Name: 無機ポリリン酸の細菌のための試金 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 学ぼう、無機ポリリン酸を迅速かつ高感度に定量する新手法。グラム陰性菌・陽性菌・抗酸菌など多様な細菌種に適用可能で、従来法より簡便かつ低コストです。細菌のストレス応答研究に有用です。

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このプロジェクトは、バーミンガム講座スタートアップ資金および NIH グラント R35GM124590 (MJG) に NIH グラント R01AI121364 (FW) にアラバマ大学によって支えられました。

1. 浄化酵母 Exopolyphosphatase (ScPPX)
<ol><li>エレクトロポレーション32または33化学変換によって大腸菌蛋白質過剰発現株プラスミド pScPPX26 BL21(DE3)31を変換します。</li>
	<li>BL21(DE3) pScPPX2 を含む単一コロニーを 2 L ないフラスコ 100 μ g mL-1アンピシリンを含むホストゲノム スープ (LB) の 1 L を接種して 600 で吸光度を振ることがなく 37 ° C で一晩インキュベート nm (600) の約0.3、分光光度計で測定しました。</li>
	<li>文化 (180 rpm) を揺れを起動し、セルが 0.4 - の A600に成長する時間の間に、37 ° C で 30 分間インキュベート 0.5。</li>
	<li>最終濃度 1 mM と、追加 100 μ g mL-1アンピシリン、イソプロピル β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) を追加し、180 rpm で振とうしながら 37 ° C で 4 時間孵化させなさい。 注: この過剰発現プロトコルは可溶性 ScPPX の大規模な量を生成します。ただし、ScPPX の過剰発現は非常に寛容とさまざまなその他の一般的な蛋白質過剰発現のプロトコルは正常に ScPPX を浄化するために使用されています。</li>
	<li>1 L 遠心ボトルにセルを転送し、4 ° C で 5000 × g で 20 分間遠心分離することでそれらを収穫上澄みを除去し、細胞ペレットを 50 mL の円錐管に転送します。 注: 細胞ペレット格納できます無期限に-80 ° C で</li>
	<li>氷上では、ペレットを解凍し、50 mm HEPES 9 mL、0.5 M の NaCl および 5 mM のイミダゾール (pH 8) 約 10 mL の容量のためにそれを再懸濁します。</li>
	<li>(最終濃度) 1 mg mL-1リゾチーム、2 mM MgCl2、および RNA と DNA 分解酵素の 50 単位 mL-1を追加 (材料の表を参照) し、氷上で 30 分間インキュベートします。 注: ScPPX バインド (データは示されていない)、核酸精製ヌクレアーゼ治療が必要であるので。</li>
	<li>超音波発生装置を用いた、陰極 (材料の表を参照)、50% の電力、パルス 5 氷に対する超音波照射の 2 サイクルで細胞を溶解 s サイクル間 2 分休憩と 5 s。 注: は、超音波処理中に適切な公聴会保護を使用します。同様に過剰発現ケースに、さまざまなセル換散方法は ScPPX 浄化のため許容されます。</li>
	<li>ライセートの 4 ° C で 20,000 × g で 20 分間遠心分離によって不溶性の残骸を削除します。0.8 μ m 孔サイズ酢酸セルロース シリンジ フィルターを通して結果上清 (約 10 mL) をフィルターします。</li>
	<li>読み込む列をキレート ニッケル充電の 5 mL に溶解液 (材料表参照) 蠕動性ポンプまたは大規模な注射器を使用して。</li>
	<li>50 ml 50 mM HEPES、0.5 M の NaCl 5 mM のイミダゾール (pH 8) の列をすすいでください。</li>
	<li>50 ml 50 mM HEPES、0.5 M の NaCl、20 mM のイミダゾール (pH 8) の列をすすいでください。</li>
	<li>50 mm HEPES ScPPX、0.5 M の NaCl と 0.5 M イミダゾール (pH 8) 収集 15 1 mL の一部分を溶出します。ブラッドフォード蛋白質の試金34コンテンツ蛋白質のためのこれらの溶出画分をテスト (材料の表を参照) を分数に浄化された ScPPX が含まれている確認する SDS ページのゲル35を実行し、(分子量 = 45 kDa)。</li>
	<li>純粋な ScPPX を含む画分をプールし、約 2 mg mL-1 50 mM HEPES と 0.5 M の NaCl をプールされたタンパク質の濃度を調整します。高蛋白質濃度は、次の手順で沈殿させるかもしれない。</li>
