Name: それらの相互作用を研究する歯髄組織と癌細胞との共培養から間葉系幹細胞の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学ぶ歯髄由来間葉系幹細胞と前立腺がん細胞の共培養法。直接・間接培養技術により細胞相互作用を解析し、がん転移メカニズムの解明と新規治療戦略開発に貢献する。

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本研究は、イェディテペ大学によって支えられました。すべてのデータと数字はこの資料で使用した以前に公開された34。

患者の文書による同意は、機関の倫理委員会から承認後に得られました。
1. DPSC の分離と培養
<ol><li>17 と完全なダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) を含む 20 に 15 mL チューブの間老化させて若い大人から得られる知恵の歯を転送 [低グルコース DMEM 培、10% 牛胎児血清 (FBS) と 1% ペニシリン/ストレプトマイシン地/アムホテリシン (PSA) ソリューション] 切除後 8 時間以内。潜在的な細胞死を避けるために転送中に冷たい組織材料 (4 ° C) をしてください。</li>
	<li>歯の中心から無菌抽出鉗子によって歯髄組織を慎重に削除、10 cm ティッシュの培養皿で冷たい完全 DMEM 培地にパルプのティッシュを置き、メスで小さな断片 (2-3 mm) にそれらをミンチします。 注: すべての実験プロシージャが層流フードの無菌条件下で実施している必要があります。この非酵素的手法は、以前使用していた21,22,23をされています。</li>
	<li>場所、組織培養内部組織の小さな果肉は 6 ウェル プレートを扱われ、それぞれの小さな果肉組織部分をカバーする完全な DMEM メディアの 200 μ L を追加します。</li>
	<li>組織性付着を提供する 2 時間 5% CO2加湿空気の雰囲気 (湿度 80%) で 37 ° C で培養井戸を孵化させなさい。 注: この手順は、メディアの蒸発を制御することにより 3 4 h に延長する可能性があります。</li>
	<li>井戸に完全 DMEM 培地の適切なボリューム (2 〜 2.5 mL) を追加し、37 ° c 5% CO2の細胞のティッシュから広がり加湿空気中でインキュベートします。 注: セル約 4 日後に見えるようになる、8-9 日後の confluency に到達します。</li>
	<li>ときのセルでは、80% の confluency に到達、6 ウェル プレートからメディアを削除およびリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 2 mL で洗い、トリプシンの 2 mL を加えます。加湿空気の雰囲気と 37 ° C でインキュベーターで 2 分と 5% CO2間インキュベートします。トリプシンを阻害する 2 分で完全 DMEM 培地 2 mL を加えます。細胞のペレットに 5 分間、300 x g で細胞を遠心します。</li>
	<li>完全な DMEM メディアとのさらなる実験のための店でフラスコの通路セルです。1 つ T-75 フラスコ 6 ウェル プレートの 2 つの井戸から T-75 フラスコおよび転送細胞に完全な DMEM メディアの 15 mL を追加し、, 加湿空気の雰囲気と 5% CO2の 37 ° C で。</li>
</ol>2. DPSCs のキャラクタリゼーション
<ol><li>形態素解析を実行します。<ol>
<li>種子組織培養細胞 (ステップ 1.6) は、細胞の形態を観察する少なくとも 8 通路の完全 DMEM 培地のフラスコ (または 6 ウェル プレート) をコーティングしました。</li>
		<li>顕微鏡で細胞を可視化し、線維芽細胞のような細胞の形態を定義します。細胞は培養皿に接続し、スピンドルのような細胞の形態がある必要があります。 注: また、細胞が培養する単一セルとしての線維芽細胞と MSCs の特定の特徴であるコロニー形成能力を観察するウェル プレート最大 14 日間。</li>
	</ol>
</li>
	<li>表面マーカー解析を実行します。<ol>
