Name: ウイルス感染とキイロショウジョウバエのホスト ウイルスの相互作用の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: 学ぶ Drosophila melanogasterにおけるウイルス感染のナノインジェクション法とウイルス・宿主相互作用の解析手法。この方法は、感染動態の研究や治療戦略の開発に貢献します。

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IPS で全体のパン研究室に感謝したいと思います。CAS。コメントの博士ハンセン朱 (IPS、パリ) 博士ジェシカ ・ バルガス (IPS、パリ) と博士 Gonalo コルドバ スティーガー (スプリンガー自然) 実験支援博士ランコウ王 (IPS, CA) をありがちましょう。この作品は、中国科学アカデミーの戦略的な重点研究課題からを結んだ (XDA13010500) と同 H.T (XDB29030300)、結んだ (31870887 と 31570897) と同し J.Y (31670909) 中国の国家自然科学基金助成金によって支えられました。結んだと同 CA 青年革新推進協議会 (2012083) のフェローであります。

著者が明らかに何もありません。

この記事で詳細な手順で紹介アダルトキイロショウジョウバエでウイルス感染システムを確立する方法ナノ注射を使用します。プロトコルには、適切なフライラインとウイルスの株式市場、感染手法、感染の指標の評価と抗ウイルス応答の測定の準備が含まれます。DCV ウイルス性病原体の例として使用されますが、ウイルスの種類の数十はショウジョウバエ システムの研究のため正常に適用されています。さらに、規制の要因は、ウイルスまたはホストのどちらかの数百はハエの大規模スクリーニングを介して識別されています。したがって、このメソッドは、適応性の高いは、DCV に限らず/ショウジョウバエの相互作用。
正常に伝達し高価 DCV の収穫は、いくつかの対策が取られなければなりません。適当な密度で培養、時間に収穫、細胞は健康なはずです。細胞培養のボリュームを減らすことは、ウイルス抗体価に大きな影響を与えません。通常、MOI で DCV に感染して 10 の7セル = 0.01 は最終的に降伏、おおよそ 108-109 T...

