+transcribing+telomeres+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Telomerase efficiently elongates highly transcribing telomeres in human cancer cells.</a> PLoS One. 7 (4), e35714(2012).</li>
<li>Flynn, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+lengthening+of+telomeres+renders+cancer+cells+hypersensitive+to+ATR+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alternative lengthening of telomeres renders cancer cells hypersensitive to ATR inhibitors.</a> Science. 347 (6219), 273-277 (2015).</li>
<li>Scheibe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+interaction+screen+of+telomeric+repeat-containing+RNA+reveals+novel+TERRA+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative interaction screen of telomeric repeat-containing RNA reveals novel TERRA regulators.</a> Genome Research. 23 (12), 2149-2157 (2013).</li>
<li>Bolland, D. J., King, M. R., Reik, W., Corcoran, A. E., Krueger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+3D+DNA+FISH+using+directly+labeled+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Robust 3D DNA FISH using directly labeled probes.</a> Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).</li>
<li>Masui, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+chromosome+dynamics+and+outcome+of+X+chromosome+pairing+events+during+ES+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Live-cell chromosome dynamics and outcome of X chromosome pairing events during ES cell differentiation.</a> Cell. 145 (3), 447-458 (2011).</li>
</ol>

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この記事では MS2 シーケンス subtelomere 15q 内に統合を含むひと癌細胞のクローンを生成する手法を提案します。これらのクローンを使用して、subtelomere 15q から転写 MS2 タグ テラ分子は、MS2 GFP 融合タンパク質の共発現による蛍光顕微鏡で検出されます。このアプローチにより、単一から表明したテラのダイナミクスを研究する研究者生活のテロメア細胞21。このプロトコルでは AGS のセルライン テラ式はヒトの胃がんサンプル24で亢進なので、テラを研究に興味深いモデル システムを表すテラ MS2 クローンが選択されます。ただし、ここで説明されているプロトコルは他の細胞内のテラ MS2 のクローンの選択の合わせることができます。MS2 シーケンスの統合原理で昇格できますテロメア 15q から別の subtelomere で特定の MS2 カセットと CRISPR 戦略を使用しています。今回紹介した方法で Cas9 nickase 酵素と二重ガイド Rna は統合22...

