パッチ取り付けの連絡先バブル膜脂質二分子膜実験
January 16th, 2019
ここでは、連絡先バブル膜法を用いた脂質膜の形成のためのプロトコルを提案する.有機溶媒、油水界面単分子層を形成するという水のバブルが吹かれます。2 つのピペットは、層を形成する泡のドック操作されます。
接触気泡二重層法は、従来の脂質二重層の代替技術である。そしてこの方法は膜を通してより多目的な振動を可能にする。CBB法は平面脂質二重層およびパッチクランプ方法の利点を統合する。
脂質二重層技術として、任意の脂質組成を有するCBBを形成することができる。高い信号対ノイズ比を持つ単一チャンネル電流記録用のCBBを開発しました。この方法は、膜振動の品種を可能にし、チャネル膜インターフェースに広大なタイプのプラットフォームを提供しています。
誰もがシャボン玉を吹く経験があります。同様の操作は、口で吹くのではなく、適用される圧力を手動で微調整することによってCBB形成のために取られる。練習し、CBBをお楽しみください。
この手順であることに、丸底フラスコで所望の濃度でクロロホルム中のリン脂質を分散させる。窒素ガスボンベに接続された回転エバポレーターにリン脂質溶液を置きます。薄いリン脂質フィルムが現れるまで、室温で窒素流でフラスコを回転させます。
次に、開いたフラスコを真空ポンプに接続されたデシケータに入れなさい。真空ポンプを使用して、デシケータの内部を数時間吸引し、クロロホルムを完全に除去する。続いて、適量の電解質溶液をフラスコに加え、リン脂質を懸濁して、1ミリリットルのリン脂質懸濁液当たり2ミリグラムを得る。
バスソニテーターを使用して20〜30秒間懸濁液をゾンシエートし、多層ベシクル懸濁液を得る。イオンチャネルタンパク質を含むプロテオリポソームの調製のために、多層ベシクル懸濁液にタンパク質溶液を加える。そして、バス超音波処理器を使用して数秒間超音波処理します。
大きなボアガラスピペットを準備するには、ピペットプーラーにガラスキャピラリーを入れ、2ステップの引っ張りで細かい先細りの先端でマイクロピペットを製造します。次にマイクロフォージにマイクロピペットをセットし、直径30~50マイクロメートルのテーパー部分の白金フィラメントにマイクロピペットの先端を接触させます。フィラメントを短時間加熱し、すぐに消します。
蒸留水とエタノールを使用して、浅い井戸でガラススライドの表面をきれいにします。次に、シリコン化試薬をガラススライドに塗布し、試薬を空気中で完全に乾燥させます。次に、ガラススライドを反転した顕微鏡のステージに置きます。
シリコン化ガラススライドの浅い井戸に100マイクロリットルの六方デカンを加えます。ツベルクリンシリンジを用いて、マイクロピペットの長さの半分まで電解液を充填する。次に、マイクロピペットを圧力ポート付きのマイクロピペットホルダーにセットし、銀/塩化銀のワイヤ電極をピペット電解質溶液に浸します。
マイクロピペットホルダの1つをパッチクランプアンプのヘッドステージに接続し、もう1つを電気的な地面に接続します。その後、マイクロインジェクターをマイクロピペットホルダーの圧力ポートに接続します。マイクロマニピュレーターを使用して、マイクロピペットを反転顕微鏡のステージより上の適切な位置に調整します。
電極オフセット電位を調整するには、ガラススライドの浅いウェルの周りの平らな表面にマイクロピペットを充填するために使用される同じ電解質溶液の1マイクロリットルを置き、電解質ドームを作成します。両方のマイクロピペットの先端を電解質ドームに浸します。その後、パッチクランプアンプの電極オフセット電位を調整します。
先端からリポソーム溶液を引き出すために、スライドガラスの浅いウェルの周りの平らな表面に1マイクロリットルのリポソーム溶液を加える。次に、ドームを含むリポソームにマイクロピペットの先端を置きます。マイクロインジェクターを用いてリポソーム含有溶液を吸引する。
チャネル再構成リポソームの他のミコピーペットについても手順を繰り返します。今、浅い井戸の六角にマイクロピペットのを置きます。気泡が所望の大きさになるまで圧力を上げることで、ゆっくりと水泡を吹き、その後同じ圧力を維持します。
気泡の大きさを安定に保つのが難しい場合は、オイル空気界面を通してチップを通過して、泡を捨てます。2つの安定した気泡が形成されるまで手順を繰り返します。2 つの気泡の間に接触を確立します。
気泡の大きさを維持するために圧力を微調整し、一定の気泡内圧力でもサイズが徐々に変化する可能性があるため。パッチクレームアンプを使用して膜電位を適切な値に設定し、チャネル電流が出てくるのを待ちます。安定した脂質二重層形成のためには、ブロッターを洗浄することが不可欠である。
ガラスキャピラリーやピペットの調製は、十分に洗浄し、洗浄剤分子による汚染を避けるべきです。CBBが水溶液またはリポソームのいずれかでチャネル分子を形成すると、数〜数十分のスパン内で二重層に自発的に挿入された。チャネルの挿入は、適用された膜電位の下での現在の振幅のステップの賢明な増加によって確認された。
CBB法によって形成された二重層は、2つの単層に崩壊させることができる。pTBチャネル電流は、2つの単層を取り付けた直後に現れました。そして、接触が増加するにつれて電流が大きくなり、CBBのデタッチアタッチ操作と同期した電流の振幅が増加した。
気泡の吹き出量が多くなると水溶液中の脂質濃度が低下し、単層が形成されない。その後、リポソームセクションの圧力を緩和してみてください。CBBの形成とチャネルの再構成が確立されると、水溶液および膜の組成を、拡散または親水性または疎水性物質を注入することによって変化させることができます。
CBB法はチャネル膜インタープレイを探索する多目的な方法を開いた。
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概要
この研究では、脂質二重層を形成するコンタクトバブル二重層（CBB）法を紹介し、従来の技術に代わる革新的な選択肢を提供します。この方法は、多様な膜振動と高信号対雑音比のシングルチャンネル電流記録を可能にし、チャネル-膜相互作用の研究を強化します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 生物物理学
- 電気生理学
- 脂質膜技術
背景
- 脂質二重層は膜タンパク質の研究に不可欠です。
- 従来の方法には柔軟性と安定性の制限があります。
- CBB法は平面脂質二重層とパッチクランプ技術の利点を融合しています。
- この技術はイオンチャネル活性の高品質な記録を可能にします。
研究目的
- 接触バブルアプローチを用いた脂質二重層形成の堅牢な方法を開発すること。
- 改善された品質のシングルチャンネル記録を可能にすること。
- 膜ダイナミクスとチャネル-膜相互作用を探索すること。
使用された方法
- CBB法は、有機溶媒中での水バブルの制御された操作を利用して二重層を作り出します。
- リン脂質を準備し、ソニケーションして多層小胞を形成し、その後イオンチャネルタンパク質を組み込みます。
- 二重層形成中のバブルの正確な適用と安定化のためにマイクロピペットが製作されます。
- 実験セットアップには、二重層形成後のイオンチャネル電流をモニターするためのパッチクランプアンプが含まれます。
主な結果
- CBB法は、電流振幅の変化によって確認された、チャネルタンパク質を二重層に挿入することを効果的にサポートします。
- 安定な二重層が形成され、シングルチャンネル電流を記録する能力を実証しました。
- この方法は、バブルサイズの調整が膜の安定性と電流の連続性に影響を与えることを示しました。
結論
- CBB法は脂質二重層形成に大きな進歩をもたらし、電気生理学研究における多様な応用を可能にします。
- この革新的なアプローチは、チャネル-膜ダイナミクスの理解を強化します。
