Name: 活性型のニコチンのレーザー フラッシュ ・ フォトリシス法によるマウス脳切片でのニコチン性アセチルコリン受容体の機能を探る (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 学ぶニコチン性アセチルコリン受容体の機能解析法。マウス脳切片を用いたレーザーフラッシュ・フォトリシスとパッチクランプ記録により、コリン作動性シグナル伝達と神経細胞形態の関連を詳細に解明できます。

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著者次北西部主任の研究室メンバーに感謝: ライアン Drenan、D. ジェームス Surmeier、オストモロワ Kozorovitskiy、アニスの建築業者。この作品は、米国国立衛生研究の健康 (NIH) (DA035942、R.M.D.、DA040626 の補助金)、PhRMA 財団 (M.C.A. に交わり) と HHMI によって支えられました。

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</ol>

D.L.W. は、ブルカー ナノ蛍光顕微鏡の雇われたコンサルタントとして提供しています。

PA Nic アプリケーション/配送方法の選択は、このローカライズされた光刺激法の最も重要なステップです。2 つの方法、風呂アプリケーションおよび局所灌流それぞれの明確な利点と制限事項を提供しています。選択主、興味のセル型で nAChR 機能発現レベルに影響されます。よく、バス アプリケーションの均一なプローブ濃度データの解釈を促進する、記録されたセルを囲むことができ、機能発現レベルが高いとき、お風呂のアプリケーションを使用することをお勧めします。お風呂アプリケーションも全体のプロセスを容易にして、組織の 2 番目の灌流ピペットの必要があります。ただし、高価なバス アプリケーション化合物実験あたりのコストの。
一般的に、トラブルシューティング nAChR 活性化に見られる次のせん光がない理由を理解しようとして含まれます。捜査官が ACh のローカル パフ アプリケーションを実行する必要があります PA Nic と以前に検討されていないセル型を操作する場合、または十分な受容体が機能的かどうかニコチン5を表明しました。システムが光分解反応を検出できることを検証するため内側 habenula ニューロン受容体30の大量を表す制御実験を行う必要があります。この脳領域では、PA Nic 風呂アプリケーションは検証実験のために望ましいである可能です。これらの検証実験を実行した後のみ 1 つに進みます巧まないセルタイプ。NAChR を強化する nAChR 正アロステリック変調器を追加それは PA Nic の濃度を高める、フラッシュ強度やパルス持続時間増加する正当化されるかもしれない実験システムの検証し、応答残る非常に少ないか検出できなかった場合「アクティビティ6」、またはこれらのいくつかの組み合わせ。
時折、uncaging 神経応答が大きすぎて、間接電圧の結果として重要な nAChR 活性化ゲート Na+チャネルの活性化と貧しい空間クランプによりアンクランプの内向きの電流。完全に無名の nAChR 内向きの電流とデータ解釈は不可能、これらのアーティファクトを記録ピペットで QX-314 (2 mM) を含めることによって回避できます。PA Nic の濃度を減らすことによってまたはフラッシュの発光量や脈拍の持続期間を減らすことによっても廃止される可能性があります。すべての可視光写真刺激実験の意図しない刺激光/分解目的の焦点面の上下を避けるために刺激部位を選択するときにケアを行使しなければなりません。さらに、該当するレーザー出力の必要があります常に滴定する生理学的応答を再現します。特に z 軸組む上/下の焦点スポット活性化配位子がまだ拡散し、調査の下で生物学的システム (すなわち,受容体) との対話にケージの配位子を扱うときに注意することが重要です。
いくつかの制限が存在すると、PA Nic レーザー フラッシュ ・ フォトリシス法はすべての調査官のことは適さない場合があります。最初の適切なセットアップのコストが比較的高いです。そのまま脳スライスを使用するとき樹状突起は、2 光子励起顕微鏡など高度な可視化システムを必要とするような小径構造近く調査。チタンサファイアレーザー、実行する 2 光子顕微鏡用可変 IR パルス レーザーのコストが高いは別としてさらに 2 つのレーザー光の位置を独立してできるデュアル検流計システム システム コストが増えます。捜査官に十分な専門知識と構築、トラブルシューティング、およびそのようなシステムを維持する時間あればホームが構築したシステムを使用して、システム全体のコストを削減できます。しばしば第 2 の制限は、低 nAChR の機能発現は、部分的に前述の手順を実行して軽減することができます、しかし、これは成功を保証しないかもしれない。通常、1 つはアゴニストのパフを申請リガンド活性化電流を測定できない、電圧クランプ下 PA Nic せん光は、ないその許容可能な結果をもたらす可能性があります。