<li>ステップ 1.7 から細胞を trypsinize します。T-75 組織培養用フラスコからメディアを削除、2 mL の PBS、洗って、トリプシンの 2 mL を加えます。加湿空気の雰囲気と 37 ° C でインキュベーターで 2 分と 5% CO2間インキュベートします。トリプシンを阻害する 2 分で完全 DMEM 培地 2 mL を加えます。細胞のペレットに 5 分間、300 x g で細胞を遠心します。</li>
		<li>1.5 mL チューブに室温で 20 分間 4% パラホルムアルデヒドとセルを修復して、500 μ L の PBS 3 回出し入れしてパラホルムアルデヒドで洗ってください。</li>
		<li>100 μ L の PBS の 4 ° C で 1 時間抗体 (cd29)、CD34、CD14、CD45、CD90, CD105、CD166、CD73 と固定セルを孵化させなさい。 注: 使用抗体濃度は 0.5 μ g/mL です。CD73、CD166、CD105 CD90 (cd29) は、MSCs の肯定的な細胞表面マーカーとして利用が、CD34、CD14、CD45 は否定辞として使用されます。</li>
		<li>洗浄 3 回 PBS のセルおよびラベリングかに (FITC)、フィコエ リスリン (PE) などのそれぞれの二次抗体を使用します。1: 500 希釈した二次抗体 4 ° C で 30 分間 100 μ L の PBS のセル、PBS で 3 回洗浄を孵化させなさい。</li>
		<li>フローサイトメトリー解析のため暗闇の中のサンプルを保持し、正と負のフローサイトメトリーによる汚損を検出します。 注: は、前方および側面の散布を手配するのに無染色制御の細胞を使用します。死んだ細胞、破片、および非染め色の人口を除外することによって集団をステンド グラスの積極的にゲートを配置します。45 psi シース圧 100 μ m ノズルを使用し、チャンネルを配置することによって肯定的な DPSCs を決定する 10,000 のイベントを収集します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>DPSCs の分化を実行します。<ol>
<li>24 ウェル プレートに種子 1 × 104セルは DMEM メディアを完了し、5% CO2加湿空気の 37 ° C で 24 時間インキュベートします。</li>
		<li>分化を定式化を使用してメディア対抗基本メディアとして DMEM 培地。100 nM デキサメタゾン、10 mM の β-グリセロリン酸 0.2 mM アスコルビン酸を混合することによって骨のメディアを準備します。1 × インスリン-トランスフェリン-セレン (ITS G)、100 nM デキサメタゾン、100 ng/mL トランスフォーミング成長因子 β (TGF-β)、14 μ g/mL アスコルビン酸、1 mg/mL ウシ血清アルブミン (BSA) を混合することによって軟骨メディアを準備します。60 μ M インドメタシン 0.5 mM 3-イソブチル-1-メチルキサンチン (IBMX)、5 μ g/mL インスリン 100 nM デキサメタゾンを混合することによって脂肪細胞のメディアを準備します。 注: 分化メディアは 4 ° C で少なくとも 1 週間保存できます。</li>
		<li>1 週間 2 回 2 週間骨、軟骨化生、または総アディポネクチン遺伝子分化メディアに成長の媒体および更新メディアを変更します。</li>
		<li>コッサによる分化を確認し、21が前述アルシアン青染色、酵素活性 (アルカリフォスファターゼ)、免疫細胞化学、およびプロトコルによると量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) 解析します。<ol>
<li>コッサを実行し、室温で 10 分間で 4% パラホルムアルデヒドで固定セルにアルシアン ブルー染色 PBS の固定セルを洗浄し、カルシウム沈着を観察するメーカーの推奨事項に従って vonKossa キットと、それらを染色.</li>
			<li>アルシアン青染色し、さらに染色の 3% (v/v) 酢酸 100 ml アルシアン ブルー色素の 1.00 g 溶解液を準備します。PBS の固定セルを洗浄し、アルシアン ブルー溶液で 30 分のための細胞を染色します。光顕微鏡による染色サンプルを視覚化します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 条件媒体 (CM) の準備
<ol><li>CM コレクション前に新鮮な完全な DMEM 24 h 1.7 のステップからの細胞のメディアを交換してください。 注: 2-4 の通路をお勧めします。</li>
