Name: てんかんのゼブラフィッシュモデルにおける行動と生理学的解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 s
Description: 学ぶ DEPDC5遺伝子ノックダウンによるゼブラフィッシュてんかんモデルの行動・生理学的解析手法。Danio rerioを用いた発達段階での発作様活動評価と神経活動計測により、遺伝性てんかんの病態メカニズム解明に貢献する。

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神経生理学実験を行ったICM電気生理学プラットフォームのスタッフに感謝申し上げられる。また、アンカ・マリアンの技術的な助けに感謝します。SC はトランポリングラント #21488 によってサポートされました。EKはAFMグラント#18469とERC統合グラント(ALS-ネットワーク)によってサポートされました。HCは、フォンダシオンの博士号賞によって支えられ、ラ・レシェルシュ・メディカル(PLP20141031462)とARSLAを注ぎます。ADとRMの場合、この研究はルーマニア国家科学研究イノベーション局(CNCS-UEFISCDI)(プロジェクト番号PN-III-P4-ID-PCE-2016-0010)からの3つの助成金によって支えられました。 PN-III-P2-2.1-PED-2016-0007およびCOFUND-NEURON-NMDAR-PSY、欧州連合のホライゾン2020研究・イノベーションプログラムによる助成金 - 助成金契約番号668863-SyBil-AA、および国立科学財団は、米国政府が資金を提供するNSF-IOS-1656830を付与しました。

実験手順は、国家および制度倫理委員会によって承認されました。
ゼブラフィッシュ胚における DEPDC5 遺伝子の一過性ノックダウン
<ol><li>ツールの準備:
	<ol>
<li>シリコンエラストマーコーティング注入ペトリ皿を準備する:10:1の比率でキットのベースと硬化剤( 材料表を参照)を混合します。混合物で中途半端に35ミリメートルペトリ皿を充填します。使用する前にシリコンが固まるのを待ちます(これには数日かかることがあります)。</li>
		<li>アンチセンスモルフォリノオリゴヌクレオチドの1.2 mmol/Lストック溶液を準備する(AMO; 材料表を参照)。300 nモル凍結乾燥AMOに250μLの無菌水を加え、1.2 mmol/Lストック溶液を得ます。完全溶解のために、バイアルを65°Cで5分間加熱します。 渦は簡単に。チューブキャップをプラスチックフィルムで密封します( 材料表を参照)。</li>
		<li>制御救助実験のために、PCS2骨格または類似のゼブラフィッシュ適合発現プラスミドにクローン化 されたDEPDC5 のヒトcDNA( 材料表を参照)を含む発現プラスミドを調製する。陰性対照として、早期停止コドンを引き起こす突然変異(p.Arg487*)がcDNAに導入された。</li>
		<li>胚水を準備する:逆浸透水+0.5mg/ Lメチレンブルーで0.06 g/L水槽塩( 材料表を参照)。</li>
		<li>注射の日は、プーラーを使用してマイクロインジェクションホウケイ酸ガラス針を準備します( 材料表を参照)。ニードルプーラーの適切な温度設定を確立します。長さ10cm、1/0.5 OD/ID mmホウケイ酸ガラス毛細血管を使用して、約1cmの長さの細い先端を持つ2〜5cmの毛細血管を生成します。</li>
		<li>針の先端が非常に細かければ、溶液の放出を防ぎ、顕微鏡下で鉗子を使って先細り先端の端を壊す。</li>
		<li>注射の直前に、AMOの作業ソリューションを準備してください。常に結果の再現性を確保するために、新鮮な溶液を準備します。AMOストックバイアルを65°Cで5分間加熱します。高速グリーン染料(0.02%最終濃度、 材料表を参照)とAMOを水の作業濃度で希釈した5μLの注入サンプルを調製します。</li>
		<li>用量応答曲線を用いて、各遺伝子についてAMOの働き濃度を経験的に決定する。この働き濃度は、AMOが、総形態異常などの一般的な毒性を引き起こすことなく遺伝子をノックダウンするのに有効な濃度を表します。典型的には、AMOの働き濃度は0.2ミリモル/L〜1 mmol/Lの範囲である(0.4 mmol/Lはこの研究のための有効濃度として決定された18)。コントロールミスマッチモルフォリーノを有効なAMOと同じ濃度で注入します。</li>
		<li>チューブと遠心分離機を短く渦巻きし、液滴をチューブの底に持ち込みます。</li>
		<li>救助実験のために、AMOを働く濃度で希釈し、水で希釈したプラスミドを水中で希釈して5μLの注入サンプルを調製し、最終的な濃度まで決定して、経験的に決定します。 DEPDC5 および陰性対照プラスミドの発現に対して、100ng/μLは表現型救助に有効であった。</li>
	</ol></li>
	<li>胚の準備:
	<ol>
<li>マイクロインジェクションの前日、ゼブラフィッシュの交配タンクを設置する。注射の朝、産卵を可能にするために仕切り剤を取り外す。細かいふるいを使用して胚水で満たされた100ミリメートルペトリ皿に卵を収集します。卵が1つの細胞段階にある間、コレクションから20〜30分以内に注入します。</li>
		<li>プラスチック製のパスツールピペットで60-80個の卵を選び、シリコンコーティングされたペトリ皿に入れて注入します。シリコン表面は、注射中に卵が滑るのを防ぎます。胚の水のほとんどを取り除き、卵を半分に覆うのに十分なままにします。</li>
