Name: 体外皮膚細胞移動へのヒ素の効果を発揮するアッセイをスクラッチします。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: 学ぶスクラッチアッセイによるヒ素が皮膚細胞移動に与える影響の評価法。創傷治癒メカニズムの理解と毒性物質の細胞応答解析に有用な、コスト効率の高いin vitroモデルです。

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この出版物で報告された研究は、少数の健康と受賞番号 U54MD012388 の下で健康の国民の協会の健康格差に関する国立研究所によって支えられました。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

この試金のアプリケーションは、細胞運動の高スループットで的確な評価を提供し、直接に複雑な生理学的システム5,6,7に変換可能性があります。このため、提案のベンチ上モデル調整され創傷治癒6様々 な治療薬や環境毒素の効果を評価する練習します。現在の研究で使われるヒ素の濃度既知の暴露レベルの広範な文献検索環境に関連すると判断された、様々 なデータのレトロスペクティブ レビューから拠点14,15, 16,17,18,19,20,21。この体外スクラッチ法高は、しかし、環境に関連する範囲内でのヒ素濃度への暴露を示した、創傷閉鎖 (細胞移行) を遅延します。
このベンチ上モデルを分離し、さらに線維芽細胞の移行が創傷治癒成果に貢献する方法を理解する個々 のセル行 (繊維芽細胞) の研究も併せて行った。さらに、分析に干渉できる他の多くの細胞や組織の存在が複雑な体内システムの個々 のセル行の関数を研究することは困難です。さらに、アッセイは、創傷治癒に影響場合があります化合物、細胞の特定のメカニズムをターゲットに使用することができます半定量的パーセント創傷閉鎖データを達成するための手段を提供します。スクラッチの試金で使用されるセルに対して収集し必要な試薬に格納されているし、遺伝子発現で使用されることができますたとえば、(mRNA 信号) または蛋白質の表現を試金する22。この情報は、信号または蛋白質主原因さまざまな処置 (すなわちヒ素)22の存在下での細胞の移行の変化に理解を求める場合に、調査担当者にできます。
ヒト新生児皮膚線維芽細胞の創傷治癒における顕著な役割に基づいてこの仕事に選ばれました。ただし、このスクラッチの試金のプロトコルは種々 の細胞を使用して実装されては、研究目的の範囲。たとえば、スクラッチのアッセイは、腫瘍化学療法薬23; の遊走阻止を勉強するためのフィールドに採用されています骨格筋細胞の遊走・増殖・拡散24;細胞移行25; に植物エキスの影響を検討するにはケラチノ サイトの移行および拡散を創傷治癒9に貢献する方法を理解します。さらに、ピントらが以前報告は、スクラッチ試験6を使用して hDFn 移行に及ぼすウラン (U) と多血小板血漿 (PRP) を評価した.この作業の目的は、この試金が細胞移行 (U) を遅くと思ったエージェントとして細胞移行 (PRP) を高速化すると思ったエージェントの効果をテストできる範囲を把握するだった。上記の作品に見られるように、他の研究者は、スクラッチのアッセイの応用研究は、さまざまな実験モデル26使用の可能性が高い。詳細はメソッド内で提供される、にもかかわらず捜査官と実験の分散を期待すべき。たとえば、細胞移動率、可能性があります、一意のセルのタイプに必要な必須微量栄養素に加えて、使用中のセル行に基づいて変動します。セル収量および生存率で支援するために重要な観測の多くはこのプロトコルの全体でメモとして表示されます。捜査官一般的な細胞培養作業の補習授業としてこのメソッドを使用する最適な成長条件の製造元の推奨事項に従うことを強くお勧めします。
スクラッチの試金は非常に多彩な細胞活動の研究のため計測技術で予期せぬバイアスが生じることがあります。たとえば、セル移行の面を手動でトレースする ImageJ を使用して、バリエーションは精度と代表的なデータの収集を制限することができます、ユーザー間でにあります。また、ユーザーのバイアスを最小限に抑える治療に移行前線をブラインド読むことを注意する必要があります。さらに、細胞と視覚的に誤解を招くことができるフォームの焦点接着斑に到達する能力によって仮足を形成するための平均距離の誤算で手動で移行の面を識別する可能性があります。同じように、細胞表面に蛍光「携帯トラッカー」の使用染料または移行を検出する核蛋白質は細胞細胞移行時間の経過を測定する際の誤りの結果を定めることができる意図せず。正または負の値に適切なコントロールが完全にロバに実験内で登録することをお勧めしますが、細胞に対する治療の効果。その限界が認められこの試金の練習を行う必要があります。この試金はin vitroの実験から得られた細胞移行結果は、生体内で成果.に翻訳直接を保証しません複雑な生活における創傷治癒と細胞移行を含む多数の細胞の種類と分子信号;それぞれは治癒反応に影響を与える可能性があります。
要約すると、スクラッチのアッセイは、環境6,25の変更への応答における細胞移動の高速スクリーニングを提供するために発見されています。具体的には様々 な環境に関連する用量でヒ素曝露の結果として細胞の移行の変更を正常に検出するこのプロトコルを利用しました。これらのデータは、スクラッチの試金を使用して研究をさらにおよび細胞移行この試金およびヒ素暴露によってこれらの経路を変更する方法での生成経路を評価する正当な理由を提供しています。