特に、チクングニア ウイルス1などのアルボ ウイルスによるウイルス感染を新興デング熱ウイルス、黄熱ウイルス2とジカウイルス3がパンデミックを引き起こすことによって国民の健康に大きな脅威をされています。4します。 したがって、流行の制御と人間のウイルス性疾患の治療のためにますます重要なっているウイルスとの相互作用の理解を深める。この目標のためウイルス感染のメカニズムを調査するより適切かつ効率的なモデルを確立されなければなりません。
ショウジョウバエ、キイロショウジョウバエ (キイロショウジョウバエ)、ウイルス-宿主相互作用5,6を調査するための強力なシステムを提供し、人間のウイルス性疾患7を勉強する最も効率的なモデルの一つであると証明しました。,8,9します。 シグナル伝達経路と比類のない遺伝的ツールを作る非常に節約された抗ウイルス剤ハエ人間抗ウイルス研究にとって重要な意味を持つ重要な結果を生成する素晴らしいモデル。さらに、ハエ簡単で安価な実験室で維持するために、感染時に新規調節因子6,10ウイルスのホストの大規模スクリーニングに最適。
4 つの非常に節約された抗ウイルス経路 (e.g、RNA 干渉 (RNAi) 経路11、JAK-STAT 経路12、NF-κ b の経路、オートファジー経路13) 最近ではショウジョウバエの十分に研究。年6。RNAi の経路は、ウイルス感染症6,14のほとんどの種類を抑制することができます広範な抗ウイルス機構です。ダイサー 2 (Dcr-2)やアルゴノート 2 (AGO2)のような遺伝子の突然変異によって、この経路の障害は、大量のウイルス力価およびホスト死亡15,16,17につながります。JAK-STAT 経路はDicistroviridae家族と昆虫、例えばフラビ家族からウイルスによって感染の制御に関与している、ハエ16および西ナイル ウイルス (WNV) におけるショウジョウバエ C ウイルス (DCV)。蚊18,19のデング熱ウイルス。ショウジョウバエの通行料 (人間の NF-κ B の経路に相同性) と免疫不全 (IMD) 経路 (人間 NF-κ B と TNF 経路に類似) はウイルスの侵略20,21,を守るために関与して22. オートファジーはショウジョウバエ23,24のよく特徴付けられるウイルス感染の制御に関わる別の節約されたメカニズム。したがって、これらの経路と解離性クロストークこれら抗ウイルス シグナル伝達とその他の新規調節因子の同定ショウジョウバエの代謝、老化、神経反応などの生物学的経路が簡単に設定することができますシステム。
ショウジョウバエで最もよく確立されたウイルス感染モデルは RNA ウイルス、無脊椎動物の虹色ウイルス 6I による感染によって引き起こされるが (4-6) カリテア ウイルス飛んで25、DNA ウイルスの研究の可能性を示していると 26。さらに、ウイルスは、ショウジョウバエの遺伝学9インフルエンザ ウイルスなどの感染を許可するように変更もできます。これはショウジョウバエスクリーニング プラットフォームのアプリケーションを大きく拡げた。この手順では、DCV の使用例としてショウジョウバエのウイルス感染システムを開発するのに方法を説明します。DCV は約 9300 のヌクレオチドの肯定的な感覚単一鎖の RNA ウイルス 9 タンパク質27をエンコーディングします。キイロショウジョウバエ自然な病原体として DCV ホスト ウイルスの相互作用と共進化28における生理・行動・基礎免疫応答をホストに適切なウイルスとしてと見なされます。さらに、野生型のハエで感染の急速な死亡率は、DCV 耐性や影響を受けやすい遺伝子のスクリーニングに有用なホスト29です。
しかし、ショウジョウバエのウイルス感染症を勉強して懸念のいくつかの側面もあります。たとえば、共生細菌ボルバキアはショウジョウバエと蚊の30,31,32の RNA ウイルス増殖の広いスペクトルを抑制する能力を持っています。最近の証拠は、どのボルバキアブロック シンドビス ウイルス (SINV)、アップレギュレーションを介しての感染メチルトランスフェラーゼ ホスト33Mt2 式の可能なメカニズムを示しています。また、昆虫の遺伝的背景もウイルス感染のために重要です。たとえば、 pastrel (pst)、遺伝子の天然ポリモーフィズム決まりますショウジョウバエ34,35、DCV 感染に対する感受性間Ubc E2HとCG8492の軌跡コオロギ麻痺ウイルス (CrPV) とそれぞれ36群れ家ウイルス) 感染に関与しています。
ショウジョウバエのセル行37,38, 口腔のホスト細胞成分の高スループット画面など研究目的に応じて、ハエでのウイルス-宿主相互作用を確立する特定の方法を選択する必要があります。腸に特有な抗ウイルス応答22,39,40, 全身の免疫を刺激するために上皮性の障壁を渡すことによって41,42やナノ注射をチクチク針を勉強する感染症応答。正確に実験的再現性の高い44保証制御抗ウイルス反応と生理学的病変43を誘発するウイルスの線量がナノ注射によって制御できます。この研究では、ショウジョウバエ, ハエの背景効果の重要性を強調におけるウイルス-宿主間相互作用を研究するナノ注入法について述べる。