	</ol></li>
	<li>マイクロインジェクション:<ol>
<li>ガラスの針に注射液を充填します。注射液を含むチューブの1つに針を縦に置き、針の下端が溶液に触れていることを確認します。毛細血管によって着色された注射液が上昇し、針の先端に見えるまで数分間待ちます.</li>
		<li>マイクロインジェクタの注入ハンドルに充填された針を取り付けます( 材料表を参照)。</li>
		<li>空気圧縮機をオンにし、圧力設定を調整して、射出量が〜2nLに設定されます。</li>
		<li>注入された溶液の容積を計算するには、ミクロトームスライドに鉱物油を一滴置きます。設定された圧力と時間パラメータを使用して、染料含有溶液を注入します。注入された流体球の直径を測定し、式Volume=4/3*π*(d/2)3(注入されたボーラスの測定直径)を使用して総体積を計算します。</li>
		<li>4倍の倍率で解剖双眼鏡顕微鏡を使用して、絨毛と黄身を通して単一細胞の段階で卵を注入し、細胞内に直接溶液を射出する。</li>
		<li>注入した胚を胚水で100mmのペトリ皿に集め、皿にラベルを付け、28°Cでインキュベートします。</li>
		<li>胚の発生速度が熱感受性であるため、インキュベーター温度が時間の経過とともに安定していることを確認します。例えば、成長は高い温度で加速され、発達段階は表現型24を適切に評価するために重要である。</li>
		<li>注射後6-8時間の卵の品質を確認し、プラスチック製のパスツールピペットを使用して死んだ胚と未受精卵を取り除きます。</li>
		<li>翌朝、プラスチック製のパスツールピペットで各料理の死んだ胚を数えて取り除きます。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 行動分析
<ol><li>28 hpfでのグローバル活動分析:
	<ol>
<li>マイクロインジェクションの翌日の午後(28 hpf)で試験を実施し、胚発生が非常に迅速であるために有効な統計解析を行う実験で、試験が実施される時刻が一貫していることを確認する。</li>
		<li>35mm皿(テスト皿)に胚水を入れ、試験開始前にインキュベーター(28°C)で少なくとも15分間温めます。</li>
		<li>テスト皿の底にプラスチックメッシュグリッド(1.2x1.2 mm)をサイズにカットします。</li>
		<li>別の実験者に胚の検査順序をランダム化させ、検査する条件の名前を隠してもらいます。</li>
		<li>死亡率が条件間で変化しないことを確認し、表現型の特異性を確保するために非注入胚と比較してください。すべての条件における死んだ胚の割合は10-13%18を超えてはならない。</li>
		<li>プラスチック製のパスツールピペットを使用して、プラスチックメッシュ上に10〜12胚をまだコリオンの中に置きます。テスト皿に十分な胚水を入れ、胚を水没させ続けるが浮遊しないようにする。必要に応じて、プラスチックチップを使用して胚をグリッド上に配置します。</li>
		<li>解剖顕微鏡に取り付けられたビデオカメラ( 材料表を参照)を使用して、定義された長さの時間に自発的な巻き取り活動を記録します(通常、定量化のための活動バーストの代表的なサンプルを取得するのに十分です)。</li>
		<li>胚をそれぞれの皿に戻し、インキュベーターに戻します。各条件に必要な数の胚で実験を繰り返します(90%のパワー分析で決定されます)。</li>
		<li>全自発運動を解析するには、ZebraLabシステムを使用します( 材料表を参照)。アクティビティ定量モジュールを使用して、録画されたビデオをアップロードし、必要に応じて各胚の周りの追跡アリーナを設計します。フリーズとバーストのしきい値をそれぞれ 10 と 50 に設定します。</li>
		<li>自動ビデオ分析を実行して、定義された各アリーナ内の総アクティビティを定量化し、データセットをスプレッドシートとしてリカバリし、データ分析ソフトウェアを使用して分析を実行します。</li>
	</ol></li>
	<li>タッチ呼び起こされるエスケープ応答 (TEER) で 48 hpf:
	<ol>
<li>注射の2日後の午前中に試験を実施する(受精後48時間)。</li>
		<li>試験の少なくとも2時間前に、微細な鉗子を用いて胚をデコール化する。デコールリオネーションと行動検定の時刻が実験で一貫していることを確認します。</li>
		<li>130mm皿(テスト皿)に胚水を入れ、試験開始前に15分間インキュベーター(28°C)で温めます。</li>
		<li>死んだ、形態的に変形した幼虫を数え、取り除く。各条件の番号を記録します。</li>
		<li>別の実験者に順序をランダム化させ、テストする条件の名前を体系化してもらいます。</li>
		<li>テスト皿の上にカメラを取り付け( 材料表を参照)、テスト皿全体が視野内であることを確認します。視野内に定規を配置すると、距離に対する内部キャリブレーションが行われます。</li>
		<li>プラスチック製のパスツールピペットを使用して、テスト皿の中央に胚を入れ、30 fpsの取得率を使用して記録を開始します。</li>
		<li>細かいプラスチックチップで、フリックモーションで胚の尾部をわずかに触れます。</li>
		<li>幼虫が動きを止めた時に記録を停止します。</li>
