Name: 蛋白質の浄化のため Poly(pentafluorophenyl acrylate) 機能 SiO2ビーズの準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 学ぼう、ポリペンタフルオロフェニルアクリレート機能化シリカビーズを用いた抗体固定化と免疫沈降によるタンパク質精製法。この技術は創薬や生体標的検出など幅広い応用が期待されます。

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1. Poly(PFPA) ホモポリマーの準備
<ol><li>AIBN の再結晶<ol>
<li>250 mL のビーカーにメタノール 25 ml 2,2'-azobis(2-methylpropionitrile) (AIBN) の 5 g を組み合わせます。60 ° C のオイルバスでビーカーに没頭し、精力的に AIBN は完全に溶解するまで攪拌棒との混合物をかき混ぜます。</li>
		<li>ろ紙 (5-8 μ m 粒子保持) を通じて暖かいソリューションをフィルター処理し、ゆっくりと結晶の形成を許可する 4 ° C で濾液を格納します。</li>
		<li>ろ過して再結晶 AIBN を収集します。新鮮なメタノール 25 mL で収集した製品を組み合わせるし、再結晶化プロセスを繰り返します。</li>
		<li>真空オーブン中室温 (RT) での再結晶 AIBN x 2 を一晩乾かします。<-10 ° C で暗闇の中で保管してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ベンジル dithiobenzoate25の合成<ol>
<li>電磁攪拌棒、還流凝縮器、滴下漏斗ゴムキャップと 500 mL 三首丸底フラスコを準備します。還流凝縮器を通じて窒素ガスラインにフラスコを接続、内部を洗い流す窒素と空気。中隔から温度計を挿入します。同じ隔壁を通して注射器テトラヒドロ フラン (THF) に臭化フェニル 1 M 溶液 41 mL (0.041 mol) を追加します。</li>
		<li>オイルバスで 40 ° C にフェニル臭化解決を暖めます。40 ° C で溶液の温度を維持すること、ゆっくりと滴下漏斗を通してカーボン二硫化物の 3.1 g (0.041 mol) を追加します。</li>
		<li>滴下漏斗以上 15 分 50 ° c. に反応温度の増加を通じて得られた混合物に臭化ベンジルの 7.1 g (0.042 mol) を追加します。45 分間この温度で攪拌を続けます。</li>
		<li>漏斗に反応混合物を転送し、15 mL の氷冷水で希釈します。ジエチル エーテル 15 mL を追加することによって、製品を抽出し、下の水層を除去します。ジエチル エーテルで抽出、さらに 2 回を繰り返します。</li>
		<li>水とし、かん水 (50% (w/v) 水に塩化ナトリウム溶液) のおびただしい量の合わせた有機相を洗浄し、無水硫酸マグネシウム上製品の乾燥します。</li>
		<li>35 ° c 回転蒸発器を用いて真空溶媒を削除します。</li>
		<li>赤色の油としてベンジル dithiobenzoate (BDB) の 5 グラム、溶離液としてシリカゲル (細孔径 60 Å、63 200 メッシュ パーティクル サイズ) 400 mL、石油エーテルを用いたクロマトグラフィーによって製品を浄化します。1H NMR (400 MHz、CDCl3) 製品純度を確認: δ 8.02 7.99 (2 H, m) 7.55 7.50 (1 H, m)、7.41 7.29 (7 H、m) 4.60 (2 H, s)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>ラフト重合9,26を介して poly(PFPA) の合成<ol>
<li>市販 PFPA モノマーには、阻害剤の少量が含まれています。重合前にモノマーを塩基性アルミナ満載使い捨て注射器に通すことによって阻害剤を削除します。</li>
		<li>20 mL Schlenk フラスコに無水アニソールの 0.7 mL、1012 mg (4.25 モル) 阻害剤無料 PFPA、BDB の再結晶 AIBN、4.3 mg (0.018 ミリ モル) の 0.4 mg (0.0024 mmol) を追加します。</li>
		<li>シュレンク管にフラスコを接続し、ドガの少なくとも 3 つ凍結ポンプ融解との混合物。簡単に言えば、液体窒素風呂で反応混合物を凍結します。ヘッド スペースにガスを除去するために真空を適用します。フラスコを密封し、室温解凍するコンテンツを許可する液体窒素から削除</li>
		<li>70 ° C のオイルバスにフラスコを置き、N2パージの下で 4 h の反応します。</li>
		<li>反応を終了、油浴からフラスコを削除し、空気に反応内容を公開します。</li>
		<li>冷メタノール中でポリマーを沈殿し、40 ° C で真空オーブンで回復したポリマーを一晩乾燥します。</li>
		<li>ポリマーの分子量を測定するには、ゲル浸透クロマトグラフィー (GPC) を使用します。1 mL/min と 35 ° C で移動相流量し、単分散ポリスチレン標準を使用して検量線の作成は、THF を使用します。GPC 測定を取得するには、0.2 μ m 使い捨てポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) フィルターを通じて THF (1-2 mg/mL) とフィルターでポリマーを溶解します。GPC 装置に 100 μ L のサンプルを挿入します。測定サンプルの保持時間を分子量ポリスチレンの検量線を使用してに変換します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Poly(PFPA) の準備機能 SiO2ビーズ
<ol><li>APTES SiO2ビーズの治療<ol>
<li>5% (w/v) 水性懸濁液の形では、SiO2粒子があります。APTES と 8 mL のメタノール シンチレーションの 20 mL バイアル攪拌棒装備で 40 mg と SiO2懸濁液 0.8 mL を組み合わせます。</li>
		<li>激しく攪拌しながら 5 h の RT で続行する反応を許可します。</li>