	<li>電池が 80% の confluency に達するとき培養 DPSCs から条件培地 (CM) を収集します。収集したメディア廃棄物組織の材料と細胞の破片を削除する 5 分間 300 × g で遠心分離機します。 注: また、がれき撤去作業中に 0.2 μ m シリンジ フィルターを使用します。</li>
	<li>上清を収集し、さらに実験のための-20 ° C で保存します。 注: は、長期保存のための-80 ° C で上澄みを保持します。</li>
</ol>4 cm の癌細胞の治療
<ol><li>細胞生存率解析を実行します。<ol>
<li>シード PC 3 細胞 (ひと前立腺癌細胞) 5 × 103細胞/ウェルでの細胞密度の 96 ウェル プレートに DMEM を完了し、24 h の CO2を 37 ° C および 5% の加湿チャンバーで孵化させなさい。</li>
		<li>10、20、30、40、および 50% (v/v) CM の 24 h の完全な DMEM に混合セルを扱います。</li>
		<li>3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxy-phenyl)-2-(4-sulfo-phenyl)-2H-tetrazolium による細胞生存率を (MTS) を測定-24を前述のように測定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>遊離トランスフェラーゼ dUTP 端標識 (TUNEL) 解析を実行します。<ol>
<li>6 ウェルの細胞培養プレート 2 × 105の細胞密度で細胞/ウェルと 37 ° C および 5% CO2で加湿チャンバーで一晩インキュベートにシード PC 3 セル。</li>
		<li>ミックス 20% (v/v) CM DMEM 培地を完了し、24 h のセルに適用。</li>
		<li>Trypsinize 細胞と TUNEL 反応混合物 (ソリューション + 酵素液、キットに付属のラベル) の 50 μ l を中断し、加湿と 5% CO2雰囲気の中で 60 分の 37 ° C で孵化させなさい。 注: trypsinization、6 も細胞培養皿からメディアを削除、1 mL の PBS で洗浄し、追加トリプシンを 500 μ l 添加します。加湿空気の雰囲気と 37 ° C でインキュベーターで 2 分と 5% CO2間インキュベートします。トリプシンを阻害する 2 分で完全 DMEM 培地 1 mL を追加します。細胞のペレットに 5 分間、300 x g で細胞を遠心します。</li>
		<li>PBS で洗いし、フローサイトメトリーを使用して PBS のセルを分析します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>QPCR 分析を行います。<ol>
<li>6 ウェルの細胞培養プレート 2 × 105の細胞密度の細胞/ウェルと 37 ° C および 5% CO2で加湿のインキュベーターで一晩インキュベートにシード PC 3 セル。</li>
		<li>ミックス 20% (v/v) CM DMEM 培地を完了し、24 h のセルに適用。</li>
		<li>Trypsinize 細胞 RNA の cDNA の分離と合成細胞ペレットを収集しています。 注: 6 も細胞培養皿からメディアを削除、1 mL の PBS で洗浄、トリプシンの 500 μ L を追加します。加湿空気の雰囲気と 37 ° C でインキュベーターで 2 分と 5% CO2を孵化させなさい。トリプシンを阻害する 2 分で完全 DMEM 培地 1 mL を追加します。細胞のペレットに 5 分間、300 x g で細胞を遠心します。</li>
		<li>前述のプロトコル25によると qPCR 実験を実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>癌細胞の細胞移行を実行します。<ol>
<li>種子 1 × 105 PC 3 12 ウェル プレートの上に細胞し、37 ° C、5% CO2で一晩加湿のインキュベーターで孵化させなさい。</li>
		<li>滅菌 200 μ L チップと細胞を傷つけるし、CM の様々 な濃度を含む新鮮な培地ですぐに媒体を変更 [例えば10、20、30、40、および 50 %cm (v/v) 完全な DMEM に混合の]。</li>