		<li>試験皿から胚を取り出し、胚水で満たされた新しい皿に入れます。各条件に必要な数の胚でテストを繰り返します(90%のパワー分析で決定されます)。</li>
		<li>胚を元の皿に戻し、インキュベーターに戻します。</li>
		<li>水泳動作のパラメータを解析するには、記録したビデオを ImageJ 解析ソフトウェアにロードします。ImageJ のマニュアル追跡プラグインをダウンロードしてインストールします ( 資料一覧を参照)。[ツール] |を選択してプラグインを起動します 。プラグイン|メニューの手動追跡 。</li>
		<li>ダイアログ ウィンドウで、イメージの目盛り付けされた尺度を紹介します。カメラフィールドに定規を含めると、cm からピクセルへの変換が容易になります。</li>
		<li>トラック を追加 を選択し、最初のフレームでゼブラフィッシュの幼虫の画像をクリックして軌道トレースを開始します。フレームは、トレースに追加される各ポイントに合って自動的に進みます。</li>
		<li>水泳のエピソードの終わりまで動きをトレースしていきます。</li>
		<li>トラッキングウィンドウで [トラックを終了] を選択し、X-Y座標を取得し、合計距離、速度、回転角度を計算します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 電気生理学的解析
<ol><li>試薬および工具の準備:
	<ol>
<li>胚水に1%アガロースを準備する(セクション1.1.4を参照)。マイクロ遠心分離管内の液体アガロースをアリコートし、アガロースが硬化するのを防ぐために42°Cの加熱ブロックに保管する。</li>
		<li>記録溶液(mmol/L)を準備する:NaCl 134、KCl 2.9、CaCl2 2.1、MgCl2 1.2、グルコース10、HEPES 10、pH 7.8。</li>
		<li>1.5-2 μmの先端開口でホウケイ酸ガラスマイクロピペットを引っ張る(5-6 Mm 2·kg·s−3 ·A−2抵抗)磨かれていない。</li>
	</ol></li>
	<li>電気生理学のためのゼブラフィッシュ幼虫の調製:
	<ol>
<li>魚をガラス底のペトリ皿に入れ( 材料表を参照)、余分な細胞外媒体を取り除き、魚がカバースリップにできるだけ近づけられるようにします。</li>
		<li>プラスチック製のパスツールピペットを使用して、幼虫の上と周りに暖かい液体アガロースを追加します。魚をカバーするのに十分なアガロースを使用してください。アガロースが硬化している間、細かい鉗子を使用して魚をまっすぐな位置に向け、腹側を下に、皿の中央に向けます。</li>
		<li>神経筋伝達を遮断するために、10 μM の臭化パンクロニウムを含む記録溶液を 2 mL追加します ( 材料表を参照)。麻痺の添加は録音の間に小さい動きによるアーティファクトを除去するために必要である。</li>
	</ol></li>
	<li>電気生理学的記録
	<ol>
<li>マイクロピペットに記録溶液を充填します。</li>
		<li>電圧クランプ構成でパッチクランプアンプ( 材料表を参照)を使用して、バスの電極抵抗を測定して正しい値を確認します。</li>
		<li>20倍の目的を使用して、幼虫の頭部を中央視野に置き、マイクロピペットを下げて脳内の記録位置に達し、光学テクタム内に配置する。</li>
		<li>パッチクランプアンプを電流クランプに切り替え、保持電流を0 mAに固定します。</li>
		<li>1 kHzのローパスフィルタ、1 kHzの取得レート、デジタルゲイン10を使用して、ベースライン活動レベルを決定するための60分間の自発的な活動を記録します。</li>
		<li>ベースライン記録の1時間後、200 μLペンチレンテトラゾール(PTZ、 材料表を参照)溶液を浴槽に加え、20 mmol/L PTZの最終濃度を取り付けます。</li>
		<li>さらに120分間、PTZのニューロン活動を記録します。</li>
	</ol></li>
	<li>脱分極イベントの決定
	<ol>
<li>フィールド記録イベントは、非常に低速のダイナミクスを持っています(関心のある周波数は0.005-0.2 s-1の範囲にあります)。したがって、エイリアスを回避するために、低いパス(バターワース5次LPF 100 s-1)で信号をフィルタリングします。取得フレームレート(この場合は1 ks-1)から記録された電圧データを250 s-1(RAW SIGNAL)までサブサンプリングします。</li>
		<li>各分極解除イベントのタイムスタンプを識別するには、記録された信号のハイパスフィルタ版であるDETECTION SIGNALを使用します(バターワース1次HPFは0.01 s-1です)。</li>
		<li>低周波成分を排除することにより、単純な閾値法を用いて脱分極イベントの検出を行うことができる。ノイズ除去とイベント検出に固定のしきい値を使用します(この調査には 0.3 mV を使用)。</li>
		<li>4 s 未満の時間間隔で発生する一連のしきい値による脱分極イベントの特徴付け。しきい値交差の連続したシーケンスから決定された脱分極イベントの開始と終了を計算します。40 ms より短いイベントは、ノイズとして破棄できます。</li>