創傷治癒は、複雑な一連のさまざまなセルタイプ、シグナル伝達分子および細胞外マトリックス成分1を含む手順を重複するで構成されています。一緒に、これらのコンポーネントは、傷の解像度や修理は、最終的に外傷1の程度に応じて保護線維性瘢痕の形成につながるを達成するためにコンサートで動作します。個々 のプロセスと傷の機能をキャプチャするには、1 つの実験の治癒は困難です。創傷治癒過程の個々 のステップは、識別され、個別にテストする必要があります。創傷治癒の多くの手順の間で携帯電話の移行のプロセス考えられている重要な治癒率2を評価するとき。細胞移行で創傷治癒のすべての段階で観察することができます、このように分業の細胞移動に変更することができます創傷閉鎖にどのような影響を与えるかを理解。たとえば、細胞の移行は傷サイト3における血液凝固・血小板凝集との両方の初期と後期相炎症で見られます。これらのイベントは、組織3を欠いている負傷者の領域の塗りつぶしに一時的な閉塞を形成することにより過度の出血を防ぐ。循環中の血小板は合成され、遊走因子、炎症性白血球の遊走 (白血球) の負傷者の組織への一緒に信号修理4と共に血管作動性メディエーターの分泌されます。再上皮化は組織傷害の時間内で発生し、活動とさらに汚染を防ぐために上皮ケラチノ サイトの移行または傷サイト2に異物の侵入によって傷口をカバーが含まれます。これらの例は、関数に関連付けられている多くの細胞移動のいくつかは創傷治癒だけをキャプチャします。
スクラッチのアッセイは、説明し、細胞の遊走や創傷治癒の5,6に於いての多くの役割を理解するために使用されています。この試金簡単に割り切っていると見なされます、高スループット、代表的な細胞移行データを収集する治験責任医師をできます。移行の試金は特定の化合物が加速または細胞の移行6の速度が遅く、正常に実証しています。さらに、これらの分析結果はターゲット治療、注入濃度や生体内で実験する前に興味のある遺伝子を定式化する使用することができますトランスレーショナルリサーチの生理学的情報を提供します。アッセイでは、基本的な細胞培養の技術と供給、時間の経過や治療への応答の運動の動きをキャプチャする選択、およびイメージング技術のセルラインを必要があります。
アッセイは、容易に操作またはを調査員のニーズに合わせて選択できます。ただし、実験前に考慮する 4 つの基本的な質問があります。どのような一般的または特定の質問は、答えようとしている代表者ですか。これほとんど仮説研究を駆動に当てはまりますただし、パラメーターの多くは正確にするために必要な完全に質問にお答えを決定するためにこの試金する重要です。何は細胞または細胞の (複数の) の場合は、検討されている生理学的システムを表すに使用ください。たとえば、皮膚の創傷治癒研究、真皮線維芽細胞5,6、7、幹細胞8、または表皮ケラチノ サイト9は、通常見られる細胞集団を表すものと考えられる皮膚組織10で豊富。また、好中球、マクロファージやその他の炎症性細胞は、細胞遊走の創傷皮膚組織10内の他のコンポーネントを表すためこのシステムで評価でした。さらに、評価されている特定のセルの行を識別する、細胞の代謝活性を促進するために使用する最適などの試薬を識別するために役立ちます。細胞の移動であろう追跡イメージか。プレートやフラスコ内の細胞の移動を観察するためのテクニックの数があります。たとえば、染色や蛍光細胞をタグ付け、蛍光や共焦点イメージングを使用して、セルを追跡する非携帯場所対細胞と細胞運動11 を明確に定義する捜査官を可能にする強力な対照を提供します.この研究で説明したもう一つの一般的な手法は、位相コントラスト6,7倒立顕微鏡の使用です。細胞の色素と蛍光に代わるこの末期イメージングの前にセルを修正することがなくトラック セルを生きることができ、時間ポイント間細胞の負傷した単分子膜を含む個々 の井戸の同じイメージをキャプチャすることができます。どのような結果を測定は、分析に使用するでしょうか。調査中に収集画像を用いた細胞移行レートの変更を理解できるデータを生成することができます。私たちの研究室で倒立顕微鏡で撮影した顕微鏡画像の画像解析ソフトにアップロードされ、パーセントの傷口の閉鎖と曲線 (AUC) の面積の合計が計算されます。
我々 は、既知の環境汚染物質、ヒ素の存在下での皮膚線維芽細胞の移行への変更を明らかにするこのアッセイの特定の使用を強調表示されます。ヒ素は、地球の地殻内で見つかった天然メタロイドです。様々 な場所は、これらの場所の近くに住んでいる個人にリスクのヒ素の濃度の上昇と発見されています。その結果、食料と水のソースは、砒素にさらされる個人のための可能性を増加するヒ素汚染のレベルを増加するいると示されています。環境ヒ素暴露は上またはも下、現在アメリカ合衆国環境保護庁 (USEPA) 最大汚染レベル (MCL) 10 ppb (10 μ g/L)12,のひと集団における長期健康の結果に示されています。13.、米国の環境保護庁がこの MCL を設定、制限を飲んでも安全と判断したが、この制限を超えるヒ素濃度は珍しい世界の水源。南西部アメリカ合衆国の地下水、井戸水、温泉やヒ素14のレベルに関するを含む記載されています。たとえば、モンテズマの井戸は Verde の谷、アリゾナ、ヒ素15210 μ g/L 含まれています。ヴェルデ川、アリゾナ州周辺の地下水はピーク値 1.3 mg/L15,16に達するとヒ素の 16 μ g/L を平均すると、含まれています。特に、ヴェルデ川水小屋で多くの幸福のヒ素濃度は 50 μ g/L15,16を超えます。この知識は、環境に関連するヒ素濃度が 10 μ M (750 ppb) 現在で MCL 上記研究14,15,16に 0.1 μ M (7.5 ppb) で MCL の下からその範囲を選択,17,18,19,20.
これらの実験から収集した情報は、ヒ素に汚染された体内の傷細胞移行料金に潜在的な変更の早期指標として使用されます。その後、創傷治癒と細胞の移行を促進することで、役割に基づいたシグナリング分子を選択することができ、今後の量的なポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) をベース遺伝子発現実験を完了する現在のセットアップ可能性があります。研究。この試金の移行レートがヒ素の存在下で変化した場合特定の遺伝子標的細胞移行に伴うヒ素の有害な影響の標的になる可能性があり、従って混乱のメカニズムであるかもしれない。