第 3 の制限を含む組み込み蛍光 PA PA の nic Nic の 〜 405 nm の光を吸収して緑色蛍光タンパク質 (GFP) またはアレクサ 4885として類似の範囲で出力します。PA Nic 濃度超える 〜 1 mM と、この蛍光特性が同時に神経細胞の構造を視覚化する挑戦的な行うことができます。これを緩和するには、灌流ピペットから PA Nic の流れを簡単に制御することができることが重要です。定期的に、PA Nic 流れはすぐ拡散する蛍光分子を許可する停止しました。これは uncaging 神経のビーム スポット位置をチェックするためのニューロンの再イメージ化が許可されます。言及する第 4 の潜在的な制限には、光分解の 405 nm の光の使用が含まれます。405 など短い波長 nm は、脳スライスなど複雑な組織散乱しやすい。したがって、特定のフラッシュの発光量、期間、uncaging 神経応答振幅と減衰機構差分による影響はスライス内 uncaging 神経の焦点深度。NAChRs の生物学的側面についての結論では、この重要な注意点を考慮する必要があります。
このローカライズされたレーザー フラッシュ光分解手法は nAChR 神経生物学に関する新たな詳細を明らかにする最近使用されています。たとえば、慢性ニコチン曝露は、perisomatic と内側 habenula ニューロン5樹状 nAChR 機能を高めます。それはまた perisomatic の樹状細胞コンパートメント6機能 nAChRs を腹側被蓋野グルタミン酸ニューロンに表現を最初に示すために使用されました。これから多くの可能性をこの技術の使用があるし、知られている大脳皮質錐体細胞31など大脳皮質の32、介在ニューロンのエクスプレス nAChRs 線条体33 他のキーのニューロン タイプにアプローチを適用できます。、および海馬19。この手法は、薬理学および/または nAChR の遺伝子が異なる神経細胞のコンパートメントに特定の受容体サブタイプをローカライズする34の編集とも組み合わせることができます。アプローチ、PA Nic5と並行して開発されたものに限定されないなどの他のクマリン ケージ化合に容易に適応があります。最後に、PA Nic せん光 5 月 1 日使用目を覚まし行動動物の行動薬理学の新しいパラダイムの中でニコチンのアクションを勉強します。

コリン作動性シグナル伝達注意制御、随意運動と報酬1,2を含む多数の脳のプロセスを調節します。アセチルコリン (ACh) の伝送を向上させる薬は、アルツハイマー病、認知3におけるコリン作動系の重要な役割を意味に関連する認知機能障害を治療するために使用されます。コリン作動性受容体と健康と病気の状態の回路の改善された理解は、いくつかの神経学的疾患/障害に対するより良い治療法につながる可能性があります。
ニコチン性 ACh 受容体 (nAChRs) は、たばこ製品からの内因性 ACh または外因性のニコチンに応答中の陽イオンをフラックス リガンド依存性イオン チャネルの家族です。説明4非常に最初の神経伝達物質受容体の間であったという事実を考えると、nAChR 薬理学および筋線維内の場所は筋肉型受容体の周知。対照的に、比較的少しは薬理学およびネイティブ nAChRs 脳内の細胞内分布について知られています。知識で、このギャップは最近細胞イメージング、電気生理学的記録5の中に脳組織の nAChRs の空間的制限と急速な活性化を可能にする化学プローブを開発することによって解決されました。ここでは、神経構造を持つ nAChR 機能を接続する能力を高めの全体的な目標と、このアプローチの重要な方法論的手順はとおりです。
活性型ニコチン (PA Nic; 化学名: 1-[7-[bis(carboxymethyl) - アミノ] クマリン-4-イル] メチル ニコチン) 効率的にニコチン5,6をリリースする 〜 405 nm レーザー フラッシュと photolyzed をすることができます。調査、前に PA Nic にソリューションで安定し厄介な薬理学的または光化学機能5を示さない。光分解後に、リリースされたニコチンは予想通り nAChRs をアクティブにし、uncaging 神経の副産物が薬理学的に不活性5。連続発振レーザーは出力電力が光分解光源として使用される > 1 mW がサンプルで測定されます。ローカライズ対象の光刺激が多光子励起レーザ走査型顕微鏡 (2PLSM) の細胞膜を検索する機能と組み合わされて、このアプローチの 2 つのキー利点は、完全に実現: 光分解速度と空間的な精度。
ほとんどの点で PA Nic の光分解は nAChR 配位子を脳スライス内の受容体に配信する他の方法より優れています。このようなアプローチは、風呂アプリケーション7および薬剤の局所配信を介してフグ ピペット8に含まれます。前者のアプローチは応用の薬剤の長期効果が過度に強調する傾向があり、一方後者は試験間および細胞応答動態の変動に苦しむことができます。これらの代替アプローチのどちらも適切に同じニューロンから別の細胞の場所で受容体の活動を区別できます。ACh の放出を生じる活性化は、ネイティブの nAChRs9,10,11の調査のため使用されていますが、それはないマッピングの細胞内局在の nAChR 場所が役立っています。さらに、ほとんどの研究がこのアプローチを利用して依存している ChR2 表現の細菌人工染色体・遺伝子改変マウス コリン作動性透過率の異常12,13,14,15,16,17。