		<li>円錐管にソリューションを転送します。APTES を分離する SiO2ビーズを官能基化、5 分間、10,000 × g で遠心分離し、上澄みを除去します。3 mL の新鮮なメタノールでそれらを再分散することで、ビーズを洗浄します。混合チューブを手で振るが、必要に応じて、数秒間水お風呂で超音波処理による分散を改善します。遠心 10,000 × g で 5 分間削除でビーズ上清および洗浄ステップをあと 1 回繰り返します。</li>
		<li>ジメチルスルホキシド (DMSO) 3 mL と SiO2ビーズを洗浄メタノールを組み合わせます。混合物を手で振るかビーズが DMSO で完全に分散するまで、数秒の超音波照射必要です。ビーズ 5 分間、10,000 × g で遠心分離し、上澄みを除去します。DMSO にメタノールから完全な溶媒交換を確保するための手順を繰り返します。 メモ: 最終的な懸濁液に含まれる官能基化 APTES 4 ml の DMSO の SiO2ビーズ分散します。</li>
		<li>粒度分布を調べるには、DLS の分析を実行します。使い捨て UV キュベットにステップ 2.1.4 および場所の準備懸濁液の一滴を取る。2/3 まで、新鮮な dmso キュヴェットに記入サンプルを希釈による。サンプルをデータ集録を開始する電池ホルダーに挿入します。粒度測定、次のセットアップ パラメーターを使用して: 気温: 25 ° C平衡の時間: 120 s;測定時間: 自動。</li>
		<li>表面の組成を確認するには、XPS 分析を実行します。一晩 2.1.4 真空オーブンで 40 ° C の手順で作製した懸濁液からの小さいサンプルを乾燥させます。乾燥ポリマーと 0.5 × 0.5 cm の試料ホルダーに均等にパックを取る。高真空 (10-8 torr) にサンプルをロードし、データ集録を開始します。特定の XPS の楽器使用、生成 15 で単色アル α x 線を用いた光電子 kV と 6.7 mA、および収集 50 eV でアナライザーでハイブリッド モードの倍率を使用して高分解能スペクトルのエネルギーを渡すし、100 eV はエネルギーを渡す元素の調査。</li>
	</ol>
</li>
	<li>APTES に poly(PFPA) を移植、SiO2ビーズを官能基化<ol>
<li>Poly(PFPA) ソリューションを準備するには、シンチレーション バイアル 20 mL の DMSO の 2 mL で poly(PFPA) の 20 mg を溶解します。 メモ: この研究では、比較的低分子量 poly(PFPA) (20 kg/mol) が使用されます。したがって、にもかかわらず、高分子濃度 (10 mg/mL)、高分子架橋の証拠は認められなかった。高分子量ポリマーを使用すると、ポリマー溶液濃度が可能な架橋結合を避けるために調整する必要があります。</li>
		<li>APTES の 1 mL は SiO2ビーズ poly(PFPA) ソリューションに (からステップ 2.1.4) DMSO で中断機能の集積化を追加します。激しく攪拌しながら 1 時間室温で反応します。</li>
		<li>5 分、上澄みの除去が続く 10,000 × g で遠心分離によって接木 poly(PFPA) SiO2ビーズを分離します。どちらかの手や超音波処理の数秒間揺れによって DMSO とミックスの 3 mL を加えることによってビーズを洗浄します。ビーズ 5 分間、10,000 × g で遠心分離し、上澄みを除去します。DMSO と接木 poly(PFPA) SiO2ビーズの 2 回洗濯を繰り返します。</li>
		<li>トリプル蒸留水 (TDW) の 2 倍以上のビーズを洗浄します。この手順ではインスタレーション、3 mL でビーズを組み合わせるし、手や超音波照射の数秒の揺れでミックスします。ビーズ 5 分間、10,000 × g で遠心分離し、上澄みを除去します。</li>
		<li>粒度分布を調べるには、DLS 2.1.5 の手順で説明されている手順を次を実行します。表面化学を確認するには、XPS 2.1.6 のステップで説明されている手順を実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. SiO2の準備ペグ-置換 Poly(PFPA) をグラフトしたビーズ
<ol><li>Poly(PFPA) ソリューションを準備するには、poly(PFPA) DMSO 20 mL シンチレーション バイアル 2 mL に 20 mg を溶解します。</li>
	<li>止め釘の解決を準備するには、1 ml の DMSO のアミン官能基化 PEG を溶解します。ペグの正確な量を使用は、PFP 置換では、以下の式によって決定の所望の程度によって決まります。 ペグ アミノ酸量 (g/g-poly(PFPA)) = (N_poly(PFPA) x %peg サブ) x (MW_PEG/MW_poly(PFPA)) どこ N_poly(PFPA) = poly(PFPA) 重合度 %Peg サブ = %peg 置換 MW_PEG アミノ peg 分子量を = MW_ poly(PFPA) = poly(PFPA) の分子量</li>
	<li>Poly(PFPA) ソリューションに止め釘の解決を転送します。激しく攪拌しながら 1 時間室温で反応します。</li>
	<li>APTES を準備する機能 SiO2ビーズ DMSO で中断、同じステップ 2.1 に示されている手順に従ってください。ステップ 3.3 で、ペグ-置換 poly(PFPA) 溶液にビーズ懸濁液の 1 mL を移します。Poly(PFPA) と APTES の間の接木を激しく攪拌しながら 1 時間常温続行 SiO2ビーズ官能基化を許可します。</li>
	<li>5 分、上澄みの除去が続く 10,000 × g で遠心分離によってビーズを分離します。どちらかの手や超音波処理の数秒間揺れによって DMSO とミックスの 3 mL を加えることによってビーズを洗浄します。ビーズ 5 分間、10,000 × g で遠心分離し、上澄みを除去します。DMSO 洗浄を 2 回繰り返します。</li>
	<li>TDW で 2 倍以上のビーズを洗浄します。この手順で 3 ml のインスタレーション、ビーズを組み合わせるし、手や超音波照射の数秒の揺れでミックスします。ビーズ 5 分間、10,000 × g で遠心分離し、上澄みを除去します。</li>
	<li>真空オーブンで 40 ° C でビーズを一晩乾かします。</li>
</ol>4. 抗体固定化 Poly(PFPA) の接ぎ木 SiO2ビーズ