<table><tbody><tr><td>クラスII A/B3 生物学的安全キャビネット</td><td>Forma Scientific</td><td>15201-816</td><td></td></tr><tr><td>ニトリル手袋</td><td>Kimberly-Clark</td><td>55082</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>精密</td><td>モデル 182</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>Q080318</td><td></td></tr><tr><td>CPR 遠心分離機</td><td>ベックマン</td><td>349702</td><td></td></tr><tr><td>分析スケール</td><td>Ohaus</td><td>I093 1125062111P</td><td></td></tr><tr><td>重み付けペーパー</td><td>VWR</td><td>H351125781212A</td><td></td></tr><tr><td>バイオハザード バッグ</td><td>フィッシャーブラン</td><td>01-830A</td><td></td></tr><tr><td>ウォーター ジャケット CO2 インキュベーター</td><td>サーモ サイエンティフィック</td><td>309739-31053</td><td></td></tr><tr><td>ハンクス バランス塩溶液</td><td>ギブコ</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコのモディファイド イーグル ミディアム</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>自動ピペット</td><td>ドラモンド</td><td>140685</td><td></td></tr><tr><td>p200 ピペット</td><td>ギルソン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p20 ピペット</td><td>ギルソン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>分母</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>D59707</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルーステイン</td><td>ギブコ</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>T75 ティッシュフラスコ</td><td>Corning</td><td>430725U</td><td></td></tr><tr><td>15 mL コニカルチューブ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>05-539-5</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>5 mL ピペット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>10 mL ピペット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュマーカー</td><td>Securline</td><td>92167</td><td></td></tr><tr><td>ワイプ</td><td>Kintech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>70% エタノール</td><td>フィッシャー</td><td>63-67-0</td><td></td></tr><tr><td>ノンフィルター ピペットチップ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>16160210</td><td></td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>大幅</td><td>220-04</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル</td><td>ファルコン</td><td>353915</td><td></td></tr><tr><td>クライオビアル ラック</td><td>Nalgene</td><td>5030-0505</td><td></td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>ギズモ サプライ</td><td>B00SCOGY56</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>コニカルチューブラック</td><td>n/a</td><td></td><td></td></tr><tr><td>12ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3598</td><td></td></tr><tr><td>廃棄物ビーカー</td><td>n/a</td> n<td>/a</td><td></td></tr><tr><td>1 mL ピペット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>13-678-11B</td><td></td></tr><tr><td>ストレートエッジ定規</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Human neonatal dermal fibroblasts (hDFn)</td><td>lot: 1734, 2902</td><td>106-05n</td><td></td></tr><tr><td>Rstudio Statistical Software</td><td></td><td>ver: 3.5.1</td><td></td></tr><tr><td>Image J</td><td>NIH</td><td>ver: 1.8.0_112</td><td></td></tr></tbody></table>