	<li>透析によるストレージ バッファー (20 mM トリス-HCl [pH 7.5] 50 mM KCl、10% [v] のグリセロール) に精製した ScPPX を交換します。シール長さ 12,000-14,000 Da 分子量カットオフ透析膜チューブ (材料の表を参照してください) のプール ScPPX 分数を置き、1 l 連続攪拌 4 ° C で少なくとも 4 h、新鮮なこの手順でストレージ バッファーの中断ストレージ バッファー バッファーの 3 つの変更の合計のため。</li>
	<li>遠心分離機管または管不溶性集計を削除する 4 ° C で 20,000 × g で 20 分間遠心分離して精製、透析の蛋白質を転送します。慎重にきれいな 15 mL コニカル チューブに上清を転送します。</li>
	<li>1 mg mL-1ストレージ バッファーに精製した ScPPX の濃度の調整、追加 0.1% (w/v) プロテアーゼ無料ウシ血清アルブミン (BSA; 最終濃度) と 4 ° C で最大 6 ヶ月のための店 注: ScPPX は、冷凍13だとその活動の 90% 以上を失います。</li>
</ol>2. ポリリン酸抽出のサンプルを収穫
<ol><li>ポリープのコンテンツを決定する金利の条件下で細菌を成長します。このプロトコルのリンゴ酸酵素誘導 (MEI) 中37システイン (メイ C) なしで振動なし乳酸菌ロイテリ36 37 ° C で一晩で育ちます。</li>
	<li>細胞蛋白質の 50-100 μ g の合計 1.5 mL 遠心チューブに遠心分離によって十分なセルを収穫 (下記の手順 3 を参照)。これは 0.2 - A600でログ相文化の 1 mL、エシェリヒア属大腸菌、0.4。これは、 l. ロイテリ、一晩文化の 1 mL です。興味の他の種のために必要に応じて調整します。</li>
	<li>細胞ペレットから上清を完全に削除します。</li>
	<li>GITC 換散バッファー (4 M グアニジン イソチオ シアン酸、50 ミリメートル トリス-HCl、pH 7) の 250 μ L で細胞ペレットを再懸濁し、10 分-80 ° C でストア lysates 95 ° C で培養による溶解させます。 注: は、高温で長期の潜伏が加水分解38ポリープの劣化になるので溶解時間と一致します。Lysates は-80 ° C で不明確に保存されることができます。 注意: イソチオ シアン酸グアニジン カオトロ ピック塩ですと手袋をはめて処理、有害廃棄物としています。</li>
</ol>3. セル Lysates のタンパク質含有量の測定
<ol><li>0、0.1、0.2、0.4 mg mL GITC 換散バッファー内-1 BSA の含まれている BSA 基準を準備します。 注: GITC ブラッドフォードの試金の発色に影響を与えるので、GITC で BSA の基準にすることが重要です。BSA の標準は、-20 ° C で不明確に保存されることができます。</li>
	<li>分注 5 μ 解凍、十分に混合されたセル lysates と BSA 基準クリア 96 ウェル プレートで井戸を分離します。</li>
	<li>各ウェルにブラッドフォード試薬34 195 μ L を追加し、595 で吸光度を測定プレート リーダーで nm (595) (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>数式 y を使用して BSA の標準曲線と比較して各ウェル中の蛋白量を計算 = mx+b と、y は595x は BSA の μ g、m は標準曲線の傾き、b は標準曲線の y 切片です。各サンプルの蛋白質の総 mg は、0.05 を結果の値を掛けます。</li>
</ol>4. ポリリン酸の抽出
<ol><li>各サンプルの GITC 分離とミックスする渦に 95% のエタノールの 250 μ L を追加します。</li>
	<li>シリカ膜のスピン列と 30 の遠心分離機に混合物を適用 16,100 x g で s。</li>
	<li>流れを破棄し、50 mM NaCl、5 ミリメートルの EDTA、50% エタノールと 30 の遠心分離機 (pH 7.5)、5 mM トリス-HCl の 750 μ L を追加 16,100 x g で s。</li>
	<li>フロー ・ スルーと 16,100 x g で 2 分間遠心を破棄します。</li>
	<li>きれいな 1.5 mL および microfuge の管に列を配置し、50 mm トリス-HCl (pH 8) 150 μ L を追加します。</li>
	<li>5 分間室温でインキュベートし、8,000 の x g で 2 分間遠心分離によってポリープを溶出します。 注: 必要な場合、溶出格納できます-20 ° C で少なくとも 1 週間。</li>
</ol>5. ポリリン酸の消化
<ol><li>0、5、50、または 50 mm トリス-HCl (pH 8) リン酸カリウム 200 μ M を含む基準を準備します。 注: カリウム リン酸基準は、室温で不明確に保存することができます。</li>
