Name: 比増殖速度とロタウイルスのセル結合の能力のための試金 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 学ぶロタウイルスの比増殖速度と細胞結合能力の測定法。プラークアッセイとRT-qPCRを用いて、MA104細胞を使用したウイルス学的表現型解析とワクチン開発への応用を探索する。

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この作品は、「、衛生値チェーン: 設計衛生システムとして地域の環境値システム」プロジェクト人類と自然 (地球研、プロジェクト No.14200107) のための研究所によって支えられました。

1. 培地の準備
<ol><li>細胞培養培地 (血清含有培地) をするためには、500 mL の蒸留水にイーグル MEM 粉末の 4.7 g を追加します。20 分せ部屋の温度中クール 120 ° c のオートクレーブ。ウシ胎児血清を追加 (最終濃度: 10%)、L-グルタミン (2 mM)、ペニシリン ストレプトマイシン (1%)、炭酸水素ナトリウム (1.125 g/L)。1 月に 4 ° C で保存します。</li>
	<li>前述の手順 1.1 でなくウシ胎児血清ウイルス伝搬の無血清培地を準備します。1 月に 4 ° C で保存します。</li>
	<li>プラクの試金のイーグル MEM 培地 (フェノールレッドを非含む) 100 mL をオートクレーブで滅菌します。させる中、室温に冷却し、2% を追加売却、2% ペニシリン ストレプトマイシン、4 mM L-グルタミンと 2.25 g/L NaHCO3。4 ° C でのストア</li>
	<li>プラクの試金のためのオートクレーブで 2.5% の agarose のゲル 100 mL を滅菌します。プラクの試金を行った同じ日にゲルを準備します。水お風呂に 47 ° C でゲルを格納します。</li>
</ol>2. 細胞培養
<ol><li>液体窒素容器から MA104 細胞を含む cryotube を削除します。細胞の解凍が 37 ° C で水のお風呂に、cryotube を配置します。T75 フラスコで血清含有培地 20 mL に 1 mL の細胞懸濁液を追加します。2 または 3 日間で 37 ° C、5% CO2インキュベーターでフラスコを孵化させなさい。 注:懸濁液に最終濃度は約 106セル/mL です。</li>
	<li>単層細胞が 80% の confluency に達すれば、上澄みを除去し、ダルベッコ PBS (リン酸緩衝生理食塩水) x 1 の 5 mL で 2 回洗浄を行う。</li>
	<li>フラスコに 0.05% トリプシン-EDTA の 4 mL を追加し、フラスコから細胞をデタッチする 5 分の 37 ° C で孵化させなさい。15 mL チューブ 190 x g で 5 分間遠心し、細胞懸濁液を転送します。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、血清を含む培地で準備 1.1 の 1 mL の播種細胞 (106細胞) を再懸濁します。再懸濁細胞を 100 倍希釈培地とします。</li>
	<li>6 ウェル用プラクの試金) または (の細胞接着アッセイ) 24 ウェル プレートの各ウェルに希釈した細胞懸濁液 3 mL をそれぞれ追加します。2 または 3 日間飽和蒸気下で CO2を 37 ° C、5% でインキュベーターの版を孵化させなさい。 注:T75 フラスコ培養上清中容量 (30 mL) と比較して上清 (1 mL) のサンプル ボリュームを無視できますので時間コース サンプルの収集に適しています。一方、それぞれの上清にウイルスの感染力価は 6 ウェル プレートは通常行なわれるプラクの試金によって測定されます。24 ウェル プレートは、セル結合の試金に利用されます。</li>
</ol>3 ロタウイルスの特定の成長率
注:アカゲザルのロタウイルス (RRV、遺伝子型: RRV 迅速かつ容易に MA104 細胞とプラークを形成できますので、G3P[3]) はこのプロトコルに利用されています。
<ol><li>解凍する場所 37 ° c の水浴中-80 ° C で保存無血清培地でウイルスの懸濁液 (107 pfu/mL) の 1 mL を含むチューブ。ブタ膵臓由来ウイルスの懸濁液 (最終的なトリプシン濃度は 4 μ G/ml) し渦の 1 mL に 1 μ g/μ L トリプシンを追加します。30 分間飽和蒸気下で CO2を 37 ° C および 5% のウイルス懸濁液を孵化させなさい。 注:他のソースからトリプシンを使用できますが、ロタウイルス感染に及ぼす影響を事前にテストする必要があります。</li>
	<li>活性化ウイルス懸濁液 0.1 pfu/細胞への感染 (MOI) の多様性を調整する無血清培地を希釈します。</li>
	<li>(2.1) をめっきセル後 3 日 T75 フラスコの MA104 細胞 (80% 合流) に希釈ウイルスの懸濁液の 1 mL を追加、37 ° C 1 時間インキュベート、フラスコ 15 分毎を軽く振る。</li>
	<li>フラスコにブタ膵臓由来トリプシンの 0.13 μ g/mL を含む無血清培地 30 mL を加えます。飽和蒸気下で CO2を 37 ° C、5% でフラスコを孵化させなさい。</li>
	<li>0、6、12、18、24 でフラスコの上清 1 mL と 36 (または 48) h 後感染 (hpi) を収集し、ピペットを使用して 1.5 mL チューブに上清を置き換えます。</li>
	<li>凍結 (-80 ° C) を行い、3 回 37 ° C サイクルで湯せんで溶かします。4 ° C で 10 分間 12,600 x gでチューブを遠心分離します。上清を収集します。</li>