体外皮膚細胞移動へのヒ素の効果を発揮するアッセイをスクラッチします。

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

創傷治癒過程の生理学的メカニズムを理解すること多くの年の進行中の研究の焦点となっています。この研究は、傷の治療と患者の罹患率と死亡率を減少に使用される臨床基準の変更に直接変換されます。創傷治癒、細胞・組織の戦略的な相互作用と機能を必要とする複雑なプロセスです。創傷治癒の多くの非常に重要な機能の 1 つは、個人や集団の細胞移行です。傷害、時に周囲の結合、および上皮組織を急速に血液からさまざまな細胞化学的および/または物理的な刺激による創傷サイト移行します。この移行応答は、成果と癒しの傷の成功に大きく左右します。この特定の細胞機能を理解することは、改善された傷口治癒成果につながることができますトランスレーショナル医学にとって重要です。ここでは、創傷治癒とどのように携帯電話の環境への変更がこのプロセスを大きく変わることに関連した細胞の移行を理解するためのプロトコルについて述べる。この例における真皮線維芽細胞は、培養フラスコで単層培養として培地牛胎児血清 (FBS) で栽培されました。細胞は無菌培養治療 12 ウェル プレートに移され、100% 合流に成長しています。合流点に達したら、単層の細胞では p200 ピペット チップを使用して傷が垂直方向に。FBS を添加した培地で希釈したヒ素に追加された個々 の井戸で環境に関連する線量 0.1-10 m. 画像は細胞運動を観察する (傷倒立顕微鏡を使用して 24 時間期間 (h) 毎 4 時間をキャプチャされました。閉鎖)。画像を個別に画像解析ソフトウェアを使用して分析し、% 創傷閉鎖を求めた。結果は、ヒ素が創傷治癒を遅らせることを示しています。この手法は、創傷治癒過程における汚染物質の影響評価のための迅速かつ安価な最初の画面を提供します。