		<li>フィルターなし (RAW SIGNAL) 内のイベントの振幅を計算して、イベントのピーク時にローパス フィルタリングが発生した場合のエラーを排除します。フィルタされた信号で決定されたタイムスタンプを使用して、未加工信号から脱分極ウェーブレットを選択します。生信号から選択したウェーブレットの最大値と最小値の差として振幅を測定します。 注: 手順 3.4 - 脱分極イベントの決定を実行し、 図 1 を取得するスクリプト ファイルは、この資料に添付 された補足ファイル として提供されます。</li>
	</ol></li>
</ol>

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著者らは開示するものは何もない。

てんかんは複雑な神経疾患であり、遺伝的シーケンシング技術25、26、27の出現で解明され始めている広範囲の病因を特徴とする。多目的な動物モデルは、遺伝的に結合したてんかんの病理学的メカニズムに関する洞察と、この状態の明確な形態の標的療法の両方を生み出す効率的な翻訳戦略に不可欠である。ゼブラフィッシュモデルは、てんかんの主要な特徴を再現し、抗てんかん薬スクリーニング5、28のための信頼性の高い読み出しを提供するのに非常に効果的です。これらのモデル28において遺伝子組み換えゼブラフィッシュ15、29、30、31および神経生理学的解析において自然発作が検出され、てんかん様行動32,33の神経基盤を確認している。小型ゼブラフィッシュの幼虫は、潜在的な治療法の迅速な検出を可能にする自発的な水泳などの単純な行動の自動検出を使用して、96ウェル形式の化学スクリーンに適しています。
ここで提示された DEPDC5 ノックダウンモデルは、開発中の遺伝子発現を遮断するためにゼブラフィッシュ胚にAMOを注入することによって得られる。このモデルは、幼虫の発達のさまざまな時点で、化学的または遺伝的スクリーニングプロトコルの間に治療効率の指標として使用することができるいくつかのキーストーン表現型の特徴を提示する。AMO媒介遺伝子ノックダウンは、特に目的の遺伝子の発現を標的とするため、化学的に誘発された発作モデルよりも利点を示す強力な技術であり、遺伝子変異によって引き起こされる根本的な病原性メカニズムの同定を可能にする。それにもかかわらず、薬物スクリーニングのための強力なツールである化学誘導物質は、研究中の遺伝子変異に常に関連しないかもしれない複数の細胞経路を介して作用することができる。AMO注入は、実験者によって習得されたとき、それ自体が簡単なテクニックですが、それはまた、いくつかの制限を提示します。注射は、1つの細胞段階の胚で行われなければなりません;私たちの手の中で、後の段階での注射は表現型の変動性を大幅に増加させた。これは、注射に利用可能な時間を制限します;したがって、時間シーケンスで注入用の卵を生成する戦略が有用である。15~20分間隔で開く4-5のクロスを日常的に使用し、次のクラッチを取得する前に1つのクラッチを注入できるようにします。さらに、開発の最初の日にステレオタイプの行動が急速に進化するので、異なる実験の間の同時に表現型を評価するために注意する必要があります。過剰な量を注入することによる一般的な毒性は特定の表現型を隠すので、AMOの量と濃度も慎重に制御する必要があります。導入で提示されるさまざまなコントロールは、適切な注射用量と対応する表現型を決定するために不可欠です。
幼虫ゼブラフィッシュ脳のフィールド記録は、世界的な神経活動34に対する異なる脳障害に関与する遺伝子変異の有害な影響を調べるための有用なツールである。これらの実験条件下で見られる脱分極事象は、異なるてんかん条件15,35における薬物の電気生理学的効果を評価するための確立された方法である。しかし、これらの効果の評価は、主に定量的ではなく定性的に行われ、分析のアクターとして主観的な観察者を持っています。ここでは、脱分極率、振幅、持続時間を客観的に定量化し、時間の経過や異なる遺伝的または薬理的介入でこれらのパラメータの進捗状況を評価できる自動検出戦略を開発します。
ここで示した代表的な結果は、4-6 dpfゼブラフィッシュのミスマッチ制御と比較して DEPDC5 ノックダウン遺伝モデルの予想されるフィールド活性を示し、PTZの適用前後にてんかんのような電解活動を導入した。以前は 、DEPDC5 ノックダウン条件18の基底活動の有意な増加を示した。ここでは、この2つの条件のPTZに対する反応が、比較的低い周波数、高振幅の偏光事象の期間から始まり、より高い周波数、低振幅の偏光イベントの期間を継続して、時間内に同様の軌道を有することを示す。フィールド記録イベントは低速ダイナミクスを持つ(関心のある周波数は0.005-0.2 s-1の範囲にある)ため、ローパスフィルタとハイパスフィルタの両方がこのプロトコルで使用され、対象となるイベントを分離します。低周波ノイズを除去した後、単純なしきい値を使用して脱分極イベントの検出を行います。信号の統計は脱分極イベントの存在によって大きな影響を受けるため、この閾値を決定するために全信号の標準偏差を使用することはできませんでした。データセット間の標準偏差の値の変動性は、観測された記録ノイズレベルよりも大きかった。そこで、トレースの目視検査の後、異なるレベルの脱分極活性によって誘導されるバイアスを回避するために、0.3mVの閾値の固定値を用いた。
本プロトコルは、運動行動およびニューロンフィールド活性を評価するための標準化された簡単な方法を提供し、細胞外電流クランプ電圧記録を介して、光学テクタムにおける脱分極事象の自動検出と相まって、ゼブラフィッシュモデルにおけるてんかん様表現型を特徴付ける。