PA Nic の光分解は、コリン作動性受容体を研究するため唯一の光学的方法ではありません。ケージ カルバコール機能的細胞18と脳スライスの19、ACh 受容体活性をマップに使用されたが PA nic の開発中には比較用に市販なかった(ビピリジン) ルテニウム bis-ニコチン複雑な (ルビ-ニコチン) はニコチン uncaging 神経20、ように報告されましたが、頭に頭の比較では PA Nic に劣る証明したルビ ニコチンの商業準備研究5。非営利でこのような比較実験を繰り返す便利なことがありますその可視吸収はコリン作動性研究 PA Nic 機能をほめることができるよう、ルビ ニコチンを高度精製します。最後に、nAChRs も操作されている光学写真切替可能なリガンドと受容体の遺伝子組み換え21の組み合わせを使用しています。このアプローチの利点と欠点を見て変更された nAChR の遺伝子ターゲティングの能力/要件と、脳組織の PA Nic 光分解に補足であります。
このアプローチのいくつかの要件は、注意してください。まず、適切な可視化法は神経細胞膜を正確に特定する必要です。培養細胞の研究と従来のエピ蛍光顕微鏡を用いたイメージングで十分かもしれませんが、脳スライスまたはその他の厚いティッシュの準備のニューロンから記録、2PLSM または共焦点顕微鏡が必要。第二に、光分解レーザー ビームを配置する適切な方法が必要です。このアプローチは、ラスター スキャン イメージングのビームおよび uncaging 神経レーザー ビーム22,23,24を使用してポイントの photoactivation のため 2 つの独立した x と y ミラー付きデュアル ガルバノ スキャン ヘッドを採用しています。他より限定されたソリューションが可能であれば、代わりにラスター スキャンする画像のビームと uncaging 神経ビームまたはそのセルを連れて (2) 単にビューのフィールドの中央に uncaging 神経のビームを演出 (1) 単一ガルバノ スキャン ヘッドなどフラッシュ ・ フォトリシス法のこの位置。第三に、システムは、実験中に生体信号を収集する希望する場合は同時に電気生理学的記録のため必要です。最近説明5として適切な全光イメージングと上記の要件を満たすことが。以下では、詳細なプロトコルが含まれているはこのアプローチの主要な手順について説明します。

<table><tbody><tr><td>器具、消耗品、その他の化学薬品</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マルチクランプ700B</td><td>Molecular Devices Corp.</td><td></td><td>パッチクランプアンプ</td></tr><tr><td>空気圧 ピコポンプ</td><td>ワールド精密機器</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>サッター機器 Co</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>温度コントローラー</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>振動ブレード ミクロトーム</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-MC 遠心フィルター</td><td>MilliporeSigma</td><td></td><td>UFC30GV0S 内部溶液フィルター</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス 毛細血管</td><td>世界精密機器</td><td>1B150F-4</td><td>パッチおよびローカル アプリケーション ピペット</td></tr> <tr><td>(-)-ニコチン酒石酸水素塩</td><td>グレンタム</td><td>GL9693</td><td>ニコチン塩</td></tr><tr><td>7-カルボキシメチルアミノ-4-メチル クマリン</td><td>ジャネリア リサーチ キャンパス</td><td></td><td>PA-Nic 副産物</td></tr><tr><td>1-[7-[ビス(カルボキシメチル)-アミノ]クマリン-4-イル]メチルニコチン</td><td>ジャネリア研究キャンパス</td><td></td><td>PA-Nic</td></tr><tr><td>Euthasol (ペントバルビタールナトリウムおよびフェニトインナトリウム)</td><td>Virbac</td><td>ANADA #200-071</td><td></td></tr><tr><td>Alexa FluorTM 488 Hydrazide</td><td>ThermoFisher</td><td>A10436</td><td>グリーンフィル染料</td></tr><tr><td>Alexa FluorTM 568 