		<li>倒立顕微鏡下の傷を観察し、さまざまな時間間隔 (0 から 24 h) で写真を撮る。</li>
		<li>メジャー式を使用してイメージ J ソフトを用いたスクラッチの閉鎖: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58825/58825eq1.jpg"> 注: は、画像 J ソフトウェアとスクラッチのイメージを開きます。既にイメージに存在するスケール バーと同じ大きさのある線を描きます。クリックして分析し、縮尺を設定し、描画した線の倍率とのピクセル単位の距離を観察。既知の距離の部分にスケール バーのサイズを書いて、単位(ピクセル、cm 等)の手配、[ok] をクリックします。再度分析セクションに移動し、[測定] をクリックします。これは最初選択した単位としてスケール バーのサイズを与えます。最初の 1 つの端をクリックし、スクラッチのもう一方の端に到達するまでドラッグします。(0 h と 24 h) 各時点の値に注意してください。上記の式にこれらの値を接続し、傷の閉鎖を計算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5 がん細胞と DPSCs の間接的な接触でセル移行
<ol><li>シード 3 × 104 DPSCs 0.4 μ m で 24 ウェル プレート挿入に毛穴し、37 ° C で一晩加湿のインキュベーターで孵化させなさい</li>
	<li>24 ウェルにシード PC 3 セルは 5 × 104の細胞密度でプレートし、37 ° C、5% CO2で一晩加湿のインキュベーターで孵化させなさい。</li>
	<li>スクラッチ滅菌 200 μ L チップと PC 3 セル、新鮮な媒体、媒体を変更し、PC 3 細胞に DPSCs を運ぶ挿入を配置します。</li>
	<li>倒立顕微鏡下で細胞を観察し、細胞の移動を分析するさまざまな時間間隔 (0 から 24 h) で写真を撮る。</li>
</ol>6. 共培養の試金とフローサイトメトリー解析の流れ
<ol><li>Pc-3 細胞および DPSCs PKH67 (緑) と PKH26 (赤) 蛍光細胞リンカー染料は、それぞれ26を使用してラベルを付けます。</li>
	<li>それぞれ PC 3 および DPSCs 細胞を trypsinize します。T-75 組織培養用フラスコからメディアを削除、2 mL の PBS、洗って、トリプシンの 2 mL を加えます。加湿空気の雰囲気と 37 ° C でインキュベーターで 2 分と 5% CO2間インキュベートします。トリプシンを阻害する 2 分で完全 DMEM 培地 2 mL を追加します。</li>
	<li>5 分 300 x g で細胞を遠心、上清を破棄、キットによって提供される希釈剤 C バッファーで作製した色素溶液中の細胞ペレットを再懸濁します (材料の表を参照してください)。</li>
	<li>10 分間色素溶液中の細胞をインキュベートし、FBS の 100 μ L を追加することによって染色反応を終了します。5 分間 300 x g で細胞を遠心分離機、上澄みを廃棄し、完全培地で細胞を共培養する前に洗います。</li>
	<li>標識細胞プレート (5 × 104/ウェル) 1:1 の比率 (DPSCs: PC3) で 6 ウェル プレートの上に。完全な DMEM で共培養細胞を維持します。</li>
	<li>24 時間または 48 時間の潜伏期間の後 5 分、PBS で洗浄のための 300 x g で細胞の遠心分離によって細胞を収集します。</li>
	<li>300 μ L に 5 mL の丸底流れの cytometry チューブ (FACS) バッファーの並べ替え蛍光活性化細胞の細胞を再懸濁します。サンプル分析の前に、細胞凝集塊を分散する渦。</li>
	<li>45 psi シース圧 100 μ m ノズルを使用します。 注: 非常に高い流動度蛍光検出の感度が低下可能性があります。</li>
	<li>適切な前方参照とセル型の補償、27を前述の側散布レーザー電圧を調整するのに制御無染色の細胞と単一の着色されたセルを使用します。 注: は、細胞の残骸、死んだ細胞、または集計除外するのに生きているセルのゲートを使用します。</li>
	<li>フロリダ-1 (緑)、フロリダ州-2 (レッド) チャンネルを配置してパーセント肯定的な緑の DPSCs と赤い PC 3 セルを決定する (100,000 が望ましい) 10,000 のイベントを収集します。</li>
</ol>