	<li>細胞画分を除去する蒸留水 0.2 μ m フィルターで上清をフィルター処理します。ウイルス力価を測定のプラクの試金に適用するまで冷蔵庫に保管して上澄み-80 ° C。</li>
	<li>37 ° C の水浴中で収集した上清 (ステップ 3.5) を含むチューブを配置します。10 倍希釈試料 1 mL に 4 μ g/mL のトリプシンを追加し、37 ° C、30 分インキュベートします。</li>
	<li>3.8、30 分インキュベーション中に開始時間コース サンプル (ステップ 3.5) から得られたウイルスの力価を測定のプラクの試金を洗って 6 ウェル プレート 2 ml の 1x PBS で 2 回 MA104 細胞血清含有培地を削除した後。</li>
	<li>直列無血清培地で培養サンプルを希釈し、各ウェルに希釈試料 1 mL を接種します。37 ° C および 5% CO2飽和蒸気下で 90 分間プレートをインキュベートし、プレート 15 分毎を軽く振る。</li>
	<li>インキュベーション後、接種を 6 ウェル プレートから取り外します。(手順 1.3) で調製した培地に 4 μ g/mL のトリプシンを追加します。優しく、即座に各ウェルに agarose のゲル (比率は 1:1) 混合培地 3 mL を追加します。</li>
	<li>(Agarose のゲルは固体になる) まで 10 分以上室温でプレートを維持し、飽和蒸気下で CO2を 37 ° C、5% で 2 日間インキュベートします。 注:井戸の端から寒天培地と混合媒体を注ぐ。</li>
	<li>各ウェルに 1x PBS で希釈した 0.015% 中性赤溶液の 1 mL を追加し、飽和蒸気下で CO2を 37 ° C、5% で孵化させなさい。3 h 後染料を削除し、飽和蒸気下で CO2を 37 ° C、5% で 1 日間インキュベートします。</li>
	<li>次の日は、各ウェルに斑の数をカウントし、pfu/mL を計算します。プラークの数を確保するためにプラクの試金する前にセルの合流を入念にチェックします。</li>
</ol>4 セル結合の試金
注:このプロトコルは、Gilling のレポート13に基づいています。
<ol><li>(2.1 と同じ方法) にブタ膵臓由来ウイルスの懸濁液 (最終的なトリプシン濃度は 4 μ G/ml) し渦の 1 mL に 1 μ g/μ L トリプシンを追加します。1 pfu/セルの MOI を調整する無血清培地にウイルス懸濁液を希釈します。</li>
	<li>24 ウェル プレート トリス緩衝生理食塩水 1 ml を 2 回 MA104 細胞を洗い流し (TBS; 2.53 g/L トリス基地、6.54 g/L の NaCl、KCl、0.3 g/L 0.046 g/l の Na2HPO4蒸留水 1 L に到達する)。</li>
	<li>セル、24 ウェル プレートの各ウェルに希釈したウイルスを懸濁液 100 μ L を接種して, 穏やかな振動 15 分毎との 90 分のための 4 ° C で。</li>
	<li>ウイルスの接種材料を削除し、TBS の 1 mL で 2 回洗浄を行う二本鎖 (ds) RNA のロタウイルスを抽出する 140 μ L の PBS x 1 と 560 μ L の RNA 抽出バッファーを追加 (材料の表を参照) を各ウェル。ピペット (10 x について、またはヘイズやバッファー内セルの汚染物質は発生しませんまで) で十分に混ぜます。</li>
	<li>製造元のプロトコルに従って二重鎖 RNA (dsRNA) を回復した後、dsRNA を変化させなさいすぐに氷の上にチューブを配置し、2 以上インキュベートに 5 分間、95 ° C で熱ブロックの dsRNA の抽出物を含む 1.5 mL チューブを配置します。分。</li>
	<li>逆のトランスクリプションを使用して cDNA を合成キット (材料の表を参照してください)。変性のウイルス RNA 溶液の 4 μ L を加える混合物 (表 1) の 16 μ l を含む PCR チューブと泡を生成しないようにピペット慎重に混ぜます。スピン ・ ダウン チューブ。</li>
	<li>表 2に示す条件下でサーマルサイクラーと逆のトランスクリプションを実行します。CDNA をすぐに使用しない場合は、最長 1 年間、-20 ° C で cDNA を含む PCR チューブを格納します。</li>
	<li>量的な PCR のプライマーを使用 (前方 5'-ACCATCTACACATGACCCTC-3'、逆; 5'-GGTCACATAACGCCCC-3')14と逆を挿入するプローブ (qPCR プローブ; 5'-/ファム/ATGAGCACA/クェンチャー/ATAGTTAAAAGCTAACACTGTCAA/タムラ/3 ')、ターゲット、963-ロタウイルスの NSP3 ゲノム セグメントの 1049 領域 (GenBank ST3 株: X81436)。 注: クェンチャーが曽ら14によって設計されたプローブ挿入します。
</li>
	<li>標準プラスミドを連続的に希釈 (101 106コピー/ml) PCR とグレードの qPCR の混合物 (表 3) に水と qPCR 次の表 4のマスター ミックス (20 μ L/サンプル) を作る。</li>
	<li>96 ウェル PCR プレートのほかにマスター ミックスの 20 μ L を追加し、10 回のピペッティングにより cDNA サンプルの 5 μ L、5 μ L 標準プラスミドをミックスします。表 4に示す条件によると qPCR システムの反応を開始します。</li>
	<li>MA104 細胞表面にバインドされているロタウイルス ゲノムを計算するには、標準的なプラスミッドの既知ゲノム全塩基数の Ct 値と線形回帰を行いサンプルのゲノム数を見積もる。初期接種 (G0)、細胞 (Gt) にウイルス粒子番号バインディングの比率を計算します。</li>
</ol>