染色体の subtelomeric 領域から長鎖非コード RNA テラを転写し、その転写染色体はテロメアの繰り返し管1,2内終了終了へ向かって。このため、テラの成績証明書は 5' 端に subtelomeric の派生シーケンスから成り、テロメアの繰り返し (脊椎動物の UUAGGG)3で終了します。重要な役割は、テロメア4,5, DNA 複製6、染色体の間での相同組換えの促進のヘテロクロマチン形成を含む終了する7,8テラ、提案されています。,9、テロメア構造10およびテロメアの長さの恒常性2,11,12,13を規制します。さらに、テラの成績証明書は、マウス胚性幹 (ES) 細胞14における広範な遺伝子発現を調節する多数の extratelomeric サイトと対話します。これらに伴い、RNA 蛍光性の現場の交配 (RNA 魚) 解析はテラ成績のサブセットのみを示している証拠はテロメア1,2,15ローカライズします。さらには、テラはマウス細胞2,16の X および Y 染色体でローカライズする原子集合体を形成する報告されています。テラ成績が核内の複雑なダイナミクスを受けることが示唆されました。テラ分子のダイナミクスを理解し彼らの機能と作用機構を定義するのに役立ちます。
MS2 GFP システムは、広く様々 な生物17,18から細胞内 RNA 分子を可視化するために使用されています。このシステムは、タグを出芽酵母12,19のシングル テロメア テラ分子を可視化する以前使用されています。このシステムを使用すると、最近、酵母テラ成績証明書をポスト発酵から呼吸へシフト フェーズでローカライズ細胞質内テラ可能性がありますにおける核外機能20を及ぼすことを示唆しているが示されました。最近がん細胞21シングル テロメア テラ トラン スクリプトを勉強する MS2 GFP システムを使いました。この目的には、MS2 単一テロメア (テロメア 15q、以下 Tel15q) でシーケンスを統合する CRISPR/Cas9 ゲノム編集ツールを採用し、MS2 タグ内因性 Tel15q テラ (テラ MS2 クローン) の表現のクローンを得た。認識し、生活で単一テロメア テラ成績の MS2 RNA シーケンスにより可視化を結合する GFP 融合 MS2 RNA 結合タンパク質 (MS2 GFP) の共発現細胞21です。ここに示されているプロトコルの目的は、テラ MS2 クローンの生成のために必要な手順の詳細に説明することです。
テロメア 15q、subtelomeric 地域で統合され、MS2 カセット テラ MS2 のクローンを生成するテラ プロモーター領域と転写開始部位の下流。MS2 カセットには lox p サイトに挟まれたネオマイシン耐性遺伝子が含まれています、subtelomere 15q での統合は、CRISPR/Cas9 システム22を使用して実行されます。カセット、単一クローン MS2 のトランスフェクションが選択され PCR によってカセットの subtelomeric 統合が確認されたら、DNA 配列と南部のしみ。肯定的なクローンは、subtelomere 15q で単一 lox p サイト MS2 シーケンスだけを残して、カセットの選択マーカーを除去するために Cre を発現アデノ ウイルスに感染しています。RT qPCR により Tel15q からタグ付きの MS2 のテラの式を確認すると.最後に、MS2 GFP の融合蛋白質を表現に蛍光顕微鏡による MS2 テラ成績を視覚化するためにレトロ ウイルス感染テラ MS2 クローンで。RNA 魚でテラの成績証明書を容易に検出できるし、テロメア繰り返し固有を使用して生細胞イメージング プローブ1,2,15,23。これらのアプローチは、単一セルの解像度でテラ分子の総人口の局在に関する重要な情報を提供します。単一 subtelomere で MS2 シーケンスを含んでいるクローンの生成には、関数とテラの作用のメカニズムを定義する生きた細胞の単一テロメア テラ転写物のダイナミクスを研究する研究者が有効になります。