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著者が明らかに何もありません。

MSCs の腫瘍環境への貢献は、ハイブリッド細胞世代を介して細胞融合、幹細胞と癌細胞28entosis またはサイトカインおよびケモカインの活動を含むいくつかの相互作用によって調整されます。構造、細胞間相互作用と分泌因子腫瘍促進、進行、および周囲の組織への転移癌細胞の動作を決定します。居住者の細胞集団の相互作用の背後にあるメカニズムを調査するモデル システム適切な前のヴィヴォは癌の進行および転移のための携帯電話の通信を理解する必要があります。
前立腺癌と歯の幹細胞の相互作用のためのモデル システムを作成するのに DPSCs を使用します。成体幹細胞のこのタイプの利点は、ソース組織とを簡単に分離手順のアクセシビリティです。このプロトコルの制限が、他の一方で、よく知られている成体幹細胞の種類比較なし DPSCs のみを使用してです。現在の共培養方法、パラクリン シグナルの可溶性分泌分子と同じ環境29,<sup class="xref"...

分化と骨、軟骨、筋肉、靭帯、腱、脂肪などの間葉系組織の再生への貢献の能力を持つ幹細胞 (MSCs) は成人の体の1のほとんどすべての組織から分離されています。,2。 以外の慢性的な炎症やけがの場合細胞を生産することによって組織の恒常性を提供し、彼らは重要なサイトカインや血管新生、免疫システムと改造3組織を統制する成長因子を生成します。MSCs がん組織との相互作用がよく理解ではないが、蓄積された証拠は、MSCs が腫瘍発生・進行・転移4を促進するかもしれない示唆しています。
怪我や慢性的な炎症を起こしている領域に MSCs のホーミング能力は貴重な幹細胞ベースの治療対象となります。ただし、「決して傷を癒し」がん組織はまた炎症性サイトカイン、プロ血管新生の分子、cancerogenous エリア5に MSCs を引き付ける重要なの成長因子を解放します。限定があります7癌の進行および転移の促進作用が広くされている癌の成長6,の MSCs の抑制効果を示すレポート8を報告しました。MSCs 直接的または間接的に影響を与える癌免疫細胞、癌細胞の増殖と血管新生促進活性を促進させると規制の移行をサポートする成長因子・ サイトカインの分泌を抑制するなどさまざまな方法で上皮間葉転換 (EMT)9,10。癌関連付けられている線維芽細胞 (CAFs) や芽、血管内皮細胞、脂肪細胞、免疫細胞11を含むいくつかの細胞型腫瘍環境が構成されます。これらのうち、CAFs は癌の増殖と転移8を促進各種ケモカインを分泌する腫瘍領域で最も豊富なセル型です。MSCs の骨髄由来腫瘍間質12CAFs で分化ができることが示されています。
Gronthosらによって最初の歯科組織由来 Msc として特徴付けられる歯髄幹細胞 (DPSCs)13 2000 年に広く用いて他14,15、 Oct4 Sox2, Nanogの16のような多能性マーカーを表現し、様々 な細胞 linages17に区別することができます。遺伝子やタンパク質の発現解析 DPSCs が血管内皮増殖因子 (VEGF)、アンジオジェニン、線維芽細胞成長因子 2 (FGF2)、インターロイキン 4 (IL-4) など他の MSCs を使用した成長因子・ サイトカインの対等なレベルを生成することを証明した IL 6, IL-10fms のようなチロシン キナーゼ 3 リガンド (フェルマーの最終定理-3 L) が血管新生を促進するため、免疫細胞を調節するサポートをがんと同様に、幹細胞因子 (SCF)、細胞増殖と移行18,19,20.MSCs がん環境との相互作用は、文献でよくとり上げられるされている、DPSCs と癌細胞の関係はまだ評価されていません。本研究は, 歯科 MSCs がんの進展と転移のメカニズムの潜在的なアクションを提案する DPSCs、PC-3、転移性の高い前立腺癌細胞株の培養と条件の中治療戦略を設立しました。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11885084</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>PSA</td><td>ロンザ</td><td>17-745E</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>用 