<ol><li>Domingo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rna+Virus+Mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Rna Virus Mutations.</a> Annual review of microbiology. 51, 151-178 (1997).</li>
<li>Gouvea, V., Brantly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+rotavirus+a+population+of+reassortants%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Is rotavirus a population of reassortants?</a> Trends in Microbiology. 3, 159-162 (1995).</li>
<li>Rachmadi, A. T., Kitajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free-chlorine+disinfection+as+a+selection+pressure+on+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Free-chlorine disinfection as a selection pressure on norovirus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 84, (2018).</li>
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<li>Matthijnssens, J., Heylen, E., Zeller, M., Rahman, M., Lemey, P., Van Ranst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phylodynamic+analyses+of+rotavirus+genotypes+G9+and+G12+underscore+their+potential+for+swift+global+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Phylodynamic analyses of rotavirus genotypes G9 and G12 underscore their potential for swift global spread.</a> Molecular Biology and Evolution. 27, 2431-2436 (2010).</li>
<li>Mukhopadhya, I., Murdoch, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+molecular+epidemiology+of+rotavirus+infection+after+introduction+of+monovalent+rotavirus+vaccination+in+Scotland%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Changing molecular epidemiology of rotavirus infection after introduction of monovalent rotavirus vaccination in Scotland.</a> Vaccine. 35, 156-163 (2017).</li>
<li>Londrigan, S. L., Hewish, M. J., Thomson, M. J., Sanders, G. M., Mustafa, H., Coulson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+rotaviruses+in+continuous+human+and+monkey+cell+lines+that+vary+in+their+expression+of+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Growth of rotaviruses in continuous human and monkey cell lines that vary in their expression of integrins.</a> Journal of General Virology. 81, 2203-2213 (2000).</li>
<li>Hewish, M. J., Takada, Y., Coulson, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+a2b1+and+a4b1+can+mediate+SA11+rotavirus+attachment+and+entry+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Integrins a2b1 and a4b1 can mediate SA11 rotavirus attachment and entry into cells.</a> Journal of Virology. 74, 228-236 (2000).</li>
<li>Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+the+bacterial+growth+curve%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Modeling of the bacterial growth curve.</a> Applied and Environmental Microbiology. 56, 1875-1881 (1990).</li>
<li>Gilling, D. H., Kitajima, M., Torrey, J. R., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+antiviral+action+of+plant+antimicrobials+against+murine+norovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of antiviral action of plant antimicrobials against murine norovirus.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80, 4898-4910 (2014).</li>
<li>Zeng, S. Q., Halkosalo, A., Salminen, M., Szakal, E. D., Puustinen, L., Vesikari, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+quantitative+RT-PCR+for+the+detection+of+rotavirus+in+acute+gastroenteritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">One-step quantitative RT-PCR for the detection of rotavirus in acute gastroenteritis.</a> Journal of Virological Methods. 153, 238-240 (2008).</li>
<li>Rolsma, M. D., Gelberg, H. B., Kuhlenschmidt, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+for+evaluation+of+rotavirus-cell+interactions%3A+identification+of+an+enterocyte+ganglioside+fraction+that+mediates+group+A+porcine+rotavirus+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Assay for evaluation of rotavirus-cell interactions: identification of an enterocyte ganglioside fraction that mediates group A porcine rotavirus recognition.</a> Journal of Virology. 68, 258-268 (1994).</li>
<li>Brüssow, H., Hilpert, H., Walther, I., Sidoti, J., Mietens, C., Bachmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bovine+milk+immunoglobulins+for+passive+immunity+to+infantile+rotavirus+gastroenteritis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bovine milk immunoglobulins for passive immunity to infantile rotavirus gastroenteritis.</a> Journal of Clinical Microbiology. 25, 982-986 (1987).</li>
<li>Outzen, H., Berglund, G. I., Smalås, A. O., Willassen, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+and+pH+sensitivity+of+trypsins+from+Atlantic+salmon+%28Salmo+salar%29+in+comparison+with+bovine+and+porcine+trypsin%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+B+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Temperature and pH sensitivity of trypsins from Atlantic salmon (Salmo salar) in comparison with bovine and porcine trypsin.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - B Biochemistry and Molecular Biology. 115B, 33-45 (1996).</li>
<li>Saxena, K., Blutt, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Intestinal+Enteroids%3A+a+New+Model+To+Study+Human+Rotavirus+Infection%2C+Host+Restriction%2C+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology.</a> Journal of Virology. 90, 43-56 (2016).</li>
<li>Yin, Y., Bijvelds, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+rotavirus+infection+and+antiviral+therapy+using+primary+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Modeling rotavirus infection and antiviral therapy using primary intestinal organoids.</a> Antiviral Research. 123, 120-131 (2015).</li>
</ol>

