Name: 構造と原子間力顕微鏡イメージングによるヌクレオソームのダイナミクスを調べる (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: 学ぶ原子間力顕微鏡を用いたヌクレオソームの構造とダイナミクス解析法。CENP-Aを含むセントロメアヌクレオソームの単一分子レベルでの可視化と定量的解析が可能です。

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著者の貢献: YLL と MSD 設計プロジェクトMSD は、ヌクレオソームを組み立てられます。MSD と ZS は、AFM 実験とデータ解析を実行しました。すべての著者を書いて、原稿を編集します。

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

上記で説明したプロトコルはむしろ簡単で、再現性の高い結果を提供しますが、いくつかの重要な問題を強調することができます。官能 AP 雲母は、信頼性と再現性のある結果を得るためキー基板です。APS マイカの高安定性は、画像処理基板を準備されている後少なくとも 2 週間使用できます使用を事前に準備することができますこの基板の重要な機能の 1 つです。59,61ただし、表面が破損するおそれ接着剤の蒸気で雲母金属パックのマウントに使用されます。したがって、プロトコル (セクション 2) で説明されているようにマウント雲母の両面テープタイプを使用することをお勧めします。場合接着剤の使用が必要な場合たとえば、液体の投射のための金属ディスクの雲母の取り付け用接着剤を使用しているユーザー セクション 6.1.3 HS AFM イメージングのサンプル準備のために記述されているものから変更する次の手順をお勧め.雲母は金属のディスクまたは他の固体材料に接着し、接着剤が固化した後に切断されます。接着剤の潜在的な蒸気を削除するアルゴンと雲母を爆破し...

真核細胞の DNA は高度に凝縮し、染色体に組織です。1染色体内の DNA 組織の最初のレベルは、147 のヌクレオソームのアセンブリ DNA の bp は密ヒストン八量体コアに巻いた。2,3ヌクレオソーム粒子単位で非常に小型の染色体が形成されるまではそれから組織されるクロマチンの配列を形成する長鎖 DNA 分子を組み立てます。4クロマチンの分解は DNA 遺伝子の転写とゲノムの複製など重要な細胞プロセスで必要とされる、クロマチンが非常に動的なシステムを無料へのアクセスを提供します。5,6,7さまざまなクロマチン レベルで DNA の動的プロパティを理解が間違いが細胞死やがんなどの病気の開発につながることができる分子レベルの遺伝的プロセスを解明するため重要です。8重要なクロマチン プロパティはヌクレオソームのダイナミクスです。9,10,11,12これらの粒子の高い安定性が結晶学的手法による構造特性できました。2どのようなこれらの研究不足、ヌクレオソーム DNA のメカニズムなどの動的詳細アンラッピング ヒストン コアから動的な経路は転写および複製の過程で必要です。7,9,13,14,15,16また、因子と呼ばれる特別な蛋白質ヌクレオソーム粒子17の分解を容易にするために示されています。ただし、ヌクレオソームの本質的なダイナ ミックスは全体分解プロセスに貢献するこのプロセスで重要な要因であります。14,16,18,19
単一分子蛍光19,20,21、光学トラップ (ピンセット)13,18,22,23 AFM などの単一分子技術10,14,15,16,24,25,26はヌクレオソームのダイナミクスを理解することに尽力されています。これらの方法のいくつかのユニークで魅力的な機能から原子間力顕微鏡の利点します。原子間力顕微鏡を視覚化しより長い配列27と同様、ヌクレオソームを特徴付けることができます。AFM 像からヌクレオソーム構造 DNA のヒストンのコアの周りをラップの長さなどの重要な特性は、測定10,14,26,28をすることができます。ヌクレオソーム アンラップ ダイナミクスの解析の中核となるパラメーターです。過去の原子間力顕微鏡の研究は非常に動的なシステム、DNA がヒストン コア14から自発的にラップを解除できますヌクレオソームを明らかに。ヌクレオソームから DNA の自発的な開梱は afm イメージングが水溶液14,26,29終わったらタイムラプス モードで動作直接可視化した.
高速コマ撮り原子間力顕微鏡 (AFM HS) 計測器の出現は、ミリ秒のタイム スケール14,15,24ヌクレオソーム アンラッピングを可視化を可能にしました。セントロメア特定ヌクレオソームの最近の HS AFM 16,30研究では、標準型に比べヌクレオソームのいくつかの新しい機能を明らかにしました。動原体、染色体分離31の批判的に重要な染色体の一部分のセントロメア ヌクレオソームを構成します。一括クロマチンの正規ヌクレオソームとは異なりは、セントロメア ヌクレオソームのヒストンのコアにはヒストン H332,33ではなくセントロメア ヒストンが含まれています。このヒストン置換結果のセントロメア ヌクレオソーム DNA ラッピングは ~ 120 ~ 147 ではなく bp 正規ヌクレオソーム; の bpセントロメアと正規のヌクレオソームの明瞭な形態をもたらすことができる違いは配列34セントロメア クロマチンを受ける 1 一括に比べ高いダイナミクスを示唆しています。HS AFM16,30研究におけるセントロメア ヌクレオソームで表示される新しいダイナミクス例示の構造と動的特性を直接可視化するこの 1 分子技術によって提供されるユニークな機会ヌクレオソーム。これらの機能の例を簡単に説明し、用紙の端に示されているが。既存のメソッドの変更と同様、ヌクレオソームの AFM イメージングの新しいプロトコルの開発により進歩だった。ここで説明したプロトコルの目的は、単一分子の原子間力顕微鏡のヌクレオソームの研究でこれらの刺激的な進歩のクロマチンの調査でこれらのテクニックを利用したいと思います誰かにアクセスできるようにです。説明されている技法の多くは、ヌクレオソームの研究を超えて問題に適用され他の蛋白質および興味の DNA システムの調査のため使用することができます。出版物35,36,37,38,39,40,41、このようなアプリケーションのいくつかの例を見つけることができます。 42,43,44,45,46,47,48,49と原子間力顕微鏡学の展望様々 な生体分子システムを与えられているレビュー29,50,51,53,54。