	<li>分注 100 μ L 標準リン酸塩とは、クリア 96 ウェル プレートの別の井戸にポリープのサンプルを抽出しました。</li>
	<li>(サンプルごと) を含んでいるマスターの組合せを準備: 5 x ScPPX 反応バッファー (100 mM トリス-HCl、MgCl225 mM、250 mM 酢酸アンモニウム、pH 7.5)13の 30 μ L、19 μ L H2O の 1 μ L の精製 ScPPX (1 mg mL-1)。</li>
	<li>96 ウェル プレートの各ウェルにマスター ミックスの 50 μ L を追加します。37 ° C で 15 分間インキュベートします。 注: 必要な場合消化ポリープ サンプルが-20 ° C で不明確に保存されます。</li>
</ol>6. 検出フリーのりん酸塩24
<ol><li>だから 4 N H2の 150 mL を追加、水の 200 mL の酒石酸アンチモン カリウム 0.185 g を溶解することにより検出ソリューション ベースの準備4、アンモニウム heptamolybdate の 1.49 グラムを追加します。溶解し 456 mL の最終巻にかき混ぜます。1 ヶ月の 4 ° C で光から保護された微粒子を取り出して保管するのにソリューションをフィルターします。</li>
	<li>1 M アスコルビン酸の原液を準備します。1 ヶ月の 4 ° C で光から保護されたストア。</li>
	<li>1 M アスコルビン酸 0.88 ml 検出ソリューション ベースの 9.12 mL を混合することによって、新鮮な在庫検出ソリューションの毎日を準備します。使用する前に室温に来る検出ソリューションを許可します。</li>
	<li>各サンプルと 96 ウェル プレートで標準に検出ソリューションの 50 μ L を追加し、色の開発を許可するように約 2 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>882 で吸光度を測定プレート リーダー nm カリウム リン酸標準曲線に比較して各サンプルのリン酸濃度を計算します。 注意: 検出ソリューションには、有毒な塩と強い酸が含まれています。手袋を着用する、有毒廃棄物として余分なソリューションを扱います。</li>
</ol>7. 細胞ポリリン酸の内容を計算します。
<ol><li>次の式に従ってライセート各セルの全体のポリープ由来リン酸イオンの nanomoles の手順 6.5 で、リン酸濃度を変換します。 nmol ポリープ 1.5 x = (μ M リン酸/10) 注: 手順 6 で標準曲線に基づいたメソッドは、サンプルではそれぞれ 100 μ L ポリープ 5.2 の手順で検体 (μ M) におけるリン酸の濃度を決定します。この濃度を nmol 数に変換する 100 μ L を 10 で割るは6 l、ボリュームを与える濃度 (µmol L-1) で乗算し、1,000 (、µmol の nmol 数) を掛けた。これは濃度を 10 で除算する減少します。手順 4 で準備総エキス量が全体のエキスにリン酸の nmol を計算するために 1.5 結果の値を乗算する必要があるので 150 μ L であります。</li>
	<li>手順 3.4 で確認した各サンプルの mg 総蛋白 nmol ポリープを除して総細胞蛋白質を細胞ポリープ コンテンツを正規化します。ポリープ レベルは個別無料ポリープ由来のリン酸の濃度の観点から表されます。 注: 場合によっては、ポリープ由来リン酸サンプルで現在の量がリン酸標準曲線 (ステップ 6.5) の線形範囲外落ちることがあります。ポリープのレベルが非常に高い場合、ステップ 4.6 から余分なポリープを含む溶出液は希釈 1:10 または 1: 100、必要に応じてすることができ、5 7 からの手順の説明に従って再度測定します。</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで説明されているプロトコルは、簡素化、24 サンプル処理に約 1.5 時間を取っての典型的なセットを持つ多様な細菌のポリープ レベルの定量化を加速します。これはサンプルの迅速なスクリーニングと変異ライブラリ解析が可能、簡単に時間をかけてポリープの蓄積を測定の実験。プロトコルが 3 つ門の代表者で効果的に動作することを実現した: フィルミクテス門、プロテオ バクテリアとアクチノ バクテリアは、その弾力性のあるために悪名高いが、細胞壁49を分離することは困難。
ScPPX と消化によるポリープの検出はより具体的と、DAPI の蛍光検出より敏感より安くより技術的にポリープの PPK を使用して ATP への変換よりも簡単です。ScPPX は、DNA および RNA の12によって阻害される、我々 は以上 6,000 nmol ポリープ mg-1蛋白質29を含んでいる細菌でさえ完全な消化力を達成するために非常に大過剰の酵素...