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比増殖速度を測定するためのプロトコルは以前のものよりも簡単に、その細胞培養系が確立されていない限り、その他のウイルスについて、適合できます。本研究で我々 は RRV を使用 (G3P[3]) このひずみことができますを形成するため斑ヒトロタより MA104 細胞株を使用する場合。いくつかの人間のロタウイルスは、この細胞のプラークを形成できません。したがって、プラクの試金ではなくフォーカス ユニット (FFU) アッセイ15または中央組織培養感染量 (TCID50) を形成アッセイを適用できます多くのロタウイルス株16。特定の成長率を求める提案するプロトコルは他のウイルスの種類使用できますが、確立された細胞培養系が確立されていないウイルスには適していません。比増殖速度の実験を開始する前にそれはウイルス感染価が増加を開始すると事前に知っている方は、予備テストで静止した段階に達した。あまりにも多くの斑が存在する場合、ウイルス サンプルの希釈率を変更した後もう一度プラクの試金を実施しなければなりません。サンプルを収集する時間後感染 (hpi) は、静止した段階に到達するための適切な時間ポイントを逃した場合、指数関数的成長段階の斜面が過小評価可能性があるためにも重要です。修正ゴンペルツ モデルによって近似における決定係数常に計算してチェックします。修正ゴンペルツ モデルの適合性が低い場合、変更されたロジスティック ・ モデル12などの他の成長モデルは望ましいかもしれません。
プラクの試金のための洗濯または agarose のゲルのため PBS 中またはウイルスの接種材料を削除するとき、細胞の取扱いにそれぞれに速やかに追加する必要がある乾燥から細胞を防ぐために細胞培養プレートのも。同時に、PBS またはセルに agarose の井戸から外れない優しく注ぐ必要があります。この手順は、両方の試金 (3.9 と 3.11 のステップ) で最も重要です。プラクの試金にあまりにも多くのサンプルがある場合お勧めしますいくつかの培地瓶に agarose のゲル (100 mL 各最大を推奨) を分割して部屋で約 10 分以内 agarose を使用直前にゲルが固化するまでボトルの保温温度。トリプシンは高温17に脆弱であるため、媒体と十分に冷却後プラクの試金のための agarose にトリプシン溶液を追加する必要があります。
セル結合の試金の細胞の侵入を防ぐために 4 ° C で細胞へのウイルスのバインディングの培養を行う必要があります。Gilling の方法13によると細胞がので、穏やかな揺れが必要 15 分毎孵卵中における低温乾燥になりやすい。その他のキットを活用する RNA 抽出キットを置き換えることができます。RT qPCR の標準曲線の傾きは、約 3.3 をする必要があります、決定係数が 0.98 以上にする必要があります。細胞におけるウイルスの局在を可視化する蛍光顕微鏡と比較して、アッセイより迅速かつウイルスへの蛍光物質の結合は必要ないので使いやすい。
最近では、同様の細胞構成と機能を示すひと腸 enteroid (HIE) ひと消化管上皮としてロタウイルスの伝播の18利用可能になりました。日枝の使用が可能となり特定の成長率とロタウイルスの培養株の細胞結合の能力を評価します。また、ここで説明した両方の実験両方の表現型19に対する薬剤の効果の評価に適用できます。ここで紹介するプロトコルは、定量的議論する様々 な条件下でのロタウイルス株の表現型のパラメーターの値を変更することが可能。

RNA ウイルスの突然変異の率、2 DNA ベースの有機体のそれよりも高いため準種1、知られている、遺伝的に多様な人口を形成します。準種の人口構造は、突然変異、淘汰圧、遺伝的浮動など人口の遺伝的要因の影響を受けます。単一の遺伝系統系統は、遺伝的多様性のため異なった表現型を示すかもしれない。たとえば、Rachmadi らは遊離塩素感度がプラーク精製ひずみ S7 PP33から発信されたマウスノロ ウイルス核酸系統間で異なっていたことを示した。
ロタウイルス (レオウイルス科家族でロタウイルス属) は、準種2を形成 ds のエンベロープを持たない RNA ウイルスです。上記人口遺伝的要因に加えては、ゲノム遺伝子再集合は、このウイルスは、11 のセグメント化されたゲノム4ためにロタウイルスの遺伝的多様性を影響します。ロタウイルスは、主に乳児の下痢を引き起こすし、2013 年に乳児の死亡は約 250,0005推定しました。2 つのワクチンでいくつかの国で使用されて、ロタウイルス感染の負荷の低減に効果があったが、一部の研究者はワクチン エスケープ変異体6,7,8,の存在を議論している今9. これらの突然変異体の特性はワクチン エスケープ メカニズムを理解することが重要です。
ここでは、固有の成長率と系統/変異体の間で表現の違いを理解するためにロタウイルスのセル結合能を評価するための 2 つの試金のためのプロトコルを提案する.ロタウイルス感染の成長曲線は、以前レポート10で提示されているが、特定の成長率などの成長パラメーターは通常測定されません。セル結合の試金実施には以前蛍光抗体染色法11が含まれます。定量的表現型ウイルスの違いを話し合うことができるプラクの試金と Rt-qpcr を使用しての簡単な方法を紹介します。これらのメソッドはロタウイルスの表現型の特性のために適切、最終的に複数の遺伝子型の新しいワクチンの建設に貢献するかもしれない。