すべての治療群のサンプル サイズ (n) はn = 28。細胞が正常に培養次無菌テクニックと実験室のプロトコル (図 1)。制服の傷は、0.8 mm 0.4 mm (図 2) 平均の傷幅ですべての治療群間で観察されました。コントロール グループがあった [1,355.83; のカーブ値平均合計面積治療グループとして 0.01 μ M 平均であった 1,366.21; のカーブ値の下の領域の合計治療グループとして 0.1 μ M 治療群として 1.0 μ M 平均合計、1,326.24 のカーブ値の下の領域を持っていた、平均であった 1,295.10; のカーブ値の下の領域の合計最後に 10 μ M 治療群は統計的に低いである 535.12 の曲線の価値の下の平均合計面積と比較して他のすべてのグループ (p &lt; 0.05) と (図 3)。R - 統計解析プログラム (p &lt; 0.05) の治療群間に有意差を決定するためのテューキーホックをポスト調整で一方向の分散分析を実行する使用されました。
<img alt="ヒ素曝露下での細胞増殖;顕微鏡検査の結果;コントロール、1.0 μM、および 10 μM As を 20 時間以上使用します。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図 2: 代表的なスクラッチが 20 時間の期間にわたって画像をアッセイします。画像 A ~ D を表すコントロール セルの細胞の移行画像 E H 表す; 1.0 μ M で汚染された細胞の細胞移動画像 L として 10 μ M で汚染された細胞の細胞移動を表しています。これらの画像からヒ素の存在下で細胞の移行が遅くなることが明らかです。コントロール画像は、一方、他の 2 つの治療としてグループ「癒されていない"20 時間後完全に「治癒」ゼロを示しています。治療として 10 μ M は完全な閉鎖を抑制した 24 時間後に全く<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="ヒ素の用量反応を示す棒グラフ。さまざまな濃度で合計されたAUC。実験結果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図 3: ヒ素スクラッチ試験で携帯電話の移行が遅くなります。さまざまな濃度のヒ素の存在下での細胞移動率変化を観察する 24 時間の期間にわたって撮影。Raw 画像は、当初測定傷幅、パーセントの閉鎖、最終的に (AUC) 曲線下面積で計算されます (例えばMATLAB で)、自動化されたソフトウェアを使用して分析しました。誤差範囲は、平均値の標準誤差を表しています。治療グループとして 10 μ M は統計的にひと皮膚繊維芽細胞の新生児 (hDFn) テューキーのホックをポスト調整 (p と一方通行 ANOVA を使用して他のすべての治療群と比較して統計的に低い AUC 値で示す細胞移行を鈍化&lt; 0.05)。統計的な差異は、R プログラムで使用できるコンパクトな文字表示法を使って得られた"A"と"B"の文字で表されます。共通の文字を共有しない治療が互いから統計的に有意 (p &lt; 0.05)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

本研究は、創傷治癒 (スクラッチ試金) メカニズムとしてヒ素の影響細胞移行などどのように環境汚染物質を決定するための生体外モデルに焦点を当てください。結果は、このin vitroアッセイが生体内で実験する前に携帯電話の移行への変更の迅速かつ早期の徴候を提供することを示します。