ヒドラジド</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A10437</td><td>レッドフィル染料</td></tr><tr><td>6-carboxy-AF594 (Alexa Fluor 594)</td><td>Janelia Research Campus</td><td></td><td>レッドフィル染料</td></tr><tr><td>QX 314 塩化</td>物 <td>Tocris</td><td>2313</td><td>電位依存性ナトリウムチャネルブロッカー</td></tr><tr><td>パワーメーター&nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>S120C</td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Chemicalsfor Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-D-glucamine</td><td>Sigma</td><td>M2004</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>シグマ</td><td>P3911</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>ナトリウム一塩基性一水和物</td><td>シグマ</td><td>S9638</td><td></td></tr>重<tr><td>炭酸ナトリウム</td>シ<td>グマ</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース</td><td>シグマ</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>(+)-L-アスコルビン酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>チオ尿素</td><td>シグマ</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td></td><td>ΣP2256</td><td></td></tr>硫酸<tr><td>マグネシウム七水和物</td><td>Σ</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>Σ</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>ΣS9625</td><td></td><td></td></tr>エ<tr><td>チレングリコール-ビス(2-アミノエチルエーテル)-N,N,N&prime;,N&prime;-四酢酸</td><td></td><td>ΣE3889</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 5&prime;-三リン酸マグネシウム塩</td><td>Σ</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>グアノシン 5&��;-三リン酸ナトリウム塩水和物</td><td>Σ</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>2光子顕微鏡のコンポーネント</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;オリンパスBX51顕微鏡用Ultimaレーザースキャナー</td><td>Bruker Nano, Inc.</td><td></td><td>イメージングソフトウェアとガルボス</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;イメージングXYガルバノメーター</td><td>Cambridge Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;マイタイHP1040</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>Tuneable IRレーザー</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;ポッケルスセルM350-80-02-BKとM302RMドライバー</td><td>Conoptics、Inc.