<table><tbody><tr><td>7500 リアルタイムPCRシステム</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Agar-EPI</td><td>Nakalai Tesque, Inc</td><td>01101-34</td><td>プラークアッセイ</td></tr><tr><td>リン酸水素二ナトリウム</td><td>和光純薬工業株式会社</td><td>194-02875</td><td>細胞結合アッセイ</td></tr><tr><td>Eagle's MEM "Nissui" <img alt="One" src="/files/ftp_upload/58821/01.jpg"></td><td>ニッスイ製薬株式会社</td><td>_05900</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>イーグルのMEM「ニッスイ」 <img alt="Two" src="/files/ftp_upload/58821/02.jpg"></td><td>ニッスイ製薬株式会社</td><td>_05901</td><td>プラークアッセイ</td></tr><tr><td>EasYFlask 75 cm2</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>156499</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>ウシ胎児 セリム、認定、USDA承認地域</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td>細胞培養・プラークアッセイ</td></tr><tr><td>フォワード/リバースプライマー</td><td>ユーロフィン ゲノミクス</td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>L-グルタミン・200 mM ソリューション</td><td>ギブコ</td><td>2530081</td><td>細胞培養・プラークアッセイ</td></tr><tr><td>中性赤</td><td>和光純薬</td><td>140-00932</td><td>プラークアッセイ</td></tr><tr><td>PBS (-) 「ニッスイ」</td><td>ニッスイ薬品工業株式会社</td><td>_05913</td><td>細胞培養・プラークアッセイ</td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン Liguid</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>細胞培養・プラークアッセイ</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>和光純薬</td><td>163-03545</td><td>細胞結合アッセイ</td></tr><tr><td>Premix ExTaq (Perfect Real Time)</td><td>タカラバイオ</td><td>RR039A</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>PrimeScriptTN RT試薬キット(パーフェクトリアルタイム)</td><td>タカラバイオ株式会社</td><td>RR037A</td><td>cDNA合成</td></tr><tr><td>PrimeTime qPCR Probes</td><td>Medical and Biological Laboratories Co., Ltd.</td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>QIAamp Viral RNA Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>52904</td><td>RNA抽出</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>和光純薬</td><td>199-05985</td><td>細胞培養・プラークアッセイ</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>和光純薬</td><td>198-01675</td><td>細胞結合アッセイ</td></tr><tr><td>組織培養プレート 24ウェルプレート</td><td>TPP</td><td>92024</td><td>細胞結合アッセイ</td></tr><tr><td>組織培養プレート</td><td>TPP</td><td>92006</td><td>プラークアッセイ</td></tr><tr><td>トリズマベース</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T1503</td><td>細胞結合アッセイ</td></tr><tr><td>ブタ膵臓由来トリプシン</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T0303-1G</td><td>ロタウイルス</td></tr><tr><td>トリプシンEDTA(0.05%)、フェノールレッド</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>垂直型96ウェルサーマルサイクラー</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>cDNA合成</td></tr></tbody></table>

比増殖速度とロタウイルスのセル結合の能力のための試金

Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus

ロタウイルスは、小児の下痢の主な病因の要因です。二本鎖 (ds) RNA ウイルスであり、高い突然変異率のための準種として知られている遺伝的に多様な人口を形作る。ここでは、特定の成長率とその表現型としてロタウイルスのセル結合能を測定する方法をについて説明します。ロタウイルスは、細胞受容体を認識するトリプシン処理され、MA104 細胞培養に接種されます。ウイルスの後代を含む上清が断続的に収集されます。ウイルス力価を確認するプラクの試金を使用 (プラーク形成単位: pfu) 各収集清。比増殖速度を推定するには、修正ゴンペルツ モデルに pfu/mL の経時データをフィッティング.セルの結合の試金、24 ウェル プレートの MA104 細胞をロタウイルスに感染して、細胞の受容体へのロタウイルスの吸着のための 4 ° C で 90 分間インキュベートします。低温では、宿主細胞に侵入からのロタウイルスを抑制します。非連結の粒子を削除する洗浄後 RNA は細胞受容体 cDNA 合成と逆のトランスクリプションの量的な PCR (RT qPCR) の順に接続されているから抽出されます。これらのプロトコルは、ウイルス系統間の表現の違いを調査するために適用できます。