注: 同じ手順は、poly(PFPA) %peg 置換に関係なく用いられます。TDW で PBS タブレットを溶解することにより、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を準備します。0.1% (v/v) リン酸緩衝生理食塩水でトゥイーン 20 (pbst;) を準備するには、PBS に Tween 20 1/1000 を追加します。
<ol><li>Poly(PFPA) の 5 mg 接木 1.5 mL 遠心チューブに SiO2ビーズを追加します。</li>
	<li>ボルテックスでよく 800 μ L の PBS とミックスを追加することによって、ビーズを洗浄します。上清 1 分削除の RT で 10,000 x g でビーズを遠心し、洗浄手順を 3 回繰り返します。</li>
	<li>新鮮な PBS、50 μ L 0.1% (v/v) PBST、抗体の 6.67 μ ・ 350 μ L を追加します。4 ° C でローテーター上 ~ 20 h を孵化させなさい</li>
	<li>非連結の抗体を削除するためにビーズを洗浄します。400 x g でビーズを遠心し、4 ° C で 1 分間上澄みを除去し、慎重に換散バッファーの 400 μ L を追加します。優しく上下に 5 回のピペッティングによる再ビーズを中断します。 注: 換散バッファー、ビーズを洗浄するために使用される必要がありますセル換散および IP、使用されるものと同じ除いてジチオトレイトールとプロテアーゼ阻害剤の添加は省略可能、(ステップ 5 を参照してください)。</li>
	<li>このステップを 3 回繰り返します。最終的な洗浄の後可能な限り、上清を削除します。</li>
</ol>5. 細胞換散および免疫沈降
<ol><li>換散バッファーおよび洗浄バッファーの準備<ol>
<li>換散バッファー (50 mM トリス-HCl (pH 8.0)、100 mM KCl、0.5% (v/v) NP 40、10% (v/v) グリセロール、カクテルの 1 mM ジチオトレイトール (DTT)、プロテアーゼ阻害剤) を準備します。</li>
		<li>洗浄バッファー (50 mM トリス塩酸 (pH 8.0)、100 mM KCl、0.1% (v/v) NP-40、および 10% (v/v) グリセロール) を準備します。</li>
		<li>4 ° C で緩衝溶液を保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>セルの作製<ol>
<li>シードの細胞 (HeLa 細胞) IP 実験の前に 1 つまたは 2 日間、37 ° C、5% CO2で細胞を成長します。</li>
		<li>15 mL の円錐管に約 1.4 × 107細胞細胞スクレーパーと転送を収集します。遠心 380 x g の RT で 3 分で細胞の上澄みを除去し、再 1 ml の PBS 寒くて 1.5 mL 遠心チューブに転送を中断します。</li>
		<li>30 s. 削除きれいに上清の 4 ° C で 10,000 x g で細胞を遠心分離機します。細胞ペレットは、上清を除去後-80 ° C で保存できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>セル lysates の準備<ol>
<li>換散バッファーの 400 μ L で細胞ペレットを再停止します。Ultrasonicator を用いた細胞を超音波照射します。</li>
		<li>超音波、渦を簡潔に、遠心分離機ライセート 4 ° C で 20,000 × g で 10 分後。</li>
		<li>上清を新しい 1.5 mL 遠心チューブに転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>免疫沈降<ol>
<li>事前に準備された抗体培養移植 poly(PFPA) SiO2ビーズに細胞ライセートの 300 μ L を転送します。細胞の新しい微量遠心チューブに入力サンプルとしてライセートの 30 μ L を保持します。4 ° C で入力のサンプルを保存します。 注: 細胞ライセート中のタンパク質の総量は約 4 mg をする必要があります。</li>
		<li>4 ° C で回転子に 3 h ライセート/ビーズ混合物を孵化させなさい</li>
		<li>4 ° c で 1 分間削除 400 x g で混合物の上澄みを遠心し、慎重に洗浄バッファーの 400 μ L を追加します。軽くピペッティングを上下約 5 倍で再ビーズを中断します。</li>
		<li>このステップを 3 回繰り返します。最終的な洗浄の後可能な限り、上清を削除します。</li>
		<li>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) ローディングの染料 (25% (v/v) グリセロール、0.1% (w/v) ブロモ フェノール ブルー (BPB) 60 mM トリス-HCl (Ph6.8) 2% (w/v) SDS と 2.75 mM 2-メルカプトエタノール) x 2 を準備します。ストア 2 × SDS 読み込み染料-20 ° C でビーズとストアドの入力サンプルの 2 × SDS ローディングの染料の 30 μ L を追加し、95 ° C で 10 分間加熱します。</li>
		<li>加熱した後、27ウエスタンブロットを使用してサンプルを分析したり、-20 ° C でサンプルを格納</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+fabrication+of+microsphere-polymer+brush+hierarchically+three-dimensional+%283D%29+substrates+for+immunoassays%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Facile fabrication of microsphere-polymer brush hierarchically three-dimensional (3D) substrates for immunoassays.</a> Chemical Communications. 51 (31), 6749-6752 (2015).</li>
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</ol>