</td><td></td><td>IRレーザー減衰用</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;積分球フォトダイオードパワー</td><td>センサーThorlabs、Inc</td><td></td><td>レーザーパワーピックオフフォトダイオード</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;アンケージングXYガルバノメーター</td><td>Cambridge Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;Helios 2-Line Laser Launch</td><td>ブルカーナノ株式会社</td><td></td><td>レーザー部品のアンケージング</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;OBIS LX/LS 405 nm (100 mW)</td><td>Coherent, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;OBIS LX/LS 473 nm (75 mW)</td><td>Coherent, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;リムジンサイドカー用ポイント光活性化/ファイバー入力モジュール - Uncaging</td><td>Bruker Nano, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>直立顕微鏡</td><td>&nbsp;オリンパス</td><td>BX51WIF</td><td>正立顕微鏡シャーシ</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;目的:オリンパスMプランFL 10x;NA 0.3 WD 11 mm</td><td>&nbsp;オリンパス</td><td></td><td>10倍対物レンズ</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;対物レンズ:オリンパスMプラン蛍石 60x/1.0 WD=2mm NIR</td><td>&nbsp;オリンパス</td><td></td><td>60倍水浸対物レンズ</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;X-Cite 110、4 LED LLG結合落射蛍光光源</td><td>Excelitas Technologies</td><td></td><td>LED光源</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;落射蛍光フィルター:エピタレット用ET-GFP(FITC/CY2)</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td>青色光励起用LEDフィルター</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;落射蛍光フィルター:ET-DsRed(TRITC/CY3) Epi-Turret</td>用 <td>Chroma Technologies</td><td></td><td>緑色光励起用LEDフィルター</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;B&W CCDカメラ;Watec、0.5 in B/W CCD</td><td>Watec Co.、LTD.</td><td></td><td>パッチクランプ記録用CCDカメラ</td></tr><tr><td>名称</td><td>会社名</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</strong</td></tr><tr><td>>外部検出器 - デュアル反射エミッション - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP)</td><td>Bruker Nano, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;マルチアルカリサイドオンPMT</td><td>浜松</td><td>R3896</td><td>赤チャネルPMT</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;595/50m</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td>製赤チャネル発光フィルター</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;565lpxr</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td>ダイクロイック ビーム スプリッター</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;GaAsPエンドオンPMT</td><td>浜松</td><td>7422PA-40</td><td>グリーンチャネルPMT</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;525/70m</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td>グリーンチャネルエミッションフィルター</td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;浜松H7422 PMT用高速シャッター</td><td>Vincent Associates / Bruker</td><td>517329</td><td>PMTシャッターマウント</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>Dodt Gradient Contrast Transmission Detection Module</td><td>Bruker Nano, 株式 会社。