無機ポリリン酸 (ポリープ) はライフ1,2,3のすべてのドメインである phosphoanhydride リンク リン酸単位の線形生体高分子です。多様な細菌でポリープは欠かせないストレス反応、運動、バイオ フィルム形成、細胞周期制御、抗生物質耐性、病原性4,5,6,7,8 ,9,10,11。ポリープ細菌で代謝の研究したがって病気を引き起こす、さまざまな環境で繁栄する細菌の能力に根本的な洞察力をもたらす可能性があります。多くの場合、細菌細胞における定量化のポリープとして使用する方法が、これらの研究を制限する要素です。
現在ポリープ生体試料中濃度を測定するために使用するいくつかの方法があります。これらのメソッドは通常 2 つの明瞭なステップを含む: それらの抽出物でポリープを抽出し、ポリープを定量化を提示します。Bru と同僚で12フェノールを使用する RNA と DNA 抽出ポリープ酵母酵母として開発した現在の金本位法、クロロホルム、エタノールの沈殿物、治療が続く出芽酵母ポリープ分解酵素 exopolyphosphatase (ScPPX)13を使用して定量化は、フリーのりん酸塩を生成するために結果として得られる精製ポリープの消化およびリボヌクレアーゼ (RNase)、デオキシリボヌクレアーゼ (DNase)、マラカイト グリーンを用いた比色定量法。この手順は、非常に数量が、労働集約的な単一の実験で処理することができ、細菌性のサンプルのために最適化されていませんするサンプルの数を制限することです。他の人はさまざまな細胞や組織をシリカビーズ ("glassmilk") またはシリカ膜列6,14,15,16,17を使用してからポリープを抽出を報告しています。 18。これは主に合成と一般的に考えられている細菌をそれほど考慮これらのメソッドは効率的に短鎖ポリープ (未満 60 リン酸単位)12,14,15, を抽出できません。長鎖ポリープ3。強い酸19,20を使用してポリープ抽出のより古い方法はもはや広く利用されてポリープは酸性条件12の下で安定しているので。
また、さまざまな定量化ポリープの報告方法があります。最も一般的なの間では 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 蛍光色素の詳細は通常、DNA を染色に使用です。DAPI ポリープ錯体 DAPI DNA 複合体21,22より異なる蛍光励起と放射マキシマが RNA、ヌクレオチド、イノシトールなど他の細胞部品からかなりの干渉があります。リン酸塩12,15,16,23, 特異性とこのメソッドを使用してポリープ測定の感受性を減らします。ポリープとアデノシン二リン酸 (ADP) をアデノシン三リン酸 (ATP) を精製した大腸菌を使用してに変換する代わりに、ポリープのキナーゼ (PPK) およびルシフェラーゼ14,17 を用いて定量化結果 ATP ,18。これはポリープの非常に少量の検出が可能、2 つの酵素反応ステップ ルシフェリンと非常に純粋な ADP は、高価な試薬であるが必要です。ScPPX フリーのりん酸塩6,12,13,24、簡単な方法、しかし ScPPX を使用して検出することができますに特にダイジェスト ポリープは DNA および RNA の12によって阻害されます。ポリープを含む必要と DNase、RNase 処理を抽出します。PPK も ScPPX も市販と PPK の浄化は比較的複雑な25,26。
DAPI 染色27,28,29,30、チェーン長さの評価を許可して、メソッドは負で、セル lysates または抽出物でポリープのポリアクリルアミドゲルで視覚化できるも低スループットと低い定量。
我々 は今多様な細菌種のレベル ポリープの急速な定量化を可能にする安価な高速、中速のポリープ アッセイを報告します。このメソッドは、複数のサンプルの迅速な処理のために最適化されたシリカ膜列抽出に続いて携帯電話のホスファターゼを不活化する 95 ° c 4 M グアニジン イソチオ シアン酸 (GITC)14で細菌細胞の分離によって開始します。得られたポリープを含む抽出液は、DNase、RNase の治療の必要性を排除する ScPPX の大過剰と消化されます。ScPPX の mg 量の簡単なニッケル親和性の浄化のためのプロトコルが含まれます。最後に、ポリープ由来フリーのりん酸塩は、単純な敏感なアスコルビン酸ベースの比色定量法24の定量化し、総細胞蛋白質に正規化します。このメソッドは、細菌細胞、ポリープの測定を合理化し、グラム陰性菌、グラム陽性菌、抗酸菌の代表種でその使用を示します。