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

細胞の移動は、治癒創傷の結果を劇的に変えることができる重要な創傷治癒プロセスである。このプロトコルは、研究者が創傷治癒中の細胞移動に対する様々な化合物の影響をよりよく理解することを可能にする。これはしばしば臨床医学のための標的治療戦略につながる可能性があります。スクラッチアッセイは、費用がかかり、時間のかかるインビボテストの前に有意義な創傷治癒データを生成するための費用対効果の高い、高スループットのアプローチです。方法としてのスクラッチアッセイは、創傷治癒用途に特に関連する。最も具体的には、皮膚。しかし、アッセイは実際には移行アッセイであり、細胞の移動が測定または捕獲に興味のあるあらゆる細胞タイプに適用することができる。古典的な細胞および組織培養に類似して、標準的な操作手順、訓練、技術、および練習、練習、練習。これらは、スクラッチアッセイで成功するための鍵です。この手順をデモンストレーションするには、修士課程の学生であるネイサン・クルスと学部研究者のオスカー・ルジャンが行われます。この手順を開始するには、70%イソプロピル水溶液を使用してバイオセーフティIIキャビネットを準備し、衛生ワイプを実行し、背面と側壁から始まり、ベースプレートまで作業します。また、キャビネットに入れる前に、アッセイに使用されるすべての材料を拭き取ってください。次に、所望の凍結保存細胞株を含むバイアルを得て、解凍するために摂氏37度の深さ1センチメートルの水浴に1つを入れる。T75組織培養フラスコに10%FBSを添加した培地10ミリリットルを加える。セルストックを含むバイアルを開き、溶液を慎重に吸引する。次に、細胞をT75フラスコに移します。フラスコから1ミリリットルの培地を取り出し、バイアルに戻し、フラスコに戻してバイアルから細胞収率を最大化します。フラスコのキャップを締め、軽く揺らし、表面全体に懸濁液中の細胞を均一に分散させます。この後、フラスコにここに示す情報をラベル付けし、加湿インキュベーターに摂氏37度、炭酸ガス5%を72時間置きます。まず、培養フラスコをインキュベーターから回収し、テキストプロトコルに概説した接着された細胞を観察する。フラスコから培地の全容を吸引し、それを廃棄物容器に移します。フラスコに5ミリリットルのバランスのとれた塩溶液を加え、余分な培地、死んだ細胞、または廃棄物をすすぎるように穏やかに揺動かします。その後、フラスコから塩溶液の全容を取り除き、廃容器に捨てます。次に、フラスコにトリプシンを2ミリリットル加え、穏やかに揺らし、接着した細胞の上に酵素を分散させます。接着面が完全に飽和していることを確認し、2〜3分間インキュベーターに組織フラスコを入れます。この後、フラスコの側面を3~5回軽くタップして、細胞剥離を容易にします。70%アルコールでフラスコを拭き取り、バイオセーフティキャビネットに入れなさい。5ミリリットルのストックメディアを組織フラスコに加え、酵素基質反応を停止します。フラスコから流体の全容を吸引し、滅菌15ミリリットルの円錐管に移す。200倍gで遠心分離機、摂氏25度で5分間。その後、70%アルコールを使用してペレット化された細胞を含むチューブを拭き取り、バイオセーフティキャビネットの中に置きます。ピペットは培地から離れ、約250マイクロリットルの液体を細胞ペレットで残した。マイクロ遠心チューブラックのバイアルスロットを横切って円錐チューブの底部を実行して、迅速な振動と妨害を作成し、セルペレットを再中断します。正しく完了すると、新しいセル溶液は、残りのペレットのない曇りの混合物として表示されます。細胞の再懸濁液に2ミリリットルの培地を加えます。細胞をチューブの側面を20回静かに上下にピペットし、塊を分解します。そして、セルのサスペンションの総容積を記録します。次に、滅菌ピペットを使用して、96ウェルプレートの空の井戸に20マイクロリットルのトリパンブルーストックを追加します。