<table><tbody><tr><td>AGS細胞</td><td>-</td><td>-</td><td>クリスチャン・バロン(Universit&eacute; de Montr&eacute;al)です。</td></tr><tr><td>F12K Nut Mix 1X</td><td>GIBCO</td><td>21127022</td><td>AGS細胞用培養培地</td></tr><tr><td>L-グルタミン&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>MT25005CI</td><td>細胞培養培地の成分</td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン 溶液</td><td>コーニング</td><td>30-002-CI</td><td>細胞培養培地の成分</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Σ Aldrich</td><td>F2442</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>DMEM 1X</td><td>GIBCO</td><td>21068028フェ</td><td>ニックス細胞用培地</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Σ Aldrich</td><td>C1016</td><td>フェニックス細胞トランスフェクションに使用</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>フェニックス細胞トランスフェクションに使用(HBS溶液)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td>フェニックス細胞トランスフェクションに使用 (HBS溶液)</td></tr>デ<tr><td>キストロー</td>ス <td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>フェニックス細胞トランスフェクションに使用</td></tr> <tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>フェニックス細胞トランスフェクション(HBS溶液)およびレトロウイルス沈殿物に使用</td></tr><tr>フェ<td>ニックス細胞トランスフェクション(HBS溶液)に使用</td> <td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3264</td> フェニックス細胞トランスフェクション(HBS溶液)</tr><tr><td>トリプシンEDTA溶液 1X</td><td>CORNING</td><td>59430C</td><td>細胞分割に使用</td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>GIBCO</td><td>14190250</td><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td>細胞凍結培地(80%FBBおよび20%DMSO)の成分</td></tr><tr><td>G-418二硫酸塩</td><td>Formedium</td><td>G4185</td><td>選択薬&nbsp;</td></tr><tr><td>ゼラチン溶液 Bioreagent Sigma</td><td>Aldrich</td><td>G1393</td><td>96ウェルDNAプレートと凍結プレートのコーティング</td></tr><tr><td>トリス塩基</td><td>フィッシャーBioReagents</td><td>10376743</td><td>ゲノムDNA抽出用細胞溶解バッファーの成分</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td>ゲノムDNA抽出用細胞溶解バッファーの成分</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71729</td><td>ゲノムDNA抽出用細胞溶解バッファーの成分</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM2546</td><td>ゲノムDNA抽出用細胞溶解バッファーの成分</td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12091021</td><td>DNA抽出中のRNA分解</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>A5304</td><td>DNAゲル調製</td></tr><tr><td>Atlas ClearSight</td><td>Bioatlas</td><td>BH40501</td><td>アガロースゲルエタノール中のDNAおよびRNAサンプルの検出に使用される染色試薬</td></tr><tr><td></td><td>DNA</td><td>沈殿</td><td>BP28184</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71196</td><td>3M濃度でのDNA沈殿に使用 pH5.2</td></tr><tr><td>Wizard SVゲルおよびPCRクリーンアップシステム</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>ネオマイシン陽性クローンのPCRスクリーニング中のアガロースゲルからのPCRフラグメントの抽出</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>AMBION</td><td>15596018</td><td>RNA抽出に使用される有機溶媒</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>89836</td><td>RNAからのゲノムDNAの分解&nbsp;</td></tr><tr><td>dNTPs mix</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td>RTおよびPCR反応に使用</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>707265ML</td><td>RT反応に使用</td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td> 水中<td>でRNAsを不活性化に使用(1:1000希釈)</td></tr><tr><td>Ribolock</td><td>Thermo Fisher</td><td>EO0381</td><td>RNase阻害剤</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9381</td><td>RNAゲルの調製</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>15710</td><td>変性RNAゲルの調製(1x MOPS中の1% PFA)</td></tr><tr><td>上付き文字III 逆転写酵素</td><td>Invitrogen</td><td>18080-093</td><td>後転写反応</td></tr><tr><td>Pfu DNAポリメラーゼ(組換え)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0501</td><td>PCR反応</td></tr><tr><td>2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX</td><td>PCRネオ</td>マイcn遺伝子を除去するためにTERRA-MS2クローンに感染するために使用されるBIOSYSTEMS <td>PB 20.14</td><td>qPCR反応</td></tr><tr><td>Cre-GFPアデノウイルス</td><td></td><td>https://medicine.uiowa.edu/vectorcore 1174-HT</td><td></td></tr><tr><td>酪酸ナトリウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td>フェニックス細胞でのレトロウイルス粒子産生を促進するために使用される</td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>89510</td><td>レトロウイルス粒子の沈殿</td></tr><tr><td>35&micro;-</td><td>TERRA-MS2クローンのライブセルイメージング分析に使用される</td>ディッシュガラスボトム<td>Ibidi</td><td>81158</td></tr></tbody></table>

生きている細胞の単一テロメアから表現されるテロメア繰り返し含む rna テラを視覚化するがん細胞クローンの生成

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

テロメアは、転写、テロメア長鎖非コード Rna (テラ) の繰り返しを含むに上昇を与えるテロメア生物学、ヘテロクロマチン形成とテロメアの長さの恒常性などで重要な役割を果たしているが提案されています。最近の知見では、テラの分子はまたマウス胚性幹 (ES) 細胞における遺伝子発現を調整するために内部の染色体領域と対話することを明らかにしました。この証拠に沿った RNA 蛍光の in situハイブリダイゼーション (RNA 魚) 分析サブセットのみが示されている染色体の両端にテラのトラン スクリプトをローカライズします。テラ分子のダイナミクスの理解は、彼らの機能と作用機構を定義に役立ちます。ここでは、ラベルし、MS2 GFP を用いた癌細胞の単一テロメア テラ転写物を可視化する手法について述べる。この目的に単一の subtelomere で統合 MS2 シーケンスを含んでいる AGS ヒト胃がん細胞ラインを使用して安定したクローンを生成するプロトコルを提案します。MS2 タグ テロメアからテラの転写は、GFP (MS2 GFP) を融合した MS2 RNA 結合タンパク質の共発現時に生細胞の蛍光顕微鏡による可視化 MS2 タグ テラ分子の発現の結果します。このアプローチにより、癌細胞の単一テロメア テラ分子のダイナミクスを研究する研究者とその他の細胞に適用できます。