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Poly(PFPA) の合成は接ぎ木 SiO2ビーズは図 1に示します。リンカー分子として APTES を採用し、単純な 2 段階のプロセスを介して SiO2基板に移植した poly(PFPA) ブラシを用意できます。PFP の単位のいくつかが APTES との反応を犠牲に、多数の PFP ユニットがアミノ ペグまたは抗体のいずれかで後の反応に利用可能なままと予想します。PFP グループは、poly(PFPA) ブラシが水28でよくない溶媒和化合物をように低エネルギー表面を形成するため知られています。IP アプリケーションの抗体は、poly(PFPA) ブラシに固定する必要があります、この交換反応は、抗体の活性を維持するために緩衝水溶液で行われます。私たちの前の出版物で報告された部分置換アミン官能基化など親水性分子と PFP 単位の増加抗体固定化効率18につながる表面の親水性を向上できます。本研究では部分的にペグ置換 poly(PFPA) ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58843/preparation-poly-pentafluorophenyl-acrylate-functionalized-sio2-beads">Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification</a>.&#160; Throughout the article, the term &#34;3-aminopropyltriethoxysilane&#34; has been replaced with &#34;3-aminopropyltrimethoxysilane&#34;, and &#34;APTES&#34; with &#34;APTMS&#34;.