開発初期段階では、その小さなサイズ、排卵性の発達および透明性のために、ゼブラフィッシュは、心血管、癌または神経疾患1、2のように多様なヒト疾患をモデル化するための貴重な脊椎動物生物として出現した。ゼブラフィッシュは、臓器アーキテクチャと遺伝コードの高い保存を含む脊椎動物の利点と、より単純なモデル生物の小さなサイズと遺伝子操作の容易さを兼ね備えており、基礎的な研究と翻訳アプリケーションの両方を促進します。特に、細胞プロセスの挙動および蛍光マーカーのハイスループット自動スクリーニングに対するアメント性は、てんかん研究にとって特に魅力的なモデルとなっています。これは、てんかん3、4、5の化学的誘導および/または遺伝的モデルを特徴とする出版物の数の過去10年間の高い増加によって実証されている、と、さらに最近では、これらのモデル6、7、8の化学スクリーンから得られる有望な治療薬の報告。
DEPDC5は、GATOR1複合体のメンバーであり、mTORシグナル伝達9の負の調節因子である。DEPDC5遺伝子の変異は、2013年に常染色体優勢性焦点てんかん10,11に罹患したプロバンドにおいて初めて発見され、その後、てんかん症状および焦点皮質異形成症12に関連する多くの臨床状態で報告されている。報告された突然変異の大部分は、遺伝子12の機能喪失を引き起こすと予測されており、これはナンセンス媒介mRNA崩壊12、13によって標的とされる多数のDEPDC5変異転写物について正式に実証された。一致して、アンチセンスモルフォリノオリゴヌクレオチド(AMO)を使用したゼブラフィッシュの遺伝子オルソローグのノックダウンは、多動、ターンホイールのような水泳、自発的な発作および強化された神経活動14、16、17、18を含む、この生物のてんかんモデルに共通する多くの特徴をもたらす。興味深いことに、mTORシグナル伝達の阻害剤であるラパマイシンによる治療は、このモデル18の行動特徴を逆転させ、DEPDC5機能喪失がmTOR経路9,19の不調整によりてんかんを引き起こす可能性があるという仮説を支持している。
モルフォリノ修飾を担うアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた生体内での遺伝子発現の一過性ノックダウンは、si/shRNAベースの技術と同等に、特定の遺伝子の役割を研究するための非常に貴重なツールであった。最近、AMOベースの戦略はまた、201620年にデュシェンヌ筋萎縮症の治療のためのFDA承認を受けた最初のAMO療法で、臨床応用を発見しました。ゼブラフィッシュでは、急性AMOベース遺伝子ノックダウンの表現型が常に構成的ノックアウトモデル21と相関するとは限らないが、これは少なくともいくつかの例では、構成的な遺伝子組換えによって生み出される補償機構に起因する可能性がある22。しかし、AMO誘発表現型の特異性の問題は、この技術23を用いた研究において熱心に取り組まなければならないという論争の余地のない懸念である。AMOベースのノックダウン表現型の特異性を確保するためには、いくつかのキーコントロールが必要です。これらには、遺伝子ノックダウンに有効なAMOの最も低い用量の選択を可能にする用量応答曲線が含まれ、過剰な遺伝物質の導入による全体的な毒性を回避する。また、ゲノム内の特定の領域を標的としない ミスマッチ AMOの使用は、適切な用量を確立し、特定の表現型を同定する際にも必要である。スプライス遮断AMOのような同じ遺伝子の異なる領域を標的とする第2のAMOは、その表現型が標的遺伝子のノックダウンによるものであることを確認する必要がある。遺伝子のcDNAを用いたノックダウン表現型の救出は、ヒトオルソローグまたはAMOでは標的とできないゼブラフィッシュ遺伝子のコドン修飾バージョンのいずれかで、表現型特異性を支持する強い議論を提供する。機能喪失突然変異(早期停止コドンの導入など)を含む同じcDNAを伴う救助の欠如は、この方向のさらなる証拠である。
ここでは、ゼブラフィッシュDEPDC5機能低下モデルを生成する方法と、受精後28時間および48時間での行動式定型法(hpf)を生成する方法を提示する。28 hpfでは、DEPDC5機能喪失は、絨毛膜内の胚の強化された巻きおよびけいれん運動によって証明されるように、全体的な多動性を引き起こす。この段階で自動動き検出システムを使用して、胚あたりの全体的な活動を定量化することができます。48 hpfでは、ゼブラフィッシュはタッチに応じてステレオタイプのエスケープスイミングを示しています。DEPDC5のダウンレギュレート発現を有するゼブラフィッシュにおいて、泳ぐ軌道はコントロールよりも著しく激しく、この生物3,4における他の報告されたてんかんモデルと同様に、パターンのような「コルクスクリュー」または「ターンホイール」を呈する魚。電気生理学的記録は、受精後4〜6日の間にゼブラフィッシュ幼虫の視体で得られ、DEPDC5ノックダウン動物における神経活動のベースライン増加を示した。このモデルの利点は、異なる時点でいくつかの表現型の特徴を提示し、開発中の薬物療法の有効性を監視および評価するのに役立つことです。