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;マルチアルカリサイドオンPMT</td><td>浜松</td><td>R3896</td><td>Dodt PMT</td></tr></tbody></table>

活性型のニコチンのレーザー フラッシュ ・ フォトリシス法によるマウス脳切片でのニコチン性アセチルコリン受容体の機能を探る

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

さまざまな神経プロセスを調節する受容体を介して機能するアセチルコリン (ACh) が、この関数が行われる場所の細胞内の細胞内の局在と ACh 受容体機能をリンクにチャレンジしております。ニコチン性 ACh 受容体 (nAChRs) ネイティブの脳組織中の細胞レベル下の場所を研究するには、光学的手法は電気生理学的記録中に神経細胞膜近く離れた場所でニコチンの正確なリリースのために開発されました。2 光子レーザー顕微鏡、中にその形態を視覚化するスライスが満ちている脳内のニューロンのパッチ クランプを染めるし、光のフラッシュで実行する 1 つまたは複数の細胞膜近くの 405 nm のレーザ光の焦点を当て、ニコチンの調査。携帯電話の現在のたわみを測定、記録されたニューロンの高分解能三次元 (3 D) 画像は nAChR 応答細胞形態との和解を許可させます。このメソッドは、複雑なティッシュの準備、コリン作動性神経伝達の理解を高めることを約束の nAChR 機能分布の詳細な分析できます。

光分解の刺激、被曝線量 (強度と時間)、露出場所、および梁のジオメトリは、キーの変数です。この資料に記載さシステムの調整を介してビーム検流計システムに入る前に、光の光路のレンズ/アウトを移動、2 つの異なる光ビームが可能です。このレンズなし光ビームいっぱい 60 x の入射瞳/水浸漬 [60 x WD] 1.0 NA 近く-回折-限られた、サンプル中のフォーカル プレーンでサブ μ m スポットを作り出す目的。これは、光刺激の上と下の焦点と光軸対称の拡張、砂時計の形で光に関連付けられます。パスに挿入レンズ、光レーザー光は、対物レンズの入射瞳に焦点を当ててして鉛筆のようなビームとして終了します。直径 60 x の目的のために 〜 10 μ m にする予定です、このビームを均一/垂直方向にサンプル全体をとおして拡張します。このモードで刺激スポット内で任意の場所に光の強度は回折限界に近い小さなスポット強度の ~ 1% になります。したがって、~ 10 μ m スポットの刺激を使用する場合、高いレーザーが通常必要です。この記事で報告するすべての実験の砂時計型光ビームが使用されました。
配信されるサンプルの電源は、レーザー出力の電源メーターを使用してサンプルを測定後、入力電圧設定に対してプロットできます。これらの研究は、2 mm の作動距離の WD 目的 x 60 を使用して、それは電力測定器の要素に潜在的な損傷を防ぐために水に浸漬されません。目標を挙げて NA &gt; 0.95 は空気 (せずに浸漬液) で測定される、下位のインデックス (空気) のためレンズ前面の要素の全内部反射損失をすることができます。(総内面反射の損失を補正) により正確なサンプル パワー測定の場合、1.0 NA 客観的 (1.0/0.95)2大気中で測定した電力を増加します。図 1 aは、405 の典型的な入力/出力プロットを示しています nm、473 nm 可視光レーザー レーザーに組み込まれている本研究ではシステムを起動します。これらのレーザー システムは、次の理由により光刺激露出量制御に最適な: (1) 入力電圧を基準にして直接線形電力出力を提供するために事前に校正されている (0-5 V)、(ないレーザーを用いたサイレント シャッター操作を提供 (2)出力)、(3) は急速なサブ ms 強度パルス持続時間制御 (0.1 ms 応答)。レーザー/ガルバノ システムとスポット光刺激を使用している場合MarkPointsスポットのルーチン調整は欠かせない作業です。図 1b(左側のパネル) 適合外にあるシステムを示します (写真刺激するために必要なポイントは発生しませんそのポイントの正確な刺激やけど穴の位置によって示される)、(のキャリブレーション後スポットの正確な位置決めに戻ると図 1 b、右側のパネル)。 