<table><tbody><tr><td>プラスミド pGEM3Z-601</td><td>Addgene, Cambridge, MA</td><td>26656</td><td></td></tr><tr><td>PCR Primers</td><td>IDT, Coralville, IA</td><td>カスタムオーダー</td><td>(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'DreamTaq</td></tr> <tr><td>ポリメラーゼ</td><td>ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td><td>EP0701</td><td>200ユニットのカタログ番号</td></tr> PCR<tr><td>精製キット</td><td>Qiagen, Hilden, Germany&nbsp;</td><td>28104</td><td>50ユニットのカタログ番号</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>10708976001</td><td>250 g</td></tr><tr><td>EDTA の</td>カタログ番号 <td>ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td><td>15576028</td><td>500 g</td></tr><tr><td>(CENP-A/H4)2, recombinant human</td><td>EpiCypher, Durham, NC</td><td>16-0010</td><td>50 ug</td></tr><tr><td>H2A/H2B, recombinant human</td><td>EpiCypher, Durham,NC</td><td>15-0311</td><td>50 ug</td></tr><tr><td>H3 Octamer, recombinant human</td><td>EpiCypher, Durham, NC</td><td>16-0001</td> カタログ<td>番号 50 ug</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL</td><td>ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td><td>69574</td><td>10 デバイスのカタログ番号</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>S9888-500G</td><td>500 mg</td></tr> <tr><td>のカタログ番号アミコンウルトラ-0.5&nbsp;mL遠心フィルター&nbsp;</td><td>Millipore-sigma, Burlington, MO</td><td>UFC501008</td><td>8 デバイスのカタログ番号</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>258148-25ML</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>T0377-25G</td><td>25 g</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>の</td>カタログ番号 <td>11667289001 1 kg</td></tr><tr><td>過硫酸アンモニウム (AmmPS) のカタログ番号&nbsp;</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td>1610700</td> カタログ<td>番号 10 g</td></tr><tr><td>30% アクリルアミド/Bis 溶液、37.5:1</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td>1610158</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>カタログ番号 TEMED</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td>1610800</td> カタログ<td>番号 5 mL</td></tr><tr><td>4x Laemmli タンパク質サンプルバッファー SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td>用 カタログ番号 1610747</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>2-ME</td> <td>カタログ番号Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>M6250-10ML</td> カタログ<td>番号 10 mL</td></tr><tr><td>ageRuler Prestained Protein Ladder 用&nbsp;</td><td>ThermoFischer Scientific, Waltham, MA</td><td>26616</td><td>カタログ番号 for 500 uL</td></tr><tr><td>Bio-Safe&trade;Coomassie Stain</td><td>Bio-Rad, Hercules, CA</td><td>1610786</td><td>1 L</td></tr><tr><td>不織布クリーンルーム用ワイプのカタログ番号: TX604 TechniCloth&nbsp;</td><td>TexWipe、Kernersvile、NC</td><td>TX604</td><td></td></tr><tr><td>Muscovite Block Mica</td><td>AshevilleMica、ニューポートニューズ、バージニア</td><td>州グレード1</td><td></td></tr><tr><td>アミノプロピルシラトラーン(APS)</td><td>に記載されているように合成 22</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ</td>州<td>H4034-25G</td><td>25 g 25 g</td></tr><tr><td>Scotch Tape</td><td>Scotch-3M、セントポール、ミネソタ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>州TESPA-V2 AFMプローブ(静止画像用)</td><td>Bruker AFM Probes, Camarillo, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSNL-10 AFMプローブ(標準タイムラプスイメージング用)</td><td>Bruker AFM Probes, Camarillo, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aron Alpha Industrial Krazy Glue</td><td>Toagosei America, West Jefferson, OH</td><td>AA480</td><td>2 gチューブ用カタログ番号</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>M8266-100G</td><td>カタログ番号100 g</td></tr><tr><td>Millex-GPフィルター、0.22&nbsp;&マイクロ;m</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>SLGP05010</td><td>カタログ番号 10台用</td></tr><tr><td>BL-AC10DS-A2 AFMプローブ(HS-AFM用)</td><td>オリンパス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compound FG-3020C-20&nbsp;</td><td>フロロテクノロジー株式会社、Kagiya、Kagungai、Kajugai、Japan&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コンパウンド FS-1010S135-0.5&nbsp;</td><td>フロロテクノロジー株式会社、Kagiya、Kagungai、Kajugai、Japan&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiMode Atomic Force Microscope</td><td>Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy</td><td>Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