図1は、実験的戦略の概要を表します。プロトコルとテラ MS2 AGS 細胞クローンの生成を示すタイムラインの主な手順 (図 1A) のとおりです。1 日で 6 ウェル プレートの複数の井戸が MS2 カセット、sgRNA/Cas9 (図 1Bに示すように) ベクトルを表現するをトランスフェクトしました。2 つの異なる subtelomere 15q 固有ガイド RNA シーケンス Cas9 nickase 表現のクローンを作成 pX335 ベクトル、cotransfected MS2 カセットでは、2 つの sgRNA pX335 ベクトルを生成します。プレートの 1 つの井戸は、トランスフェクション効率を確認するベクトルを表現する GFP をトランスフェクションすることができます。2 日で細胞がトリプシ...

ここでは、単一 subtelomere で MS2 シーケンス タグを含む癌細胞のクローンを生成するためのプロトコルを提案する.MS2 GFP システムに依存して、このアプローチは、内因性の転写産物のテロメア繰り返し含む RNA (テラ) 生きている細胞の単一テロメアから表現の可視化を実現。 にします。

生きている細胞の単一テロメアから表現されるテロメア繰り返し含む RNA テラを視覚化するがん細胞クローンの生成

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

この方法は、酵母テロメア非コードRNA TERRA局所化などのテロメアに関する重要な質問に答えるのに役立ち、起源のテロメアまたはトランス、異なるクロメトマントであると主張することができますこの技術の主な利点は、研究者が生きている細胞の単一のテロメアから発現するTERRA分子を視覚化できることです。この手順のデモンストレーションは、クラウディオ・オス・ペゴラーとニコール・ベッティン(私の研究室の2人の大学院生)です。テキストプロトコルに従ってAGS細胞の増殖を開始する。次に、細胞が50〜60%合流に達すると、sgRNA Cas9発現ベクターおよびMS2カセットでそれらをトランスペクトする。翌日、培養培地をネオマイシンを含む培地に置き換えます。この後、96ウェルプレートの各ウェルに0.25%トリプシンの10マイクロリットルを追加します。顕微鏡とマーカーを使用して、皿に見える各クローンの位置をマークします。ネオマイシン培養培地をクローン上に液体の薄膜を形成するのに十分なPBSに置き換えます。5マイクロリットルのトリプシンを含む10マイクロリットルのピペットを使用して、トリプシンをコロニーにゆっくりと放出する。トリプシンがセルを1分間取り外すことを許可します。先端でコロニーを削り、先端に吸い込む。この後、コロニーから96ウェルプレートのウェルに細胞を移します。プレートを室温で5分間インキュベートします。その後、150マイクロリットルの選択的培地で井戸を充填します。次に、3つの96ウェルプレートの各ウェルにゼラチン100マイクロリットルを加えます。プレートを室温で30分間インキュベートし、PBSで2回洗浄します。クローンが90%合流した後、プレートの各ウェルから培地を吸引し、PBSでプレートを洗浄する。その後、各ウェルに30マイクロリットルのトリプシンを加え、プレートを摂氏37度で5分間インキュベートします。次に、各ウェルに70マイクロリットルの選択的培地を加えます。上下にピペットを入れ、細胞を破壊します。120マイクロリットルの選択的培地を含むゼラチン化DNAプレートのウェルに30マイクロリットルの混合物を移す。次に、混合物の30マイクロリットルを培地の50マイクロリットルを含むゼラチン化凍結板に移す。DNAをインキュベーターに入れ、細胞が90%合流するまで摂氏37度で増殖させます。この後、凍結プレートの各ウェルに80マイクロリットルの氷冷凍結培地を加えます。パラフィルムでプレートを密封し、蓋を交換し、プレートをアルミホイルで包みます。その後、凍結プレートを摂氏80度に保ちます。DNAプレート中のクローンが90%合流した後、PBSでプレートを2回洗浄します。その後、50マイクロリットルのライシスバッファーで細胞をライスします。パラフィルムでプレートを覆い、蓋を交換し、プレートをサランラップで包みます。この後、一晩で摂氏37度でプレートをインキュベートします。