トリプシン</td><td>Invitrogen</td><td>25200056</td><td>細胞解離用</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>10010023</td><td>洗浄用</td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>シグマ</td><td>D4902</td>分<td>化培地</td></tr><tr><td>の成分&β;-グリセロリン酸</td><td>Σ</td><td>G9422</td>骨<td>分化培地の成分</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマ</td><td>A4544</td><td>骨および軟骨分化培地の成分</td></tr><tr><td>インスリン-トランスフェリン-セレン(ITS&マイナス;G)</td><td>Invitrogen</td><td>41400045</td><td>軟骨分化培地</td></tr><tr><td>TGF-&βの成分;</td><td>シグマ</td><td>SRP3171</td><td>軟骨分化培地の成分</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>シグマ</td><td>I6634</td><td>脂肪分化培地</td></tr>イ<tr><td>ソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)</td>の成分 <td>シグマ</td><td>I7018</td><td>脂肪分化培地の成分</td></tr><tr><td>インドメタシン</td><td>ΣI7378</td><td></td><td>脂肪分化培地MTS試薬の成分</td></tr><tr><td></td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>細胞生存率解析</td></tr><tr><td>TUNEL Assay</td><td>Sigma</td><td>11684795910</td><td>アポトーシス解析</td></tr><tr><td>24ウェルプレートインサート</td><td>Corning</td><td>3396</td><td>トランスウェルマイグレーションアッセイ用</td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma</td><td>PKH67GL</td><td>共培養細胞染色用</td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL</td><td>共培養細胞染色用</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Σ</td><td>P6148</td><td>細胞固定</td></tr><tr><td>用 von Kossa Kit</td><td>BioOptica</td><td>04-170801.A</td><td>細胞染色(分化)用</td></tr><tr><td>アルシアンブルー</td><td>Sigma</td><td>A2899</td><td>細胞染色(分化)用</td></tr></tbody></table>

それらの相互作用を研究する歯髄組織と癌細胞との共培養から間葉系幹細胞の分離

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

マルチ ステップ プロセスおよび複雑な病気としてのがんだけでなく個々 の細胞の増殖と成長によって規制がまた腫瘍環境と細胞間相互作用によって制御します。癌の幹細胞の相互作用、分泌因子、物理的相互作用、細胞外の環境の変化などの識別可能性があります新しい治療オプションの検出を有効にします。間葉系幹細胞 (MSCs) と癌のモデル系の細胞の相互作用を作成する知られている培養技術を組み合わせています。現在の研究では、直接および間接共培養法による歯髄幹細胞 (DPSCs) および PC 3 前立腺癌細胞の相互作用を調べた。条件培地 (CM) DPSCs から、傍分泌活動を研究する 0.4 μ m 孔サイズのトランスも膜が用いられます。一緒に異なる種類の細胞の共培養直接細胞間相互作用を検討しました。結果では、CM が細胞増殖を増加し、前立腺癌培養細胞のアポトーシスを減少したことを明らかにしました。CM とトランス ウェル システム PC 3 細胞の細胞遊走能を増加しました。同じ培養容器に細胞膜の染料で染色を播種、この直接培養条件下で PC 3 細胞の自己組織化構造の DPSCs が参加しました。全体的にみて、共培養技術でしたモデル システムとして癌と MSC の相互作用のために有用であることが示唆されました。