<table><tbody><tr><td>大腸菌 BL21(DE3)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>69450</td><td></td></tr><tr><td>プラスミド pScPPX2</td><td>Addgene</td><td>112877</td><td>学術機関およびその他の非営利団体に利用可能</td></tr><tr><td>LBブロス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1427-2</td><td>E. coli 増殖培地</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>BP176025</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル &β;-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)</td><td>ゴールドバイオテクノロジー</td><td>I2481C</td><td></td></tr><tr><td>HEPES緩衝液</td><td>ゴールドバイオテクノロジー</td><td>H-400-1</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カリウム (KOH)</td><td>HEPES緩衝液のpHを調整するための</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>P250500</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>S27110</td><td></td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>フィッシャー科学</td><td>O3196500</td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>AAJ6070106</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム (MgCl2)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>ピアスユニバーサルヌクレアーゼ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>PI88700</td><td>ベンゾナーゼ (Sigma-Aldrich cat. # E1014) は、許容される代替</td></tr><tr><td>モデル 120 ソニック ディスメンブレーター</td><td>フィッシャー サイエンティフィックです</td><td>FB-120</td><td>他の細胞溶解法 (例: French Press) も効果的です</td></tr><tr><td>5 mL HiTrap キレート HP カラム</td><td>GE Life Sciences</td><td>17040901</td><td>任意のニッケル アフィニティー クロマトグラフィー カラムまたは樹脂を置換できる</td></tr><tr><td>ニッケル (II) 硫酸塩 六水和物</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC415611000</td><td>HiTrap カラム</td></tr><tr><td>0.8 & マイクロ;m 細孔サイズ 酢酸セルロース シリンジ フィルター</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-302-168</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 試薬</td><td>Bio-Rad</td><td>5000205</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1525</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum&nbsp;Spectra/POR 4 RC透析膜チューブ 12,000 to 14,000 ダルトン MWCO フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>08-667B</td><td>MWCO < 30,000 Daの他の透析膜も塩</td></tr><tr><td>酸(HCl)</td>を機能させる必要がありますフィ<td>ッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>A144-212</td><td>トリス緩衝液のpHを調整するため</td></tr><tr><td>塩化カリウム(KCl)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td></td>P217500<td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2294</td><td></td></tr><tr><td>10x MOPS中混合物</td><td>Teknova</td><td>M2101<</td><td>em>大腸菌増殖培地</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>D161</td><td></td></tr><tr><td>一塩基性リン酸カリウム(KH2PO4)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>二塩基性リン酸カリウム(K2HPO4)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>BP363-500</td><td></td></tr><tr><td>脱水酵母エキス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>DF0886-17-0</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>M63-50硫酸</td><td></td></tr><tr><td>マンガン一水和物</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>M113-500</td><td></td></tr><tr><td>グアニジンイソチオシアネート</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>BP221-250</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(プロテアーゼフリー)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>BP9703100</td><td></td></tr><tr><td>クリアフラットボトム96ウェルプレート</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>M0812-100EA</td><td>任意のクリア96ウェルプレートは、</td></tr><tr><td>Tecan M1000無限プレートリーダーTecan</td><td>、Inc.で動作します。</td><td>適用されません</td><td>595nmと882nmで吸光度を測定できるプレートリーダーは機能します</td></tr><tr><td>エタノール</td> フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>シリカ膜スピンカラム</td><td>エポックライフサイエンス</td><td>1910-050/250</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>BP120500</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL マイクロチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC9580154</td><td></td></tr><tr><td>酢酸アンモニウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A637-500</td><td></td></tr><tr><td>酒石酸アンチモンカリウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>AAA1088922</td><td></td></tr><tr><td>4 N 硫酸 (H2SO4)</td> <td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>SA818-500</td><td></td></tr><tr><td>ヘプタモリブデン酸アンモニウム</td><td>フィッシャー・サイエンティフィ</td>ック・<td>AAA1376630</td><td></td></tr><tr><td>・アスコルビン酸</td> フィ<td>ッシャー科学</td><td>的なAC401471000</td><td></td></tr></tbody></table>