Erratum: Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

反応性ポリマー ブラシは、近年多くの関心を受けています。検出と分離1,2,3,4などの分野でのアプリケーションと非アクティブなサーフェスを作成する有機又は無機の物質に機能分子を固定化する使用することができます。 5。報告された反応性高分子の中でペンタフルオロフェニル エステル単位を含む、アミンと加水分解6に向けて耐反応性が高いため特に便利です。1 つのようなポリマーは poly(PFPA) と、それはプライマリまたはセカンダリのアミン7,8,9,10を含む分子と容易に官能の後重合をすることができます。1 つの例で、poly(PFPA) ブラシした光応答性表面7を作成するアミノ スピロピランと反応しました。
Poly(PFPA) とその応用の準備は前出版物6,7,8,9,10、11,12 の番号に記載されています。 ,13,14,15,16,17。特に、Theato と同僚は報告「移植」と""方法7,8,10、11,12から移植の両方を介して poly(PFPA) ブラシの合成.「接木する」アプローチは、ポリ (メチルシルセスキオキサン) の-ポリ (アクリル酸ペンタフルオロフェニル) (poly(MSSQ-PFPA)) ハイブリッド ・ ポリマーは合成8,10、11,12。Poly(MSSQ) コンポーネントはフォーム数材料表面上ブラシ層を形成するコンポーネントの poly(PFPA) をように別の有機・無機表面と密着できた。「接木から」アプローチ、表面は可逆的付加を開始され、断片化チェーン転送 (SI ・ ラフト) 重合を用いて poly(PFPA) ブラシ7を準備します。この場合、表面固定化連鎖移動剤 (SI CTA) 最初共有についたシリカ シラン反応による基板。固定化 SI CTA は、基板に安定した共有結合のリンケージを持つ密集 poly(PFPA) ブラシを生成する PFPA モノマーの SI ・ ラフト重合し参加しました。
SI ・ ラフト重合により合成した poly(PFPA) ブラシを活用し、最近移植 poly(PFPA) シリカ粒子やタンパク質精製18で、後続のアプリケーションにおける抗体の固定化を示した。IP で現在の蛋白質の分離に関連する問題の数を解決する抗体固定化のための poly(PFPA) ブラシの使用が見つかりました。従来の IP は、抗体固定化19,20,21のタンパク質 A/G リンカーとしての使用に依存します。タンパク質 A/G の特定の方向で接続する抗体を使用、高いターゲット抗原回復効率が達成されました。ただし、タンパク質 A/G の使用苦しんでいる抗体の損失と同様、非特異的タンパク質間相互作用タンパク質の回収、どちらもはバック グラウンド ノイズの高レベルに貢献中。これらの欠点を解決するには、しっかりサポートする抗体の直接架橋検討22,23,24をされています。このような技術の効率は架橋抗体のランダムな向きがあるため通常は低くなります。接木 poly(PFPA) 基板の抗体の固定化は永久、PFP ユニットと抗体のアミン機能間の交換反応によって達成されます。抗体の向きはまだランダムが、システム多く反応 PFP サイト、重合度によって制御を持っていることから寄与します。さらに、我々 はアミノ止め釘と PFP 単位の部分的な置換によることを示した表面親水性調整できるさらにシステム18のタンパク質回収効率を向上します。全体的にみて、多くのクリーナーの背景と同様、合理的な効率で従来の IP へ有効な代わりをする接木 poly(PFPA) シリカ粒子が示されていた。
この貢献抗体固定化と IP アプリケーションを poly(PFPA) グラフト表面を準備する方法を報告する.単純な 2 段階のプロセスで図 1に示すように、APTES のリンカー分子最初に到着したシリカ表面にし、poly(PFPA) 高分子に PFP ユニット間反応によってリンカー分子に接続した、ポリマーと APTES のアミン機能。本調製法は基板表面に poly(PFPA) の永久的な架橋が可能が SI CTA 合成と poly(PFPA) ブラシの SI ・ ラフト重合に関連する多くの合併症を回避します。アミノ ペグの PFP ユニットの部分置換実行できますが、ポリマー ブラシ表面特性の微調整可能します。従って準備 poly(PFPA) 接木シリカビーズを抗体を固定化して IP を介したタンパク質の濃縮に使用できますを示します。詳細なビード作製手順、抗体固定化と IP テストは、この資料に記載されて、読者を求めて興味従来タンパク質 A/G に代わるベースの IP。