PA Nic は控えめな蛍光 (発光ピーク ~ 510 nm)、350-450 nm (1 光子励起) または 700-900 nm (2 光子励起)5の間効果的な加振を展示します。ローカル アプリケーション中に PA Nic を視覚化、PA-Nic (1 mM) を続く (1) 脳組織切片光通信コンテキストの同時イメージング Dodt コントラストと (2)、放出される蛍光励起から脳組織に近い適用 (900 nm) のPA の nic PA-Nic 2PE 蛍光の間にあったローカル アプリケーション ピペット (図 2 a) からの圧力取り出し容易に検出できます。ニコチンと monoalkylcoumarin、7-carboxymethylamino-4-メチル クマリンは、PA Nic 光分解反応5の主な光化学製品です。同じ設定/PA-Nic イメージングに使用されたパラメーターをイメージングを使用して、組織はニコチン (1 mM) または 7-carboxymethylamino-4-メチル クマリン (1 mM) のいずれかの配信中にイメージしました。蛍光シグナルが検出されません (図 2 a、中間と下部パネル)、PA Nic 結果の特異性を示します。最後に、PA Nic 脳組織内で適用し、PA Nic 蛍光発光をイメージしました (図 2 b)。このアプローチは、PA-Nic が 100-200 μ m のローカル アプリケーション ピペット内に存在ことを確認します。一緒に、これらのデータは、PA-Nic が効果的にローカル アプリケーション経由で脳組織に配信されることを確認します。
細胞構造の可視化のための同時2PLSM で録音を電気生理学実験の両方のコンポーネントのバランス考慮事項を治験責任医師を必要とし、しばしば狭い時間枠 (~ 20 分) は利用有効パッチを適用したセルからサンプル データ集録。細胞の可視化を考慮せず安定性を記録するため時間とともに減少する傾向がある侵入後、できるだけ早く記録を開始するベスト プラクティスです。ただし、イメージングが要件と、電気生理学的考察は小/リモート構造で蛍光濃度増加に十分な時間を許可する必要があります。これは、充填曲線28、新しいセル型撮像時の取得に有用ある色素の濃度を調べることによって例証されます。図 3は、いくつかの例ニューロン Z スタックとして 2PLSM を介してイメージを作成、プレゼンテーション目的のため最大強度投影に折りたたまれているを示しています。図 3 aは、どこ神経形態表示完了するのに、ノイズを最小限に抑える、破片は細胞形態の解釈と干渉しない高品質の画像を示しています。図 3 bは、下のシグナル/バック グラウンド比および実質的な破片のための低品質の画像を示しています。この残骸は、しばしば強烈な蛍光、セルに近づいている間パッチ ピペットから染料をイメージングの取り出しから生じる球面ポケットとして表示されます。特に、100 μ M のお風呂 (お風呂アプリケーションを実行する) ときに PA Nic は信号-バック グラウンド比率を削減する傾向がある、サブ最適な画像のコントラストにつながります。Alexa Fluor 568 または 594 はローカル アプリケーションの実験で非常に有用が多いファインダー染料としてまたは正規化 2PE 参照/正規化信号として。これらの染料の 2 光子励起波長 〜 780 nm です27、PA Nic の同時可視化と細胞コンパートメントの同定を可能にします。この波長ただしがない完全に避ける PA Nic5の 2 光子光分解。Alexa Fluor 488 は PA Nic 浴適用実験; に有利であります。適切な波長 ≥900 nm で励起されると、細胞コンパートメントの適切な可視化を維持しながら PA Nic5の 2 光子光分解を回避できます。
図 4は、脳スライスの MHb ニューロンでローカライズされた PA Nic レーザー フラッシュ ・ フォトリシス法のデータの例を示します。図 4 a(上部パネル) 写真刺激スポット場所を重ねて、 MarkPointsプロトコルが実行された前に最後の 2PLSM 画像の画面キャプチャは、「参照」イメージの例を示しています。図 4 a(下方の画像パネル) 細胞形態に重ねてスポット光刺激の拡大ビューを表示します。PA Nic 光分解に対応する時間相関のとれた電気生理学的応答は、図 4 aの下のパネルに表示されます。前作は、これらの流れが nAChR 拮抗薬5に敏感であることを示した。図 4 bは、どちらかの 1 の間隔でシングル スポット光分解を行った別のセルから代表的なデータを示しています s または 10 秒の 10 秒間隔保持電流基準の十分な回復時間を許可されるに対し、1 秒間隔を短くをもたらした、プロトコルとして現在の持株の緩やかな増加が進んだ。現在増加ニコチンが 1 Hz 間隔29とシステムから拡散する十分な時間を持っていなかったことを示唆しています。そんなの時間応答特性を解析する必要がありますは、nAChRs の神経薬理学は細胞の種類によって異なるかもしれませんが、検討されている任意の新しいセル型の de novo を実行しました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig1.jpg"> 図 1: 組むレーザー校正します。(、) 写真刺激レーザー出力。試料面で電源 (60 x を/1.0 NA 水浸漬の目的) 405 の測定した nm と 473 nm の光刺激レーザー出力設定で。