無機ポリリン酸の細菌のための試金

Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria

無機ポリリン酸 (ポリープ) は、生活のすべてのドメインからの細胞は、生体高分子を病原性および多くの細菌のストレス反応に必要です。さまざまな労働集約的なまたは小文字を区別しない、その有用性を制限することは、多くの生体物質の定量化のポリープの方法があります。我々 提示ここで細菌、ポリープの定量化のための合理化された方法複数サンプルがあり、ポリープ固有 exopolyphosphatase ScPPX とポリープの消化および検出の迅速な処理のために最適化されたシリカ膜列抽出を使用して、敏感なアスコルビン酸ベースの比色試金とフリーのりん酸塩を生じる。このプロシージャは簡単、安価で、し多様な菌種で、信頼性の高いポリープ定量化。グラム陰性細菌 (大腸菌)、乳酸グラム陽性細菌 (乳酸菌ロイテリ) 抗酸菌種 (アラビノースイソメラーゼ) から代表的なポリープ定量化を提案します。私たちもこれは現在市販されていない ScPPX、mg 量のニッケル親和性の浄化のための単純なプロトコルを含まれます。

プロトコルの主な手順は、図 1の単純な形で立てます。
グラム陰性菌、野生型大腸菌にこのプロトコルの使用を示すため MG165539だった LB (200 rpm) の揺れで 37 ° C で豊富な培地の中間ログ段階に成長して、洗浄し、でさらに 2 時間インキュベートmorpholinopropanesulfonate バッファー (モップ) 最小限中40 g L-1のグルコースと 0.1 ミリメートル K2HPO4、ポリープ14,29の生産を誘導するために知られている状態を含みます。<strong c...

多様な細菌、グラム陰性菌、グラム陽性菌、抗酸菌種を含むポリリン酸の迅速定量のための簡単な方法について述べる。

Inorganic polyphosphate (polyP) is a biological polymer found in cells from all domains of life, and is required for virulence and stress response in many ...