<table><tbody><tr><td>2,2-アゾビシソブチロニトリル、99%</td><td>大中化学品</td><td>1102-4405</td><td></td></tr><tr><td>HPLC用メチルアルコール、99.9%</td><td>デュクサン純薬品</td><td>d62</td><td></td></tr><tr><td>フェニルマグネシウム臭化物溶液 1.0&nbsp;THF</td><td>のM Sigma-Aldrich</td><td>331376</td><td></td></tr><tr><td>二硫化炭素無水物、&ge;99%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>335266</td><td></td></tr><tr><td>臭化ベンジル、98%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B17905</td><td></td></tr><tr><td>石油エーテル、90%</td><td>Samchun Chemicals</td><td>P0220</td><td></td></tr><tr><td>エチルエーテル、99%</td><td>Daejung Chemicals</td><td>4025-4404</td><td></td></tr>無<tr><td>水硫酸マグネシウム、粉末、&nbsp;99%</td><td>Daejung Chemicals</td><td>5514-4405</td><td></td></tr><tr><td>Pentafluorophenyl acrylate</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-264001</td><td>contains inhibitor</td></tr><tr><td>酸化アルミニウム、活性化、塩基性、Brockmann I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199443</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>Daejung Chemicals</td><td>7548-4400</td><td></td></tr><tr><td>Anisole anhydrous, 99.7%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296295</td><td></td></tr><tr><td>シリカナノ粒子</td><td>Microparticles GmbH</td><td>SiO2-R-0.7</td><td>5%w / v水性懸濁液</td></tr><tr><td>3-アミノプロピルトリメトキシシラン、>96.0%</td><td>東京化学工業</td><td>T1255HPLC</td><td></td></tr><tr><td>用ジメチルスルホキシド、&ge;99.7%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34869</td><td></td></tr><tr><td>アミノ末端ポリ(エチレングリコール)メチルエーテル</td><td>ポリマーソース</td><td>P16082-EGOCH3NH2</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水錠</td><td>タカラ</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Calbiochem</td><td>9480</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (pH 8.0)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td></td><td></td><td></td>AM9640G</tr><tr><td>NP-40</td><td>VWR</td><td>E109-50ML</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール</td><td>Biosesang</td><td>D1037</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤</td><td>メルク</td><td>535140-1MLCN</td><td></td></tr><tr><td>ブロモフェノールブルー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5525-5G</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (pH 6.8)</td><td>バイオソリューション</td><td>BT033</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムのドデシルの硫酸</td>塩<td>Biosolution</td><td>BS003</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>PKR抗体</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>12297S</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH抗体</td><td>サンタクルス</td><td>バイオテクノロジーsc-32233</td><td></td></tr><tr><td>正常なウサギIgG</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>2729S</td><td></td></tr><tr><td>HeLa</td><td>韓国細胞株バンク</td><td>10002</td><td></td></tr><tr><td>ソニケーター</td><td>ダイハンサイエンティフィック</td><td>WUC-D10H</td><td></td></tr><tr><td>超音波装置</td><td>BMBio</td><td>BR2006A</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機I</td><td>エッペンドルフ</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機II</td><td>ラボジーン</td><td>1736R</td><td></td></tr><tr><td>ローテ</td><td>ーターFINEPCR</td><td>ローテーター/ ag</td><td></td></tr><tr><td>真空オーブン</td><td>ダイハンScientific</td><td>ThermoStable OV-30</td><td></td></tr><tr><td>ゲル浸透クロマトグラフィー(THF)</td><td>Agilent Technologies</td><td>1260 Infinity II</td><td></td></tr><tr><td>X線光電子分光計</td><td>Thermo VG Scientific</td><td>Sigma Probe</td><td></td></tr><tr><td>動的光散乱</td><td>Malvern Instruments</td><td>ZEN 3690</td><td></td></tr></tbody></table>

蛋白質の浄化のため poly(pentafluorophenyl acrylate) 機能 sio2ビーズの準備

Preparation of Poly(pentafluorophenyl acrylate) Functionalized SiO2 Beads for Protein Purification