<table><tbody><tr><td>0.22umフィルター</td><td>ミリポア</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mlマイクロ遠心チューブ</td><td>ブランド</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml RNaseフリー マイクロ遠心チューブ</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 cm細胞培養皿</td><td>シグマ</td><td>CLS430167</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>100 交換用チューブ</td><td>ドラモンドサイエンティフィック</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>15 mLチューブ</td><td>コーニング</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>ABI 7500 qPCR システム</td><td>ABI</td><td>7500</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>セルインキュベータ</td>ー <td>三洋</td><td>MIR-553</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離</td>器 <td>Eppendof</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離</td><td>Eppendof</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>シグマ</td><td>151858</td><td>RNA 抽出</td></tr><tr><td>DEPC 水</td><td>シグマ</td><td>95284-100ML</td><td>RNA抽出</td></tr><tr><td>ショウジョウバエインキュベーター</td><td>パーシバル</td><td>I-41NL</td><td>飼育 ショウジョウバエ</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>12657-029</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>平底96ウェルプレート</td><td>シグマ</td><td>CLS3922</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピルアルコール</td><td>シグマ</td><td>I9516</td><td>RNA 抽出</td></tr><tr><td>溶解バッファー (RNA 抽出)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15596026</td><td>TRIzol 試薬</td></tr><tr><td>溶解バッファー (液体サンプルの RNA 抽出)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10296028</td><td>TRIzol LS 試薬</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II オートナノリットルインジェクター</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td>Nanoject II 可変容量 (2.3 to 69 nL) ガラス毛細血管付き自動インジェクター (110V)</td></tr><tr><td>光学接着フィルム</td><td>ABI</td><td>4360954</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン, 液体</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>qPCR プレート</td><td>ABI</td><td>A32811</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Schneider'昆虫培地</td><td>Sigma</td><td>S9895</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>統計ソフトウェア</td><td>GraphPad Prism 7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix</td><td>TransScript</td><td>AT301</td><td>RNA抽出</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>IKA</td><td>VORTEX 3</td><td>RNA抽出</td></tr></tbody></table>

ウイルス感染とキイロショウジョウバエのホスト ウイルスの相互作用の解析

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

ウイルスの拡散は、流行病の主要な原因です。したがって、ウイルスとホスト間の相互作用を理解することは非常に重要なウイルス感染症の治療と予防の知識を拡張します。ミバエ ショウジョウバエ メランogasterが画面の抗ウイルスの要因と強力な遺伝学的ツールと非常に節約された生得の免疫のためのウイルス-宿主の相互作用を調査する最も効率的かつ生産的なモデル生物の一つであることが証明されてシグナル伝達経路。ここで説明する手順は、ウイルス感染を確立し、成虫の全身性抗ウイルス反応を引き起こすナノ射出方法を示します。この方法でウイルス注入量の正確なコントロールにより、実験再現性の高い。本研究では説明されているプロトコルには、ハエとウイルス、注入方法、生存率分析、ウイルス負荷測定、抗ウイルス経路評価の準備が含まれます。ハエの背景によってウイルス感染の影響効果はここで言及されました。この感染方法は行い易い定量的再現;それは、画面のウイルスとの相互作用におけるホスト/増殖因子、免疫シグナル伝達とウイルス感染への応答の他の生物学的経路間のクロストークを解剖に適用できます。

キイロショウジョウバエの DCV 感染後は、このセクションの結果が得られます。図 1は、ショウジョウバエのウイルス感染のフロー チャートを示します。ハエは内 thoracically ただ、注入され、ウイルス TCID50とゲノム RNA レベル (図 1) の測定のためのサンプルの収集し。ウイルス感染細胞の換散を引き起こすことができるし、CPE は 3 日間ポスト感染症 (図 2 a) で観測されました。ウイルス負荷を CPE 法で測定するに伴い qPCR (図 2 b) によって測定されます。図 3に示すとおり、ボルバキアはショウジョウバエの DCV 感染を抑制します。wol 16 s rRNA 、 wspのプライマーを使用してボルバキアの存在 (図 3 a) とボルバキア</e...