<table><tbody><tr><td>アガロース</td><td>シグマ-アルドリッチ、フランス</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>水族館の塩&nbsp;</td><td>インスタントオーシャン、ブラックスバーグ、バージニア</td>州 <td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス、フィラメント付き</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-50-10</td><td>OD: 1.5mm、ID: 0.5 mm</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, France</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Depdc5-atg antisense morpholino</td><td>GeneTools, OR, USA</td><td>N/A</td><td>sequence 5'- TGCCTTCATGGTGACCGTCATTTTA -3'&nbsp;</td></tr><tr><td>Depdc5-mis アンチセンスモルフォリノ</td><td>GeneTools, OR, USA</td><td>N/A</td><td>sequence 5'- TGCgTTgATcGTGACCcTgATTTTA -3'&nbsp;</td></tr><tr><td>Depdc5-splice antisense morpholino</td><td>GeneTools, OR, USA</td><td>N/A</td><td>sequence 5'- ACATTCCTGTTTCACCATAGATGAT -3'</td></tr><tr><td>デジタイザー</td><td>Molecular Devices, CA, USA</td><td>Digidata 1550</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green Dye</td><td>Sigma-Aldrich, France</td><td>F7258</td><td>Stock solution of 0.2</td></tr><tr><td>%Glass-bottom petri dish</td><td>Ibidi, Germany</td><td>81218</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich, France</td><td>68270</td><td></td></tr><tr><td>Grasshopper 2 camera</td><td>FLIR, BC, Canada</td><td>GRAS-03K2M-C</td><td>formerly Point Grey研究</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, France</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Human wild-type DEPDC5 cDNA</td><td>Dharmacon, France</td><td>NM_001242897.1</td><td>&nbsp;アクセッション: BC144291 Clone ID 905</td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>NIH, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, France</td><td>P9333&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matlabソフトウェア</td><td>MathWorks, MA, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich, France</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, France</td><td>S7653&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich、フランス</td><td>71687</td><td></td></tr>臭<tr><td>化パンクロニウム&nbsp;</td><td>Alomone Labs</td><td>P-130</td><td>水溶液60mMのストック溶液</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich, France</td><td>P7793</td><td></td></tr><tr><td>Patch clamp amplifier</td><td>Molecular Devices, CA, USA</td><td>MultiClamp 700B</td><td>コンピュータ制御パッチクランプアンプ</td></tr><tr><td>pClamp10 取得ソフトウェア</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Pentylenetetrazol (PTZ)</td><td>Sigma-Aldrich, France</td><td>P6500</td><td>ストック溶液 300 mM (記録溶液溶解)</td></tr><tr><td>ピペットプーラー</td><td>成重</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>ニューマチックピコポンプ&nbsp;</td><td>WPI, France</td><td>PV 820</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 kit</td><td>Sigma-Aldrich Intl.</td><td></td><td></td>761036</tr><tr><td>トランスファープラスチックピペット</td><td>Sigma-Aldrich, France</td><td>Z350605</td><td></td></tr><tr><td>Zebralab</td><td>Viewpoint, France</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