ポリ (アクリル酸ペンタフルオロフェニル) を準備する簡単な方法を示す (poly(PFPA)) は、抗体の固定化とそれに続く免疫沈降 (IP) アプリケーションのシリカビーズを移植しました。Poly(PFPA) グラフト表面は、単純な 2 段階のプロセスを介して用意しています。最初のステップで 3-アミノプロピルトリエトキシシラン (APTES) は、シリカ表面にリンカー分子として預けられます。2 番目のステップでペンタフルオロフェニル (PFP) 単位間の交換反応によってリンカー分子に可逆的付加と断片化チェーン転送 (いかだ) 重合により合成した poly(PFPA) ホモポリマーを移植で、ポリマーと APTES のアミン グループ。APTES とシリカ粒子は x 線光電子分光法 (XPS) により確認し同様、粒子サイズの変更によって監視 poly(PFPA) の沈着は、動的光散乱 (DLS) を介して測定。ビーズ、アミン官能基化 poly(ethylene glycol) と poly(PFPA) の一部代替の表面の親水性を向上させる (アミノ PEG) が行われます。ペグ-置換 poly(PFPA) は、ビーズが IP アプリケーションのための抗体を固定化し、シリカを移植しました。デモで、タンパク質キナーゼ (PKR) rna 抗体を採用、IP 効率は西部にしみが付くことによって決定されます。分析の結果, 抗体固定化ビーズを無指定蛋白質の相互作用は最小限、PKR を豊かに使用確かにできます。

Poly(PFPA) の準備のための回路図と SiO2ビーズおよびペグなし置換は図 1に示します。APTES と poly(PFPA) プロセス、裸の SiO2ビーズを移植を監視する APTES 機能 SiO2ビーズと poly(PFPA) 接木 SiO2ビーズは DLS (図 2) と XPS (図 3) によって特徴付けられます。ビーズの IP 効率は西部にしみが付くことによって決定されます。ない抗体、非特異抗体または抗 PKR 抗体ビーズをインキュベートする場所 1% グラフトしたペグ-置換 poly(PFPA) ビーズを使用して IP のウエスタンブロットの結果を図 4に示します。0 %peg-置換 poly(PFPA) 接木ビーズと接ぎ木 ...

ポリ (アクリル酸ペンタフルオロフェニル) の準備のためのプロトコル (poly(PFPA)) 接木シリカビーズを提示。Poly(PFPA) 機能性表面は抗体を固定化し、正常に免疫沈降法による蛋白質の分離のために使用します。

蛋白質の浄化のため Poly(pentafluorophenyl acrylate) 機能 SiO2ビーズの準備

We demonstrate a simple method to prepare poly(pentafluorophenyl acrylate) (poly(PFPA)) grafted silica beads for antibody immobilization and subsequent ...