図 1は、培養条件下で DPSCs の一般的な MSC の特徴を示しています。DPSCs は、(図 1 b) めっき後線維芽細胞のような細胞の形態を発揮します。MSC 表面抗原 ((cd29)、CD73、CD90, CD105、および CD166)、造血のマーカー (CD34、CD45、CD14) 中高発現は負 (図 1)。形態学的および分子レベルで変化と骨 - 関係軟骨化生と裏打ち遺伝子分化分化カクテル アプリケーション(図 1)に続いて DPSCs 文化で観察されます。
前立腺癌細胞の増殖と移動に DPSCs から分泌された分子の活動を決定するには、歯科幹細胞培養から収集され、癌...

歯髄由来間葉系幹細胞と共培養の直接的および間接的なメソッドに基づく前立腺癌細胞の相互作用の評価のためのプロトコルを提供します。条件中、トランスも膜間接傍分泌活動を分析に適しています。差動シードは直接細胞相互作用の適切なモデルを一緒に細胞を染色します。

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

この方法は、がん細胞の行動調節における成体幹細胞の役割に関する幹細胞分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、生物を使用せずにインビトロで癌細胞および幹細胞相互作用の評価を可能にすることです。この技術は、骨などの硬い組織に対する癌転移における成体幹細胞の促進役割をモデル化する癌転移の可能性を有する。手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士研究員であるフセイン・アプディクによって行われます。まず、17歳から20歳までの若年成人から得られた親知らずの中心からパルプ組織を除去するために、無菌抽出鉗子を使用することから始めます。10センチメートルの組織培養皿の冷たい完全なDMEMにティッシュを置き、2〜3ミリメートルの断片にサンプルをミンチするためにメスを使用する。各皿から6ウェルプレートを処理した組織培養の個々の井戸に切り替え、完全なDMEMの200マイクロリットルで各井戸の組織をカバーします。組織が加湿、摂氏37度および5%CO2細胞培養インキュベーターで少なくとも2時間のインキュベーションでウェルボトムに付着することを許可する。インキュベーションの終わりに、2〜2.5ミリリットルの新鮮な完全な培地で組織を供給し、さらに8〜9日間細胞を培養する。培養物が80%の合流度に達したら、PBSの2ミリリットルで各井戸を洗い、続いて37°Cでトリプシンを2ミリリットルで細胞を剥離する。2分後、ウェルあたり完全なDMEMの2ミリリットルで反応を停止し、遠心分離によって細胞を収集します。次いで、細胞の2つのウェルごとに15ミリリットルの新鮮な完全な培地でペレットを再懸濁し、その後の培養のためにT75フラスコに細胞を通過させる。少なくとも8回の経過の後、光顕微鏡で細胞を可視化する。歯髄幹細胞は培養皿に付着し、紡錘様細胞形態を示すべきである。表面マーカー解析では、トリプシン法が実証された後、1.5ミリリットルチューブの室温で20分間4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定し、洗浄ごとに500マイクロリットルのPBSで3回洗浄します。最後の洗浄後、細胞に適切な抗体をチューブあたり100マイクロリットルのPBSに、摂氏4度で1時間ラベルを付けます。インキュベーションの終わりに、示されているようにPBSで細胞を3回洗浄し、1チューブ当たり100マイクロリットルのPBSで適切な二次抗体で細胞に4°Cで30分間ラベルを付けます。次いで、PBSでサンプルを3回洗浄し、標準的なプロトコルに従ってフローサイトメトリーによって細胞を分析します。歯髄幹細胞の分化のために、細胞培養インキュベーター中の24時間インキュベートのために完全なDMEMの500マイクロリットルの24ウェルプレートの個々のウェルに4つの細胞に10回10回播種する。翌日、各ウェルの培地を適切な分化培地に交換し

mesenchymal-stem-cell-isolation-from-pulp-tissue-co-culture-with

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

のいずれかを使用して人間の歯髄幹細胞（hDPSCs）の単離および特性を説明する方法...