- 結果は、様々な実験条件に脂質二重層技術を適応させる可能性を強調しています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The Contact Bubble Bilayer (CBB) method addresses a key challenge in ion channel research by enabling high signal-to-noise ratio recordings while allowing precise control over lipid composition and membrane mechanics. This capability supports mechanistic de-risking of therapeutic targets by clarifying channel-membrane interactions under physiologically relevant conditions. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing a reproducible platform for functional validation of ion channel targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by studying ion channel function in defined lipid environments.
- Operational Value: Supports functional target validation through reproducible single-channel current measurements with low electrical noise.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by elucidating how lipid composition modulates channel activity and stability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated lipid bilayer systems for downstream compound screening by incorporating channel-reconstituted liposomes.
- Operational Value: Enables assay standardization via controlled bubble formation and consistent bilayer renewal.
- Scalability: Supports platform reuse through repeated CBB formation and disruption cycles.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains relevance from discovery through preclinical work by modeling disease-relevant lipid compositions.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of how membrane perturbations affect channel function, informing safety and efficacy predictions.
- Biomarker Alignment: Supports identification of lipid-dependent channel phenotypes that may correlate with clinical responses.
Pipeline & Workflow Integration
The CBB method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, providing a lipid-controllable platform for ion channel characterization prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled variation of membrane lipid composition.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible bilayer formation and stable ion channel incorporation.
- Analytics: Provides quantitative single-channel current readouts that allow comparison of channel behavior under different conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling study of channel-membrane interactions in disease-relevant lipid environments.
- Enterprise Reuse: Functions as a renewable capability rather than a single-use technique, supporting sustained use across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in channel-membrane interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through controlled bubble size maintenance and bilayer renewal.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable functional data on ion channel targets early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of ion channel programs based on validated membrane-dependent activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid handling, electrophysiology, and microfluidic manipulation.
- Depends on patch-clamp amplifiers, glass capillary pullers, and microinjectors for bubble formation and pressure control.
- Necessitates cross-team standardization of lipid preparation, bubble size control, and cleaning protocols.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different ion channel types or lipid mixtures.
- Includes practical limitations such as the need for meticulous bubble size maintenance and contamination avoidance during pipette preparation.