それぞれ図 1 a 2 aに特定の成長率やプラーク精製 RRV 株の細胞結合の試金のための 2 つのプロトコルの概要を示します。
比増殖速度の測定、最終的なウイルス力価に達する以上 107 pfu/mL T75 フラスコに伝達するとき。最大濃度が 107 pfu/mL 未満の場合 MA104 細胞なる合流がないか RRV トリプシンによってよくアクティブではなかった。感染単位のデータを使用して特定の成長率を推定するためいくつかの成長モデルがあります。このプロトコルの修正ゴンペルツ モデル12例として採用されています。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58821/58821eq1.jpg">
どこ N0 104 pfu/mL 本研究では、Nt (104 108 pfu/mL) が 0 と t ウイルス感染価 (pfu/mL) (例: 0、6、12、18、24、36) hpi、漸近値はそれぞれ、[ログ (N∞/N0)」(例: 3 に 4)、μ は比増殖速度 [1/h]、e はネイピアの定数、λ は遅れ期間 [h]。観測とモデルの値の差の平方和を最小化する解析ソフトウェアのソルバー関数モデルのパラメーターが得られました。図 1 bの例では、特定の成長率 (μ)、0.197 [1/h] と推定される、遅延期間 (λ) 6.61 [h] 初期価 (静止した段階で修正ゴンペルツ モデルと相対ウイルス力価に最小二乗法を適用ログ ・ スケール) (A) は 3.15 [ログ (N∞/N0)]。我々 は、合計で 6 ロタウイルス クローンをテストしているし、〜 0.27 [1/h] 0.19 比増殖速度の推定値。これらの推定値は、モデル当てはめの定量値の係数が 0.98 を超える信頼性の高い。
RRV ウイルス粒子が細胞表面に結合した約 103コピー/ml (バインドの効率は約 1%) のセル結合の試金 (図 2 b) 24 ウェル プレートを使用する場合。アッセイは通常すべてのサンプルのための 3 回を実施し、トリプシンによる RRV の過剰洗浄と十分な活性化などいくつかの問題が発生するサンプルのコピー数に大きな差が見られる場合。約 36.0 を超える qPCR の Ct 値は望ましくないと私たちの qPCR の状態で検出限界以下にみなされています。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>ボリューム/1 反応</td>
		</tr>
<tr>
<td>PrimeScript バッファー x 5</td>
			<td>4.0 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>PrimeScript RT 酵素ミックス私</td>
			<td>1.0 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Oligo dT プライマー</td>
			<td>1.0 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>ランダム 6 mers</td>
			<td>4.0 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>脱イオン蒸留水</td>
			<td>6.0 Μ</td>
		</tr>
<tr>
<td>宿主のサンプル</td>
			<td>4.0 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>合計</td>
			<td>20.0 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: マスター ミックス ロタウイルス ゲノムの cDNA 合成用組成物。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>温度 [° C]</td>
			<td>時間</td>
		</tr>
<tr>
<td>37</td>
			<td>15 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>42</td>
			<td>15 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>85</td>
			<td>5 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>∞</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: ロタウイルス ゲノムの cDNA を合成する反応条件。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>ボリューム/1 反応</td>
		</tr>
<tr>
<td>プレミックス Taq</td>
			<td>12.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>前方プライマー (10 μ M)</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>逆プライマー (10 μ M)</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>プローブ (10 μ M)</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>染料 II を参照します。</td>
			<td>0.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>脱イオン蒸留水</td>
			<td>5.5 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>cDNA サンプル</td>
			<td>5.0 Μ L</td>
		</tr>
<tr>
<td>合計</td>
			<td>25 Μ L</td>
		</tr>
</tbody></table>表 3: マスターは、ロタウイルス ゲノムの量的な PCR のコンポジションをミックスします。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>温度 [° C]</td>
			<td>時間</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>95</td>
			<td>5 分</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>94</td>
			<td>20 s</td>
			<td rowspan="2">45 サイクル</td>
		</tr>
<tr>
<td>60</td>
			<td>1 分</td>
		</tr>
<tr>
<td>72</td>
			<td>5 分</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>表 4: ロタウイルス ゲノムの量的な PCR 反応条件。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig1.jpg"> 図 1: ロタウイルス成長の推定とロタウイルスの成長曲線の図式的な概観します。ロタウイルスの感染単位 (A) はプラクの試金で測定します。(B) 曲線 (青線) は、当研究室 (白丸) で観測されたデータに基づく修正ゴンペルツ モデルによって近似化されました。特定の成長率 [μ];0.197 [h-1] 遅れ期間 (λ);6.61 [h]、初期の力価 (対数目盛) に固定相で相対的なウイルス価 (、);3.15 [ログ (N∞/N0)]。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58821/58821fig2.jpg"> 図 2: 概要と当研究室における斑から精製した 5 の RRV 株の細胞結合の試金の代表的な結果。ロタウイルスを接種した A (A) 細胞培養プレートは細胞にウイルスの侵入を抑制するための 4 ° C で培養しました。培養細胞非連結のウイルス粒子の取り外し後 RT qPCR で細胞表面にバインドされたウイルス粒子由来のゲノムの数を定量化します。(B) セルの結合の結果分析された接種で出席者にバインドされたウイルス粒子の比率だった効率 (%) をバインドとして表示されます。大胆なバー: ボックスの中央値、末尾: 四分位数偏差、行の末尾: 最大値と最小値。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58821/58821fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

2 つのプロトコル、比増殖速度と他のプラクの試金と Rt-qpcr を使用してロタウイルスのセル結合の能力を測定するための 1 つをご紹介します。ロタウイルスの表現型の違いを確認するためは、これらのプロトコルがあります。

Rotavirus is the main etiological factor for infantile diarrhea. It is a double-stranded (ds) RNA virus and forms a genetically diverse population, known ...