単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

このビデオでは、トランズウェルフィルターを使用して三叉神経細胞と初代歯髄細胞の共培養を確立する技術を紹介しています。この物理的に分離された状態では、歯髄組織から得られた間葉系細胞がパラクリンシグナル伝達分子を分泌し、孔内を横断してニューロンの分化と間葉系への移動を促進し、共培養システムを確立します。...

歯髄細胞と三叉神経細胞の共培養を確立し、クロスコミュニケーションを実現

この記事では、初代培養細胞に新たに取得したメラノーマ組織の調製を記述する方法、および腫瘍細胞から赤血球および線維芽細胞の汚染物を除去する。最後に、我々はどのように説明したCD133...

CD133の患者由来の細胞培養および分離<sup&gt; +</supメラノーマから&gt;推定されるがん幹細胞

間葉系幹細胞(MSC)は、可溶性因子や特定の生体材料で刺激されると、骨芽細胞系譜への分化の可能性を持っています。この研究は、ウシ骨基質ヌクボン(NKB)を足場として採用したヒト羊膜(AM-hMSC)からのMSC送達のための新しいオプションを提示します。...

ヒト間葉系幹細胞の単離および多孔質骨基質上での栽培

ヒト間葉系幹細胞（MSC）の免疫調節特性は、臨床応用のため、ますます関連現れます。蛍光色素カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）で前染色MSCおよび末梢血白血球の共培養系を用いて、我々は、エフェクター白血球の増殖および特定の亜集団におけるMSCの免疫調節のインビトロ評価を記載します。...

ヒト間葉系幹細胞（MSC）の免疫調節特性の評価

人間の心臓組織は、心筋再生のために適切であり得る多能血管周囲の前駆細胞集団を保有します。ここに記載された技術は、ネイティブの血管に関連する2つの多能ストローマ細胞集団の同時単離および精製を可能にする、すなわち CD146 + CD34 -周皮細胞およびCD34 + CD146 -外膜細胞、ヒト心筋から。...

ヒト心臓組織からの血管周囲多能前駆細胞集団の単離

ここでプリオン蛋白発現神経細胞の分化過程を評価するために人間の歯髄幹細胞の分離と伝搬するためのプロトコルを提案する.

分離、伝達、およびプリオン蛋白質発現ひと歯髄幹細胞の神経分化

我々は、トランスウェルフィルター上に培養された三叉(TG)ニューロンを用いた歯科パルプ(DP)一次細胞の分離、分散およびめっきについて述べた。DP細胞の細胞応答は、免疫蛍光またはRNA/タンパク質分析で分析することができる。共焦点顕微鏡を用いた神経細胞マーカーの免疫蛍光は、神経突起の成長応答の解析を可能にする。...

歯髄パラクリン信号に反応した神経突起の成長を研究する共培養法

この記事では、外植片培養法を使用した歯髄幹細胞の初代培養を確立するための段階的なガイドと、ICSCRTガイドラインに基づくこれらの細胞の特性評価について説明します。このプロトコルによって単離された細胞は、さらなるアプリケーションのための間葉系幹細胞と見なすことができます。...

歯髄幹細胞の初代培養

このプロトコルは、酵素消化による歯髄からの多能性幹細胞の抽出、培養、および保存に重点を置いています。さらに、骨芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞に分化する可能性を示しており、プロセスの精度と一貫性の重要性を強調しています。...

ヒト落葉歯および永久歯からの歯髄幹細胞の単離、培養、および特性評価

学ぶ歯髄由来間葉系幹細胞と前立腺がん細胞の共培養法。直接・間接培養技術により細胞相互作用を解析し、がん転移メカニズムの解明と新規治療戦略開発に貢献する。

それらの相互作用を研究する歯髄組織と癌細胞との共培養から間葉系幹細胞の分離

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