構造と原子間力顕微鏡イメージングによるヌクレオソームのダイナミクスを調べる

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

ヌクレオソームのサブユニットの長い鎖であるクロマチンは、真核細胞の DNA 複製と転写を場所としてこのような重要なプロセスは、動的なシステムです。ヌクレオソームのダイナミクスは、dna 複製と転写の機械によってアクセスが提供し、クロマチン機能発現の分子機構に非常に貢献します。イメージング原子間力顕微鏡 (AFM) など単一分子の研究は、ヌクレオソーム構造とダイナミクスの役割の私達の現在の理解に大きく貢献しています。現在のプロトコルは、ヌクレオソームの構造と動的性質の研究に高分解能 AFM イメージングを有効にする手順を説明します。プロトコルは、H3 ヒストンがその相手の動原体タンパク質 (セントロメア) に置き換えられますセントロメア ヌクレオソームの得られた原子間力顕微鏡データによって示されています。プロトコルは連続希釈法によるモノラル ヌクレオソームのアセンブリに始まります。基板を準備する手順は、説明および説明ヌクレオソームの原子間力顕微鏡可視化修飾とヌクレオソーム イメージングに使用されるアミノプロピル silatrane (APS-雲母) マイカ基板の準備が欠かせません。ヌクレオソーム APS 雲母表面上まずヌクレオソーム人口のスナップショットをキャプチャする静的 AFM を用いたが作成されます。これらの画像解析からラップされたヌクレオソーム DNA のサイズなどのパラメーターを計測でき、このプロセスはまた、詳細な。液体内のプロシージャをイメージング タイムラプス AFM はいくつかのフレームをキャプチャすることができます高速コマ撮り AFM について 1 秒あたりヌクレオソーム ダイナミクスの。最後に、動的過程の定量的な解析を有効にするヌクレオソーム ダイナミクスの解析が説明し、イラストします。

モノラル ヌクレオソーム最初、afm イメージング実験の連続希釈アセンブリ メソッド (図 1) を使用して作製した.準備のヌクレオソームは、不連続 SDS ページ (図 2) を使用してがチェックされたし。雲母表面は次に、APS は、高分解能観察 (図 3) の滑らかな背景を維持しながら表面のヌクレオソームをキャプチャを使用して官能基化。ヌクレオソームは APS 雲母上に堆積したし、その後静的 AFM イメージングの使用をイメージしました。アセンブリおよび沈着のコントロールとして H3 モノラル ヌクレオソーム調製し、, 静的な原子間力顕微鏡を使ってイメージ化します。H3 のモノラル ヌクレオソーム (図 4 a) のイメージ ヌクレオソーム人口のスナップショットが提供堆積、ヌクレオソームが正常に組み立てられていることを確認する前に瞬間が存在していた。2 nM ヌクレオソーム蒸着表面全体にヌクレオソ...