このプロトコルでは、キイロショウジョウバエナノ注入法と基本的なテクニックを使用して、ウイルスとの相互作用を分析する生体内でウイルス感染を確立する方法について説明します。

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

この方法は、ショウジョウバエメラノガスターでウイルス感染を効果的に確立する方法に関するウイルス宿主相互作用分野の主要な質問に答えるのに役立ちます。このナノインジェクション法は、ウイルスの感染用量を正確に制御することを可能にし、他の微生物病原体との感染に容易に適用することができる。1時間摂氏25度で追加の二酸化炭素を持たない完全なシュナイダーのショウジョウバエ培地の10ミリリットルを持つ10センチメートルの細胞培養皿の緩い、半接着単層としてミリリットル当たり7番目の生存可能なS2星細胞に10倍成長させることから始めます。インキュベーション中に、解凍したばかりのショウジョウバエCウイルスまたはDCVを完全培地1ミリリットルで0.01の感染の多重度に再中断し、細胞培養皿にウイルス溶液を加える。その後、プレートを摂氏25度のインキュベーターに3〜5日間戻します。ウイルスは、細胞形態がぼやけて見え、培養培地が細胞の破片を示す黒い粒子でいっぱいである場合、収集の準備ができています。上清を数回ピペット化して混合してから、細胞培養全体を15ミリリットルチューブに移し、マイナス80°Cで宿主細胞のリシスを行います。ウイルスの働く濃度を生成するには、遠心分離によって細胞の破片をペレットする前に、一定の揺れで25°Cの水浴で細胞懸濁液を解凍します。その後、上清を新しい無菌15ミリリットルチューブに移し、1管あたり最大200マイクロリットルのウイルス溶液をアリコートします。感染用量の平均ウイルス組織培養を決定するために、最初の種子は、100マイクロリットルの完全な培地で5つのS2スター細胞を100マイクロリットルの96ウェルプレートの12列に8個のウェルに1回10回播種する。その後、プレートを摂氏25度のインキュベーターに戻します。ランダムにマイナス80°Cのストレージからウイルスの5チューブを選択します。細胞が沈降している間、10無菌1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管を450マイクロリットルの無菌完全培地で満たし、450マイクロリットルの無菌完全培地を含む最初の1.5ミリリットルチューブに50マイクロリットルのウイルスストックを加え、12番目のウェルに10倍の懸濁液を希釈します。インキュベーションの終わりに、各希釈液の50マイクロリットルをウイルスのそのチューブの各列の適切なウェルに加え、ネガティブコントロールウェルとして1列につき1つのウェルにウイルスのない培養培地の50マイクロリットルを加える。その後、プレートを摂氏25度のインキュベーターに3日間置き、毎日20倍の倍率でブライトフィールド顕微鏡の下で各ウイルスストックの細胞パシー効果を評価します。細胞がぼやけて見え、媒体が正の井戸として断片でいっぱいであるウェルと、細胞の形態が陰性の井戸として正常である井戸を分類する。繁殖前に、テトラサイクリン1ミリリットル当たり50マイクログラムの400マイクロリットルを新鮮な標準コーンミールフライフードの4グラムと十分に混合し、エタノールを蒸発させるために一晩摂氏4度で食品を置きます。翌朝、食べ物を室温まで温め、食べ物と20人の雌と10人の新しく閉鎖された成人ハエを繁殖バイアルに入れ、通常の明暗サイクルで摂氏25度と湿度60%で3〜4日間の繁殖孵化を行います。十分な卵が産まれたら、新たに閉鎖された成体のハエを二酸化炭素の軽い流れの下で集め、ちょうど実証したようにショウジョウバエを再び2回繁殖させる。テトラサイクリン処理の3世代後、二酸化炭素の軽い流れの下で5つのハエを収集し、二重蒸留水の250マイクロリットルと数0.5ミリメートルの滅菌セラミックビーズでハエを均質化します。1分後、サンプルをマイナス80°Cで凍結する前に、2XバッファAの250マイクロリットルを渦液に加えます。