ここで提示されたアッセイを用いて、ロタウイルス株間の表現型の差を評価することができ、そこではユニークな株が単離される。具体的には、ロタウイルスの消毒耐性株のフェノチの変化が調べらねない。プラークアッセイを用いた定量的な出力を明確にするため、ロタウイルス株と血清の適切な組み合わせを選択することが重要であり、ロタウイルスは血清に適合している。この手順を実証するのが、研究室の博士課程の学生、門やSyun-sukeです。液体窒素容器からMA104細胞株を含むCryoTubeを取り除きます。細胞を解凍するために摂氏37度の水浴にCryoTubeを置きます。T75フラスコ中の血清含有培地の20ミリリットルに細胞懸濁液の1ミリリットルを加える。フラスコを摂氏37度、5%CO2のインキュベーターに2~3日間インキュベーターでインキュベートします。細胞単層が80%合流に達したら、上清を取り除き、1XダルベッコのPBSの5ミリリットルで細胞を2回洗います。フラスコに0.05%トリプシンEDTAの4ミリリットルを加え、37°Cで5分間インキュベートしてフラスコから細胞を取り外します。細胞懸濁液を15ミリリットルチューブに移し、遠心分離機を190gで5分間移動する。上清を捨て、ペレット化した細胞を1ミリリットルの血清含有培地で再懸濁する。その後、再懸濁した細胞を培地で100倍に希釈する。薄希釈された細胞懸濁液を、プラークアッセイ用の6ウェルプレートのウェルそれぞれに3ミリリットル加えます。希釈した細胞懸濁液を、細胞結合アッセイ用の24ウェルプレートのウェルごとに1ミリリットル加えます。プレートを摂氏37度、5%CO2不飽和蒸気で2~3日間インキュベーターにインキュベートします。ウイルス懸濁液1ミリリットルを含むチューブを無血清培地で、マイナス80°Cの貯蔵から37°Cの水浴に移して解凍します。ブタ膵臓からトリプシンのマイクロリットル当たり1マイクログラムをウイルス懸濁液の1ミリリットルに加え、次に渦を加える。ウイルス懸濁液を摂氏37度、5%CO2不飽和蒸気で30分間インキュベートします。活性化されたウイルス懸濁液を無血清培地で希釈し、感染の多重度(MOI)を細胞当たり0.1 pfuに調整します。希釈したウイルス懸濁液を、細胞めっきの3日後にT75フラスコのMA104細胞に1ミリリットル添加する。37°Cのウイルスで細胞を1時間、15分ごとに軽く振って培養します。次に、ブタ膵臓からフラスコにトリプシン1ミリリットル当たり4マイクログラムを含む無血清培地30ミリリットルを加える。フラスコを摂氏37度、CO2不飽和蒸気5%でインキュベートします。感染後0、6、12、18、24、および36時間でフラスコに上澄みの1ミリリットルを収集し、ピペットを使用して1.5ミリリットルのタイプの上清を交換します。マイナス80度で15分以内に凍結融解サイクルを行い、続いて摂氏37度の水浴で15分の融解を行います。その後、チューブを摂氏4度で10分間12、600gで遠心分離します。上清を集める。蒸留した0.2ミクロンフィルターで上清をフィルターし、細胞分画を除去します。上清をマイナス80度で保存し、ウイルス力計を測定するためのプラークアッセイに適用します。プラークアッセイを行う準備ができたら、収集した上澄み物を含むチューブを摂氏37度の水浴に入れます。10倍希釈したサンプルの1ミリリットルにトリプシンを加え、37°Cで30分間インキュベートします。この30分間のインキュベーションの間、血清含有培地を取り除いた後、MA104細胞を1X PBSの2ミリリットルで6ウェルプレートで慎重に洗浄します。インキュベートしたサンプルを無血清培地で連続して希釈し、希釈したサンプルを各ウェルに1ミリリットル接種します。プレートを摂氏37度で90分間、不飽和蒸気5%%でインキュベートし、15分ごとにプレートを軽く振ります。インキュベーション後、6ウェルプレートから接種を取り除きます。調製した培地にトリプシン1ミリリットル当たり4マイクログラムを加える。穏やかに、しかしすぐに各井戸にアガロースゲルと混合培地の3ミリリットルを追加します。アガロースゲルを室温で10分以上固めます。その後、37°Cと5%CO2不飽和蒸気で2日間プレートをインキュベートします。次に、1X PBSで希釈した0.015%ニュートラルレッド溶液を1ミリリットルずつ各ウェルに加え、同じ条件でインキュベートします。3時間後に染料を取り出し、1日インキュベートを続けます。翌日、各ウェルのプラーク数を数え、1ミリリットル当たりのpfuを計算します。プラークアッセイの前に細胞合流を注意深くチェックして、プラーク番号を確認します。細胞結合アッセイの場合、ブタ膵臓からトリプシンのマイクロリットル当たり1マイクログラムをウイルス懸濁液の1ミリリットルに加え、次に渦を加える。ウイルス懸濁液を無血清培地で希釈し、MOIを細胞あたり1pfuに調整します。MA104細胞を24ウェルプレートに2回洗浄し、トリスバッファー塩分を1ミリリットルずつ使用します。今、希釈されたウイルス懸濁液の100マイクロリットルで細胞を24ウェルプレートの各ウェルに接種する。15分ごとに穏やかな揺れで90分間、摂氏4度でプレートをインキュベートします。ウイルス接種を除去し、トリス緩衝生理食塩水の1ミリリットルで細胞を2回洗浄する。ロタウイルスの二本鎖RNAを抽出するには、1X PBSの140マイクロリットルと560マイクロリットルのRNA抽出バッファーを各ウェルに加えます。バッファー内の細胞のヘイズが見えないまでピペットと適切に混合します。二本鎖RNAを回収した後、メーカーのプロトコルに従って、二本鎖RNA抽出物を含む1.5ミリリットルのチューブを摂氏95度のヒートブロックに5分間置き、RNAを変性させます。その後、すぐに氷の上にチューブを置き、2分以上インキュベートします。逆転写キットを使用して cDNA を合成します。16マイクロリットルの反応混合物を含むPCRチューブに変性ウイルスRNA溶液を4マイクロリットル加え、気泡を発生させないようにピペットと慎重に混合します。チューブを回転させた後、サーモサイクラーで逆転写を行います。定量PCRの場合、ロタウイルスのNSP3ゲノムセグメントの963〜1,049領域を標的としたクエンチャー挿入プローブを使用してください。標準プラスミドをPCRグレードの水で連続して希釈し、定量PCRのマスターミックスに進みます。96ウェルPCRプレートのウェルにマスターミックスの20マイクロリットルを加えます。次に、5マイクロリットルのcDNAサンプルまたは標準プラスミドの5マイクロリットルを10回ピペット処理して混合します。テキストプロトコルの条件に従って定量PCRを実行します。最後に、テキストプロトコルに記載されているようにMA104細胞表面に結合したロタウイルスゲノムを計算する。ここに示されているのは、ロタウイルスの成長曲線である。修正されたゴンペルツモデルに最小二乗法を適用することにより、特定の成長率は0.197と推定され、ラグ期間は6.61時間と推定されます。初期のtiterに対する静止段階での相対ウイルス・トイターは3.15である。6つのテストされたロタウイルスクローンのうち、特定の成長率の推定値は0.19から0.27の範囲でした。モデルフィッティングの決定値の係数が0.98を超えるため、これらの推定値は信頼できます。細胞結合アッセイの結果は、結合効率として表示され、これは、接種に存在するものに対する結合ウイルス粒子の比率である。細胞表面に結合する私達のRVビリオンは細胞結合の試しのための24ウェル版を使用するとき結合効率のおよそ1%のミリリットルあたりの10,000コピーである。培養細胞は物理的ストレスに敏感であるため、緩衝液と寒天を穏やかに、しかし迅速に注ぐように注意してください。基本的に、ウイルスのための新しいシステムが導入されました。このシステムを用いて、実際の細胞結合能と比成長率を計測器で評価することができます。我々のプロトコルは、形質特性を測定する上で有利である。新たに出現した株の異なるをチェックすることによって、あなたはウイルスのための新しいワクチンを評価するのに役立ちます。ウイルスはBSL-2病原体として指定されているので、この手順を実行するためにBSL-2実験室を準備する必要があります。