滅菌ピペットチップを使用して、15ミリリットルチューブからトリパンブルー溶液を含むウェルに細胞ストックの20マイクロリットルを移します。ピペットを穏やかに混合し、カバースリップとヘモサイトメーター上の計室との間の混合物の10マイクロリットルを移す。中央の四角形と 4 つの角の四角形のセルのみをカウントし、識別された 5 つの四角形のセル総数と生存不可能なセル数の両方を個別に集計します。生存セル数を計算した後、12ウェルプレートの底部に水平線をマークし、イメージング中に基準マークとして機能させます。培地で細胞ストックを1ミリリットル当たり19,000セルの密度に希釈します。その後、希釈されたセルストックの1ミリリットルで12ウェルプレートの各ウェルを播種し、細胞ストックを定期的に混合して、12のウェル全体で細胞の播種を確実にします。各プレートに、ここに示す情報を付けます。そして、細胞が100%合流するまで摂氏37度と5%の二酸化炭素で保育器に入れる。インキュベーターから細胞を含む12ウェルプレートを取り出します。10倍の目的を持つ顕微鏡を使用して、細胞を観察し、各ウェル内の合流点を決定します。次に、各ウェルから成長培地を吸引し、廃棄する。P200ピペッタを1~200マイクロリットルの無菌チップで組み立てます。各井戸で、12:00の位置から6:00の場所まで、細胞表面を横切ってピペットチップを滑空して、スクラッチモック創傷を生成します。バランスのとれた塩溶液を1ミリリットルずつよく洗い流し、余分な破片や細胞塊を取り除きます。皿を左右に揺らし、洗浄を容易にします。次に、各ウェルからバランスの取れた塩溶液を取り出し、処分する。1,000マイクロリットルのチップを備えたP1000ピペッタを使用して、調製されたヒ素ストックから1,000マイクロリットルを、処理グループでランダムに割り当てられた井戸に追加します。各井戸に新しいピペットチップを使用し、治療が追加された時間を記録します。5%の二酸化炭素で37°Cでプレートをインキュベートします。プレートを画像化するには、24時間ごとに4時間ごとに10倍の客観的な倍率で各井戸の画像をキャプチャします。プレートの下部に描画された線分を参照して、各時間ポイントの各ウェル内のスクラッチに沿って同じ位置をイメージします。本研究では、インビボスクラッチ試験アッセイを用いて、ヒ素が細胞移動に及ぼす影響を観察する。均一な傷は、すべての治療群にわたって観察され、平均スクラッチ幅は約0.8ミリメートルである。コントロール細胞は、20時間後に完全に治癒した傷を示す。2つのヒ素群は、このレベルの治癒を示さない。10マイクロモル治療で24時間閉鎖を完全に阻害する。これらの結果は、ヒ素の存在が細胞の移動を遅らせることを示している。アッセイ中に撮影された生画像は、自動ソフトウェアを使用して、創傷幅を測定し、閉率を計算し、最後に曲線の下の面積を計算して分析されます。10マイクロモル治療群は、他のすべての治療群と比較して、ヒト新生児皮膚線維芽細胞の統計的に遅い細胞遊覧を示す。細胞を傷つけるときに一貫性を高めるために、この手法を徹底的に実践することが重要です。アッセイ間の意図しない変動は、データを歪め、結論を変える可能性があります。定量的ポリメラーゼ連鎖反応や酵素結合免疫吸着アッセイなどの分子技術は、スクラッチ後アッセイを用いて、アッセイで観察される細胞遊離の変化の標的となり得るメッセンジャーシグナルおよびタンパク質を同定することができる。このアッセイは、研究者のがん転移、新しい新興がん治療、幹細胞および再生医療、および他の多くの科学的マイルストーンの理解に貢献しています。

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体外皮膚細胞移動へのヒ素の効果を発揮するアッセイをスクラッチします。

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