てんかんのゼブラフィッシュモデルにおける行動と生理学的解析

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

てんかんは最も一般的な神経疾患の1つであり、世界中で推定5,000万人に影響を与えています。最近の遺伝子研究の進歩は、てんかんの様々な形態に関与する遺伝子の広いスペクトルを発見し、この障害の異種性の性質を強調している。適切な動物モデルは、てんかんに関与する遺伝子変異によって引き起こされる病理学的メカニズムを調査し、特殊な標的療法を開発するために不可欠です。近年、ゼブラフィッシュは、遺伝子操作とペンチレンテトラゾール(PTZ)などの既知のてんかん原性薬物への暴露の両方を使用して、新しい抗てんかん治療薬を同定する、てんかんをモデル化するための貴重な脊椎動物生物として出現しています。mTORレギュレータ DEPDC5 の有害突然変異は、様々な形態の焦点てんかんと関連しており、ゼブラフィッシュオルソローグのノックダウンは、自発的な発作様エピソードに関連する多動性を引き起こすだけでなく、電解活動の強化および特徴的なターンホイールの水泳を引き起こす。ここでは 、DEPDC5 機能低下モデルの生成に関与する方法を説明し、受精後28時間および48時間(hpf)での運動活動を評価するためのプロトコルと、ゼブラフィッシュ光学テクタムにおけるフィールド活性を記録する方法を示す。経時の神経活動に対するてんかん原性薬物PTZの効果の図も提供される。

図1 は、2つの遺伝的状態の場合の4-6 dpfゼブラフィッシュ幼虫の細胞外野記録の代表的な電圧トレースを示しています:ミスマッチコントロールと DEPDC5 ノックダウン。記録のベースライン期間では 、DEPDC5 ノックダウンは自発的なイベントの発生が高いことを示し、ミスマッチコントロールは非常に少ない変動を表示します。これらの活動パターンは、我々が以前に報告したように DEPDC5の機能の喪失による神経活動の有意な増加を代表する、18.PTZアプリケーションの後、ミスマッチ制御と DEPDC5 ノックダウンの両方が、脱分極イベントの増加を示します。PTZアプリケーション(10〜60分)後の最初の期間には、ミスマッチコントロールと DEPDC5 ノックダウンの両方で毎分0.8イベントの割合が観察され、イベントの大半は高振幅(&gt;1 mV)です。後者の応答期間(PTZ適用後60分~120分)の間、分極解除率は1分あたり約1イベントに増加し、イベントの大半は振幅が低い(≤1 mV)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58837/58837fig1.jpg"> 図1:ゼブラフィッシュ幼虫脳におけるフィールド記録の痕跡 例(A)ミスマッチコントロール幼虫とDEPDC5ノックダウンのための180分記録の概要。まず、自発的なベースライン活動が記録され、次にPTZが浴中に適用された(赤い棒)。(B) ミスマッチ制御とDEPDC5ノックダウンのための脱分極イベントのペリ刺激時間ヒストグラム。イベントは高振幅(&gt;1 mV - 青)と低振幅(≤1 mV - 黒)に分類されました。(C-E)記録の異なる期間のトレース例: (C) 自発的活動, (D) PTZ適用後の最初の期間における高振幅イベント、 (E) PTZ適用後の後期の低振幅イベント。これらの図を取得するスクリプト ファイルは 、補足ファイルとして提供されることに注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58837/58837fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル: ステップ 3.4 のスクリプト ファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58837/Supplementary_File.zip" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

ここでは 、DEPDC5 遺伝子の一過性阻害に起因するてんかんのゼブラフィッシュモデルの開発および特性評価のためのプロトコルを提示する。

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