ここでは、静的および時間経過の原子間力顕微鏡 (AFM) イメージング技術を使用して単一分子レベルでのヌクレオソーム粒子の特性評価にプロトコルを提案します。説明表面機能化手法により構造のキャプチャとダイナミクスのヌクレオソームのナノスケールで高解像度。

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

このプロトコルは、AFMのすべての主要な機能を利用し、他の単一分子技術には非適当である。その結果、核組の構造をナノスケールで解決することが可能です。重要なことに、ヌクレオソームの直接可視化は生理学的条件下で行われた。我々のAFM技術を用いて、我々は最近、中心全体の機能に役割を果たすことができるセントロメアヌクレオソームのユニークな特性を明らかにした。現在、アミロイド凝集体の形成に関連するタンパク質の自己集合性を調べる方法が、当社の研究室で適用されています。これらのタンパク質凝集体は、アルツハイマー病やパーキンソン病などの壊滅的な疾患の発症を引き起こします。また、単純な調製方法は、DNA複製機械などの大規模なシステムを含む他のタンパク質-DNA複合体にも適用可能です。いくつかの変更が必要ですが。静的およびタイムラプス原子間力顕微鏡を用いて単一分子レベルで核子粒子を特徴付けるためには、添付のテキストプロトコルに記載されているように、ヌクレオソームを精製、組み立て、検証することから始めます。次に、静止AFMイメージング用のマイカ表面を準備します。これを行うには、まず50ミリモルAPSストック溶液を脱イオン水に調製します。必要になるまで、この溶液の1ミリリットルのアリコートを摂氏4度で保管してください。ストック溶液から、50マイクロモルAPSストックの50マイクロリットルを蒸留脱イオン水の15ミリリットルに溶解して、マイカ改質のための働くAPS溶液を調製する。溶液を混合し、その後、溶液でキュベットを充填します。次に、高品質のマイカシートからマイカのストリップを3センチメートルずつカットします。キュベットに斜めに置くと、ピースが収まることを確認してください。その後、両面が切断されるまでマイカの層を切断し、ピースは0.1ミリメートルと同じくらい薄いです。すぐに、APS充填キュベットにマイカピースを入れ、30分間インキュベートします。マイカピースを蒸留脱イオン水で満たされたキュベットに移し、30秒間浸します。次に、アルゴンを使用してAPSマイカストリップの両側を完全に乾燥させます。いくつかの磁気パックに二重面粘着テープを適用し、側面にそれらを配置します。その後、APSマイカ基板を1センチメートルの正方形に1センチメートルにカットし、きれいなペトリ皿でそれらをカバーします。次に、10ミリモルヘープと4ミリモルの塩化マグネシウムを含む0.22ミクロンの濾過バッファーを用いて、組み立てられたヌクレオソームの3つの希釈液を、PH7.5で調製する。ヌクレオソームの損失を制限するために、低い最終濃度で、希釈はAPSマイカに堆積する直前に一度に1つずつ行われるべきである。APSマイカ片の中心に各ヌクレオソームサンプルの5〜10マイクロリットルを堆積させ、2分間インキュベートさせます。次に、2~3ミリリットルの蒸留脱イオン水でサンプルを穏やかにリンスし、緩衝成分を除去します。そして、アルゴンの光の流れの下で堆積したサンプルを乾燥させます。まず、AFM セットアップのチップホルダーにチップを取り付けます。次に、AFMステージに第1サンプルを取り付け、サンプル表面に接触しないように注意する。レーザーをカンチレバーの上に置き、その合計が最大になるまで、垂直および横方向のたわみ値をゼロ近くに調整します。次に、AFMプローブを調整して共振周波数を見つけ、ドライブの振幅を調整し、画像サイズを100 x 100ナノメートルに設定します。設定が完了したら、エンゲージ ボタンをクリックしてアプローチを開始します。アプローチが完了したら、サンプルの表面がはっきりと見えるまで、振幅設定点を徐々に最適化します。次に、スキャンサイズを 1 ミクロンに 1 ミクロン、解像度を 512 x 512 ピクセルに増やします。最後に、キャプチャ ボタンをクリックして、画像の取得を開始します。ガラスロッドスキャナー接着剤を使用して、ガラスロッドをAFMスキャナーステージに取り付けます。これを最低10分間乾燥させます。その間、大きなマイカシートからパンチを打って、直径1.5ミリメートルの厚さのマイカを0.1ミリメートルの厚さの円形にします。