次に、摂氏25度の水浴でマイナス80度の貯蔵からサンプルを素早く解凍し、続いて70°Cの水浴で30分間のインキュベーションを行い、ゲノムDNAを抽出し、標準的なプロトコルに従ってポリメラーゼ連鎖反応によってDNAを増幅する。標準プロトコルに従ってゲル電気泳動により各フライホモゲネートにウォルバキア16小RNAとwspが存在しないかどうかを確認する。その後、実証されているように、標準的なコーンミールフライ食品にウォルバキアフリーフライストックをリア。ウイルス感染の場合は、まず、ナノインジェクションに適した直径までガラス毛細血管の先端を切断するために、実体顕微鏡と薄い鉗子を使用します。インジェクターを組み立てるには、大きなディンプルを外側に向けたインジェクタの金属プランジャーの上に天井のOリングとホワイトスペーサーを置きます。30ゲージの針を装備した注射器を使用して、ガラスの針にミネラルオイルを充填し、首輪に針を入れます。大きなOリングを、針の鈍い端から約1ミリメートルの襟のベースの周りに置き、注射器のプランジャーに針を取り付けます。針をプランジャーに固定し、空のボタンを押してマイクロインジェクターのプランジャーを延長し、可聴信号が聞こえるまで延長します。今度は充填を押してプランジャー5ミリメートルを引き込み、針を100プラーク形成ユニットウイルスサスペンションに浸します。20個のウォルバキアを含まない男性ショショウジョウバエのバイアルを1つまたは少なくとも3つのバイアルを注射皿にそっと振ります。男性の恵まれたハエは交配中に好まれ、繁殖はメスに影響を与える可能性があります。次に、メソプレウラとプテロプレウラの間のわずかに明るい色の領域で50.6ナノリットルのウイルス溶液を各フライの胸郭に注入し、ちょうど実証したように、細胞変性効果アッセイおよび定量的RT PCRによってDCV負荷を測定する。注射後、ハエを新鮮なバイアルに慎重に移し、麻酔から回復している間にハエが媒体にくっつくのを防ぐために、バイアルを水平位置に置きます。注入は時間がかかるが、DCVの複製は非常に速いので、各バイアルからのハエがすべて注入された後、管の正確な時間を書き留めるのは非常に重要である。ウイルス感染は細胞のリシスを誘発し、細胞内症の影響は感染後3日で観察される。ウォルバキア16s rRNAおよびwspプライマーは、実演するようにウォルバキアおよびショウジョウバエの存在を検出するために使用することができる。ウォルバキアフリーハエは、DCV感染後および用量依存的に有意に減少した生存率を示す。DCVは、ジエア2突然変異ハエにおける生存率の低下およびウイルス負荷の増加によって証明されるように、ショウジョウバエにおける抗ウイルス感染に重要である宿主における抗ウイルスシグナル伝達経路を活性化する。この手順を試みる間、ウォルバキア遺伝子型の汚染は、DCV感染に飛ぶショウジョウバエのメラノガスターの感受性に影響を与える可能性があることを覚えておくことが重要です。この手順に従って、より大規模な遺伝的スクリーンのような他の方法は、ウイルス感染または抗ウイルス応答に必要な定義された宿主遺伝子の下での追加の質問に答えるために行うことができる。その開発後、この技術は、ヒトウイルス疾患の分野の研究者がショウジョウバエメラノガスターモデルにおける固有のヒトウイルス感染の流行の根底にあるメカニズムを探求する道を開いた。ウイルスの処理は非常に危険であり、適切な保護具を着用するなどの予防措置は、この手順を実行する場合は常に取られる必要があることを忘れないでください。

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学ぶ Drosophila melanogasterにおけるウイルス感染のナノインジェクション法とウイルス・宿主相互作用の解析手法。この方法は、感染動態の研究や治療戦略の開発に貢献します。

ウイルス感染とキイロショウジョウバエのホストウイルスの相互作用の解析

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