この方法は、薬物送達、生物学的標的検出、および生体分離などの分野での用途を有する生体分子活性化表面を調製するために使用することができる。この技術の主な利点は、ポリPFPAブラシがアミンと反応性が高く、抗体の固定化が数時間のバッファー溶液中のインキュベーションによって達成される点である。この技術の意味は、固定化抗体が標的抗原と正常に結合することができるため、免疫精製を通じてタンパク質精製に向けて広がっています。この方法は抗体の動員とタンパク質精製のために実証されるが、生体分子動員を必要とする他のシステムにも適用することができる。二酸化ケイ素ビーズをAPTESで処理するために、まず5%重量体積水性懸濁液の形で二酸化ケイ素粒子を得る。0.8ミリリットルの二酸化ケイ素懸濁液を40ミリグラムのAPTESと組み合わせ、8ミリリットルのメタノールを20ミリリットルのシンチレーションバイアルに組み合わせます。激しい攪拌を行い、室温で5時間反応を進行させます。5時間後、溶液を円錐管に移します。APTESの機能性シリコーン二酸化ビーズを分離するために、溶液を10,000 Gで5分間遠心分離する。その後、上清を取り除く。今、新鮮なメタノールの3ミリリットルでそれらをやりくりすることによってビーズを洗います。混合するために手でチューブを振るが、必要に応じて、数秒間水浴中の超音波処理によって分散を改善します。前と同様に遠心分離機、洗浄工程をもう一度繰り返す。メタノール洗浄二酸化シリコーンビーズと3ミリリットルのジメチルスルホキシド(DMSO)を組み合わせます。混合物を手で振るか、必要に応じて、ビーズがDMSOに完全に分散するまで数秒間超音波処理します。前に遠心分離に続いて、上清を取り除く。メタノールからDMSOへの完全な溶媒交換を確実にするために、最後の時間に遠心分離ステップを繰り返します。ポリPFPA溶液を調製するために、20ミリリットルのシンチレーションバイアルで2ミリリットルのDMSOにポリPFPAの20ミリグラムを溶解する。PEG溶液を調製するために、アミン機能化PEGをDMSOの1ミリリットルに溶解する。次に、PEG 溶液をポリ PFPA 溶液に転送します。激しい攪拌で室温で1時間反応させます。DMSOに懸濁したAPTESの機能性二酸化ケイ素ビーズをPEG置換ポリPFPA溶液に1ミリリットル移動します。ポリPFPAとAPTESの機能性二酸化ケイ素ビーズの間のグラフトを、激しい攪拌で室温で1時間進めます。その後、10,000Gで10,000Gで遠心分離してビーズを5分間分離し、続いて上清を除去する。DMSOの3ミリリットルを加えてビーズを洗い、手で、または数秒の超音波処理で混ぜます。以前のようにビーズを遠心分離します。そして、DMSO洗浄を2回繰り返す前に上清を取り除きます。3ミリリットルの三重蒸留水でさらにビーズを洗います。その後、手で、または超音波処理の数秒でミックス。前のようにビーズを遠心分離し、上清を取り除きます。最後に、一晩真空オーブンで40°Cでビーズを乾燥させます。1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにポリPFPA接ぎ木二酸化ケイ素ビーズを5ミリグラム加えます。800マイクロリットルのPBSを加えてビーズを洗い、渦をよく混ぜます。室温で10,000Gでビーズを1分間遠心する。上清を取り出し、洗浄工程を3回繰り返します。次に、新鮮なPBSの350マイクロリットル、0.1%PBSTの50マイクロリットル、および抗体の6.67マイクログラムを追加します。摂氏4度で回転器に約20時間インキュベートします。翌日、ビーズと遠心分離機を400Gと摂氏4度で1分間洗います。その後、上清を取り除き、慎重に400マイクロリットルのライシスバッファーを追加します。ビーズを上下に5回ピペットしてそっと再中断します。この洗浄を3回繰り返します。最後の洗浄後、できるだけ多くの上清を取り除きます。テキストプロトコルに記載されているように、細胞およびリシスバッファーを準備します。次に、細胞ペレットを400マイクロリットルのリシスバッファーで再懸濁する。超超音波処理器を使用して細胞を超音波処理します。超音波処理の後、簡単に渦。その後、摂氏4度で20,000Gのリセートを10分間遠心分離する。上清を新しい1.5ミリリットルの遠心管に移します。免疫沈降を行うために、300マイクロリットルの細胞ライセートを、あらかじめ調製したポリPFPA移植二酸化ケイ素ビーズを固定化した抗体に移す。30マイクロリットルの細胞ライセートを入力サンプルとして新しいマイクロ遠心分離チューブに保持します。リゼートビーズ混合物を摂氏4度で回転器で3時間インキュベートします。インキュベーションに続き、400Gで1分間摂氏4度で遠心分離する。上清を取り除き、400マイクロリットルの洗浄バッファーを慎重に加えます。ビーズを上下に約5回ピペットして静かに再中断します。3回の打ち上がりの後、できるだけ多くの上清を取り除く。ビーズと入力サンプルに2x SDS負荷染料の30マイクロリットルを追加します。その後、摂氏95度で10分間加熱します。加熱後、ウェスタンブロッティングを使用してサンプルを分析するか、マイナス20°Cで保存します。機能化されたシリカビーズをX線光電子分光法(XPS)で調べ、表面組成を決定する。代表的な XPS データをここに示します。APTES処理後、アミン群領域APTESに関連する窒素1sピークが検出される。ポリPFPA処理の後、ポリマー上のPFP単位に関連するフッ素1sピークが検出される。タンパク質キナーゼRNA活性化、または免疫沈降によるPKR濃縮が行われ、ウェスタンブロッティングを用いて抽出したタンパク質サンプルを分析する。予想通り、抗体を使用しないビーズ、または非特異的抗体混合法はPKR回復を示さない。アンチPKRでインキュベートされたビーズは、PKRバンドの存在とGAPDHバンドの不在によって示されるようにPKRをうまく濃縮することができます。この手順を試みる際には、システムを比較する際には、IP実験とそれに続くウェスタンブロッティング解析を同時に行う必要があることを覚えておくことが重要です。その開発後、この技術は、異なる生体分子または材料基質の固定化に使用することができる。さらに、この方法には、各アプリケーションのニーズに合わせて調整されるサーフェスプロパティのみを調整するという追加の利点があります。

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Chemistry

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