assays-for-specific-growth-rate-cell-binding-ability

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

Source: Manocheewa, S., et al. Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses. J. Vis. Exp. (2015)The video demonstrates the procedure for a growth competition assay to measure the relative replication fitness of two viral strains by comparing their replication in human immune cells.

An Assay for Measuring the Relative Replication Fitness of Viral Strains

Source: Philip, A. A., et al. Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the recovery of recombinant rotavirus by transfecting plasmids encoding viral genome segments into hamster kidney cells, followed by amplification in monkey epithelial cells, enabling studies of rotavirus biology, replication, and vaccine development.

Plasmid-Mediated Generation of Recombinant Rotavirus in Cultured Cells

Source: Philip, A. A., et. al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates a plaque assay technique to monitor rotavirus infection in epithelial cells. Trypsin activation enhances viral entry, and staining highlights viable cells, enabling visualization of infection-induced plaques.

Visualizing Trypsin-Activated Rotavirus Infection Using a Plaque Assay

Source: Philip, A. A., et al., Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the isolation of rotavirus double-stranded RNA from clarified cell lysates. It further illustrates the separation and visualization of genome segments through polyacrylamide gel electrophoresis.

Isolation and Visualization of Rotavirus Genome via Gel Electrophoresis

Source: Kadoya, S., Sano, D. Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the use of a plaque assay to assess the rotavirus growth curve. The method involves infecting host cells with diluted virus, overlaying with agarose to restrict spread, and staining to visualize plaques formed by viral replication. By counting plaque-forming units at defined time points, the resulting growth curve reveals the lag, exponential, and...

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レポータータンパク質を発現する組換えロタウイルスを回収する簡略逆遺伝学法

学ぶロタウイルスの比増殖速度と細胞結合能力の測定法。プラークアッセイとRT-qPCRを用いて、MA104細胞を使用したウイルス学的表現型解析とワクチン開発への応用を探索する。

比増殖速度とロタウイルスのセル結合の能力のための試金

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