無機ポリリン酸は、細菌ストレス応答の重要な要素です。しかし、細菌中のpolyPを抽出して測定するための古い方法は複雑で労働集約的です。この技術の主な利点は、さまざまな細菌種におけるポリPレベルの迅速、敏感、および安価な定量化を可能にすることです。この手順は、私の研究室の学部生であるアーヤ・ポクラルによって実証されます。まず、一晩で37°Cでシスチンを含まないリンゴ酸菌の尿酸菌を成長させます。遠心この一晩培養物の1ミリリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブで、合計50〜100マイクログラムの細胞タンパク質を得るのに十分な細胞を収穫する。細胞ペレットから上澄み液を完全に取り出し、250マイクロリットルのGITCライシスバッファーを加え、ボルテックスで再中断します。細胞をライスするために摂氏95度で10分間インキュベートします。ライセートを摂氏80度で保存します。まず、GITCのリシスバッファーに1ミリリットル当たり0、1、2、4ミリグラムを含むBSA規格を調製します。アリコート5マイクロリットルの解凍、よく混合された細胞ライセート、および5マイクロリットルのBSA標準は、明確な96ウェルプレートでウェルを分離する。ブラッドフォード試薬195マイクロリットルを各ウェルに加え、プレートリーダーで595ナノメートルで吸光度を測定します。原稿に概説されているBSA標準曲線と比較して、各ウェルのタンパク質量を計算します。各サンプルのタンパク質の総量を求めるには、結果の値に05を掛けます。ポリリン酸抽出を開始するには、各GITC lysedサンプルに95%エタノールの250マイクロリットルを加え、渦を混ぜ合わせます。この混合物を1.5ミリリットルの遠心管に入れたシリカ膜スピンカラムにピペットする。遠心分離機は16、100gで30秒間。流れを捨て、トリス塩酸塩、塩化ナトリウム、EDTA、およびエタノール混合物の750マイクロリットルを加えます。16で遠心分離機、30秒間100 gs。流れを捨て、スピンカラムを16、100 gsで2分間遠心分離します。カラムを清潔な1.5ミリリットルマイクロフュージチューブに入れる。50ミリモルpH 8トリス塩酸塩の150マイクロリットルを追加し、5分間室温でインキュベートします。8,000gで2分間遠心分離してポリPを溶出する。50ミリモルpH 8トリス塩酸塩で0、5、50、または200マイクロモルリン酸カリウムを含む標準を準備することによって開始します。アリコート 100 マイクロリットルの各リン酸塩標準と 100 マイクロリットルの抽出された polyP サンプルを、クリアな 96 ウェル プレートの別々のウェルにします。サンプルごとに、30マイクロリットルの5X ScPPX反応バッファー、19マイクロリットルの水、および精製されたScPPXの1マイクロリットルを含むマスターミックスを準備します。そして、摂氏37度で15分間インキュベートします。検出日に、検出溶液ベース9.12ミリリットルで1モルアスコルビン酸88ミリリットルを混合して検出液の新しい作業ストックを調製し、使用前に室温に来るようにします。96ウェルプレートの各サンプルと標準に50マイクロリットルの検出溶液を追加します。色の発生を可能にするために、室温でプレートを約2分間インキュベートします。プレートリーダーを使用して882ナノメートルで吸光度を測定し、リン酸カリウム標準曲線と比較して各サンプルのリン酸濃度を計算します。次に、リン酸濃度を各細胞のリセート中のポリP由来リン酸のナノモルに変換し、原稿に記載されているように細胞内のポリP含有量を全細胞タンパク質に正常化する。野生型大腸菌は、グラム陰性細菌であり、LBで増殖し、ポリPを産生しなかった。しかし、MOPSで増殖すると、総タンパク質の1ミリグラムあたり約192ナノモルポリPを産生した。ポリPキナーゼを欠く大腸菌デルタppk変異体は、いずれの媒体でもポリPを産生しなかった。エキソポリホスファターゼを欠くデルタppx変異体は、野生型とほぼ同じ量のpolyPを産生した。そして、リン酸輸送に欠陥があるデルタ・フォB突然変異体は、野生型よりも有意に少ないポリPを産生した。野生型L.reuteriは、MEIC培地で一晩成長したグラム陽性細菌で、総タンパク質の1ミリグラムあたり約51ナノモルポリPを蓄積した。PolyPキナーゼを欠いたL.reuteri ppk1ヌル突然変異体は、この量の半分以下を含んでいた。ppk1ヌル変異体におけるこのポリPの存在は、おそらく第2のポリPキナーゼを含むL.reuteriによるものである。マイコバクテリウムスメグマティス株SMR5は、エタノールの不在時にハートマンス・ド・ボン培地で増殖し、全タンパク質の1ミリグラム当たり約141ナノモルポリPを蓄積した。エタノール処理の結果、3倍の増加が生じる。この手順に従って、アクリルアミドゲル電気泳動を行い、polyP鎖長の差を評価することができる。この手順を試みる際には、よくある間違いを避けてください。マイクロタイタープレートウェルに泡を入れないようにし、カラムからマイクロフュージチューブに切り替えるときにサンプルを適切なチューブに移すので注意してください。GITCや強酸での作業は危険であり、この手順を実行している間は常に適切な保護具を着用する必要があることを忘れないでください。

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Immunology and Infection

免疫学と感染症

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キャピラリー電気泳動エレクトロスプレーイオン化質量分析によるイノシトールピロリン酸の絶対定量(英語)

学ぼう、無機ポリリン酸を迅速かつ高感度に定量する新手法。グラム陰性菌・陽性菌・抗酸菌など多様な細菌種に適用可能で、従来法より簡便かつ低コストです。細菌のストレス応答研究に有用です。

無機ポリリン酸の細菌のための試金

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