このプロトコルは、焦点てんかんの最も一般的な原因であるWC5遺伝子のノックダウンの影響を迅速に評価する方法を提供する。この技術の主な利点は、発達の様々な段階で行動と生理学的特徴の両方を使用して表現型のようなてんかんを評価するためにそれを使用できることです。マイクロインジェクションの前日、ゼブラフィッシュの交配タンクを設置する。注射の朝、分社を取り除いて産卵を有効にします。細かいふるいを使用して、卵を胚の水で満たされた100ミリメートルのペトリ皿に移します。プラスチック製のパスツールピペットを使用して、60〜80個の卵を選び、注射のためにシリコーンコーティングされたペトリ皿に卵を配置します。私たちは水のほとんどを動かし、卵を半分に覆うのに十分なままです。ガラスの針を注射液のチューブに垂直に入れます。数分間にわたって毛細血管作用によってチューブを充填するために着色された溶液を許可します。注射液が針先に見える場合は、マイクロインジェクタの注入ハンドルに針を取り付け、空気圧縮機をオンにします。圧力設定を調整して、2ナノリットルの射出量を生成します。そして、4倍の倍率で、解剖双眼顕微鏡の下に卵を配置する。絨毛膜と単段胚の黄身を通して針先を挿入し、各細胞内に直接溶液を注入する。その後、注入した胚を胚水のラベル付き100ミリメートルペトリ皿に移し、プレートを摂氏28度のインキュベーターに入れます。受精後28時間、テスト皿の底にプラスチック1.2、1.2ミリメートルのメッシュグリッドを置きます。プラスチック製のパスツールピペットを使用して、その子の内部に10〜12個の胚をプラスチックメッシュに配置します。胚を水没させ続けるのに十分な胚水で皿を満たし、浮遊せず、必要に応じてプラスチックチップで胚をグリッド上の位置に慎重に移動させます。次に、解剖顕微鏡に取り付けられたビデオカメラを使用して、10〜20分間の自発的な巻き取り活動を記録する。自発的な動きの合計を分析するには、Zebraラボシステムの活動定量モジュールを使用して、記録されたビデオをアップロードし、必要に応じて各胚の周りの追跡アリーナを設計します。フリーズとバーストのしきい値をそれぞれ 10 と 50 に設定します。そして、自動ビデオ分析時に、定義された各アリーナ内の総アクティビティを定量化します。次に、適切なデータ解析ソフトウェアを使用して、分析を実行するためのスプレッドシートとしてデータセットを回復します。受精後46時間、微細な鉗子を使って胚をデコリオ化し、130ミリメートルの試験皿を胚水で満たす。残りの15分前に、28°Cのインキュベーターでテスト皿を温めます。タッチ呼び起こされる脱出応答テストを実行するには、プラスチック製のパスツールピペットを使用して、テスト皿の中央、カメラの下に胚を配置します。1 秒あたり 30 フレームの取得レートを使用して、記録を開始します。細かいプラスチックチップを使用して、わずかにフリックモーションで胚の尾部に触れます。幼虫がその動きを終了したとき、記録を停止します。次に、胚を新鮮な胚水で満たされた新しい保持皿に移し、実験条件ごとに必要な数の胚で試験を繰り返す。電気生理学的分析のためにゼブラ魚を準備するには、ガラス底のペトリ皿に受精後1、4〜6日を置きます。魚ができるだけ皿の底に近づくことを確実にするために、余分な、余分なセーラーミディアムを取り除きます。プラスチック製のパスツールピペットを使用して、幼虫を覆うのに十分な暖かい液体アグロを追加します。アグロはハードネスながら、細かい鉗子を使用して、魚の腹側を皿の中央に下向きにします。次に、2ミリリットルの記録溶液を加え、10ミクロモルパンクロニウム臭化物を含む臭化物を皿に入れて、神経筋伝達を遮断する。次に、マイクロピペットを記録溶液で充填し、電圧クランプ構成でパッチクランプアンプを使用して、その正しい値を確認するために浴内の電極抵抗を測定する。20xの目的を使用して、幼虫の頭部を中央視野に置き、マイクロピペットを下げて、視テクタム内の記録位置に到達します。パッチクランプアンプを現在のクランプ構成に切り替え、保持電流をゼロミリアンペアに固定します。1キロヘルツのローパスフィルターと1キロヘルツの取得率、および10のデジタルゲインを使用して、魚の自発的な活動を60分間記録して、ベースライン活動レベルを決定します。ベースライン記録の終わりに、1リットル当たり300ミリモルの1リットルの143マイクロリットルで、1リットル当たり20ミリモルの最終濃度を得た。ペンチレンテトラゾール溶液で動物の神経活動をさらに120分間記録する。記録のベースライン期間中、受精後4〜6日のてんかんモデルシマウマ魚は自発的な事象のより高い発生を示し、ミスマッチコントロール魚は非常に少ない変動を示す。ペンチレンテトラゾール適用後、ミスマッチ制御とてんかんモデルシマウマ魚の両方が深い偏光事象の増加を示す。ペンチレンテトラゾール塗布後の最初の期間において、ミスマッチ制御とノックダウン動物の両方で毎分0.8のイベントの割合が観察され、大部分のイベントが高振幅である。後者の応答期間中。分極解除の割合は、1 分あたり約 1 つのイベントに増加します。そして、イベントの大半は低振幅です。ノックダウンを行う場合、用量応答曲線を用いてモルフォリノスの正しい用量を確立し、非特異的毒性を回避するための制御を行うことが非常に重要です。このプッシュは、遺伝的または化学的な修飾剤の効果をテストするなど、いくつかの下流の研究を可能にします。そして、ゼブラフィッシュの行動と神経活動は、DC 5突然変異の発達効果を理解する。

behavioral-and-physiological-analysis-in-a-zebrafish-model-of-epilepsy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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