高速AFMマイカガラスロッド接着剤を使用して、このマイカピースを高速AFMのガラス棒に取り付け、乾燥しながら最低10分間手つかずのままにします。次いで、よく切断された層がテープに見えるまで、感圧テープを使用してマイカから層を切断する。次に、蒸留した脱イオン水99マイクロリットルで50ミリモルAPSストックの1マイクロリットルを希釈し、500マイクロモルAPS溶液を作ります。2.5マイクロリットルの溶液を切断したばかりのマイカ表面に沈着し、表面を30分間機能させます。インキュベーションに続いて、3マイクロリットルのリンスを塗布して蒸留脱イオン水でマイカを数回リンスします。マイカの端に不織布ワイプを置くことによって、各すすいに続いて完全に水を取り除きます。最後のすすめの後、3マイクロリットルの蒸留脱イオン水を表面に置き、少なくとも5分間座らせて非特異的に結合したAPSを取り除きます。次に、プローブを高速AFMホルダーに入れ、先端を上に向けてAFMステージにホルダーを置きます。100マイクロリットルの蒸留脱イオン水を使用してホルダーをリンスし、続いて0.22ミクロンの2つの100マイクロリットルリンスを濾過したヌクレオソームイメージングバッファーを使用します。リンスを行い、100マイクロリットルの核組イメージングバッファーでチャンバを充填し、先端を水没させる。レーザーに当たるまで片持ち面の位置を調整します。次に、APSマイカを濾過されたヌクレオソームイメージングバッファで5回リンスし、1リンスあたり4マイクロリットルを使用する。ヌクレオソームアセンブリストックの1マイクロリットルを250マイクロリットルの濾過されたヌクレオソームイメージングバッファに希釈し、最終的なヌクレオソーム濃度の1ナノモルを生成します。表面にこの希釈の2.5マイクロリットルを堆積させ、それを2分間座らせます。4マイクロリットルの核組み合いイメージングバッファーで表面を2回リンスして、過密状態にならないようにします。最後のすまき後、表面をイメージングバッファで覆ったままにしておきます。サンプルが下向きになるように、スキャナーとサンプルを先端ホルダーの上に置きます。アプローチを開始するには、設定点振幅を自由発振振幅に近づけて自動アプローチ関数を使用します。サーフェスが適切に追跡されるまで、セットポイントを調整します。次に、画像領域を150×150ナノメートル前後の200×200ナノメートルに設定し、画像フレームあたり約300ミリ秒のデータ取得率を設定します。アセンブリおよび堆積のための制御として、H3単核体を、静的AFMを用いて調製し、画像化した。この画像は、核種が正常に組み立てられたことを確認する堆積の前に存在していたヌクレオソーム集団のスナップショットを提供します。H3制御アセンブリが成功すると、提示された方法は次にCENP-Aヌクレオソームの研究に適用された。このサンプルの静的 AFM イメージングは、そのアセンブリが成功したことを明らかにしました。静的AFM画像から、単核球体の高さと回転数を特徴付けることができる。遊離DNAアームと遊離DNAアームの長さの間の角度の両方が、個々のヌクレオソームにおけるDNAターンの数を決定するために使用される。対照的に、ヌクレオソームの時間経過AFMイメージングは、ヌクレオソームの全体的な自発的なアンラッピング挙動を可視化するために使用することができる。ヌクレオソームのターン数が減少するにつれて、核コア体積の対応する減少も観察される。通常のタイムラプスイメージングに加えて、高速タイムラプスAFMは、標準のタイムラプスイメージングを使用して見逃されているより複雑なヌクレオソームダイナミクスをプローブするために使用することができます。この技術が長時間にわたってダイナミクスを捉える能力は、1200フレームにわたって捕捉されたCENP-Aヌクレオソームコアの長距離転位の視覚化に不可欠であった。この技術は、あるDNA基質から別のDNA基質へのCENP-Aヌクレオソームコアの稀な伝達を捕捉する上でも重要であった。高速な画像キャプチャレートにより、この動的イベントの視覚化は、完了するまでに数フレームしかかからなかったため、可能になりました。広いクロマチン分野では、ライガーヒストンの役割とクロマチンダイナミクスのヒストン倍率に関する重要な質問のセットがあります。これらの質問はすべて、当社のテクニックを使用して答えることができます。

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