翌日、各ウェルに100マイクロリットルのエタノール塩化ナトリウム溶液を加え、室温で6時間または一晩のDNA沈殿を可能にする。その後、プレートを反転し、ウェルあたり70%のエタノールの200マイクロリットルでそれを3回洗浄します。プレートの各ウェルにRNase A溶液20マイクロリットルを加え、37°Cで1時間インキュベートします。この後、PCR増幅のために3マイクロリットルのゲノムDNAを使用し、PCRマシンをセットアップします。テキストプロトコルに従って、PCR陽性クローンを6つのウェルプレートで成長させます。クローンが90%合流したら、PBSで細胞を洗浄し、各ウェルにタンパク質添加Kを用いた250マイクロリットルのリシスバッファーを加えます。細胞スクレーパーを使用して細胞を掻き取り、Lysateを1.5ミリリットルのチューブに移します。リザットを摂氏37度で16時間インキュベートします。Lysateに1ミリリットルのエタノールを加え、激しく振ります。テキストプロトコルに従って、クローンをF-12Kメディアで拡張できるようにします。次に、70%合流に達したら、細胞にCre-発現アデノウイルスを加えます。感染から48時間後、細胞を3つの10センチメートルの皿に分ける。次いで、細胞凍結、およびRNA抽出のための第3の皿を培養する。まず、TERRA-MS2クローンと野生型AGS細胞をガラス底皿に盛り付けます。次いで、ポリブレンとMS2-GFP発現レトロウイルスを培地に加えます。24時間後、レトロウイルスを含む培地を廃棄し、細胞にフェノールを含まない新鮮な培地を添加した。最後に、反転顕微鏡と敏感なカメラを使用して、適切な目的と絞りを持つ細胞を画像化します。このプロトコルでは、単一サブテロメアでMS2配列タグを含む癌細胞クローンを作成し、画像化した。ネオマイシン耐性クローンをPCRを用いてスクリーニングした。陽性クローンを、ゲノムDNA抽出およびサザンブロット分析のためにlysedで培養した。PCRおよびサザンブロット分析に陽性のクローンを、MS2カセットに存在するネオマイシン遺伝子を除去するためにアデノウイルスを発現するCRE-GFPに感染した。ネオマイシン耐性遺伝子の排除が確認されると、クローンから抽出したRNAが、TERRA-MS2転写産物の発現について試験された。共焦点顕微鏡法により生細胞のテラ-MS2転写物を可視化するために、選択したクローンをMS2-GFP融合タンパク質を発現するレトロウイルスに感染した。TERRA-MS2転写物とテロメアは、MS2-GFP融合タンパク質とmCherry融合テロメア結合タンパク質TRF2を選択クローン中に共発現させることにより、共焦点顕微鏡を介して生細胞で同時に可視化された。この手順を実行する場合は、クローンの混合作成ではなく、単一のクローンを選択するあらゆる努力を行うことが重要です。この手順に従って、染色体上のDNA FISHのような他の方法は、固定細胞におけるMS2カセットの統合を可視化するために使用することができる。その開発後、この技術は、テロメアの分野の研究者が生きているヒト細胞における単一テロメアTERRA分子の細胞局在化を探求する道を開く可能性がある。ウイルスベクターや放射性物質を使用することは非常に不確実であることを忘れないでください。また、ラボコート、手袋を着用し、放射線を最小限に抑えるためにプレキシガラスシールドを使用するなど、予防措置は、この手順を実行する際に必ず取られるべきです。

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Research

JoVE Journal

Genetics

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具体的にはヒト細胞における選択的スプライシングを操作するために工学人工要因

学ぶ単一テロメア由来のTERRA可視化法。がん細胞クローンを用いて生細胞内のテロメア関連非コードRNAをリアルタイムで観察し、テロメア機能とがん生物学の理解を深める革新的アプローチです。

生きている細胞の単一テロメアから表現されるテロメア繰り返し含む RNA テラを視覚化するがん細胞クローンの生成

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