(b) 写真刺激レーザー校正。画面キャプチャ画像が意図した写真刺激スポットと光刺激が前 (左) に、(書き込み穴) を発生する対応する位置の空間関係を表示およびMarkPointsの (右) 実行されている校正後。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig2.jpg"> 図 2: PA Nic のローカル アプリケーション。(、) PA Nic 検出のローカル アプリケーション ピペット。1 mM PA Nic、光分解副産物またはニコチンがアプライドに溶解し、ローカル アプリケーション ピペットに読み込まれ、2PLSM 中に脳組織の上に分配される (900 nm 励起) 各薬剤の同時イメージング設定を用いたイメージングします。GaAsP 陰極光電子増倍管は蛍光性の放出をキャプチャする使用されたに対し、Dodt コントラスト透過像を走査型レーザーは組織/ピペットを示しています。(b) PA Nic (1 mM) は脳組織灌流され、その本質的な蛍光を用いた PA Nic の横方向の広がりを表示する (、) のように 2PLSM を介してイメージを作成します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig3.jpg"> 図 3: 2 光子レーザーのスキャン顕微鏡画像の集録します。(、) の最適な 2PLSM Z-スタック。MHb よく解決樹枝状結晶ニューロンの示す 2PLSM Z スタック最大強度突起の 2 つの例は、ない干渉の破片はほとんど。(b) 準最適 2PLSM Z スタック。2PLSM Z スタック最大強度突起の 2 つの例の MHb ニューロン (色素細胞のアプローチの中にピペットから追放) の残骸に囲まれています。このような画像は (、) に示すようなイメージよりもを解釈するより困難です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig4.jpg"> 図 4: PA nic のレーザー フラッシュ ・ フォトリシス法(、) MarkPoints参照画像と PA Nic 光分解により誘発される内向きの電流。一つの MHb ニューロン 1 つ (示されている) 細胞の場所でMarkPoints光刺激試験生参照画像が表示されます。メモいくつかの光刺激の場所 (このシリーズで一番右の画像)、樹状構造は、フォーカスしますが、相馬と近位樹状突起はありません。下の各参照画像ニコチン調査誘発内向き電流がプロットされます。(b) 刺激間間隔 PA Nic 光分解のため。1 の刺激間間隔と同じ perisomatic の場所でニコチンが繰り返しケージ MHb ニューロンの手本録音が表示されます s または 10 s.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

この記事は、ニコチンの調査によるマウス脳切片でニコチン性アセチルコリン受容体 (nAChRs) を研究するための方法を示します。同時パッチ ・ クランプ記録および多光子励起レーザ走査型顕微鏡と組み合わせることで、ニコチンの調査は、コリン作動性神経の生物学のより深い理解を提供し、細胞の形態とニコチン性受容体機能を接続します。

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...

この技術は、光活性化可能なニコチン分子のレーザーフラッシュ光起きと組み合わせたマルチ光子レーザー走査顕微鏡を利用する。ニコチンコリン受容体の正確な活性化を可能にする。この技術は、ニコチン性受容体アゴニストアプリケーションに対する微細な時空間的制御を可能にし、受容体機能発現パターンおよびコリン作動性シナプスまたは体積伝達の研究のための強力なツールを提供する。手順を開始する前に、プログラム可能なピペットプーラーを使用して、20〜40マイクロメートルの開口部径のガラスマイクロピペットを引っ張ってください。0.22ミクロンフィルターを介して約1ミリリットルの記録溶液を歪めます。そして、2ミリモルの最終濃度を得るために濾過された記録溶液に十分な凍結した光活性化ニコチンを再中断する。引っ張られた局所適用マイクロピペットに50マイクロリットルの光活性化可能な薬物をバックフィルし、マイクロマニピュレーターに取り付けられたピペットホルダーにピペットを固定します。適切な長さのチューブを介してピペットホルダーを、低圧の持続性を持つ圧力放出システムに接続します。そして、マイクロマニピュレーターを使用して、局所アプリケーションピペットを細胞外記録溶液に操縦する。ピペットチップをマウス脳組織サンプルの上にわずかに配置し、対象の細胞から約50マイクロメートルに置きます。そして簡単にピペットに圧力の平方インチあたり1〜2ポンドを適用します。関心のあるセルの変位は最小限に抑える必要があります。安定した全細胞パッチクランプを達成した後、圧力放出装置の低い適用をオンにし、光活性化可能なニコチンで細胞を取り巻く組織を1〜2分間飽和させる。ローカル アプリケーションでは、実験がさらに複雑になります。しかし、それは化合物を惜しみ、PA-Nicのより高い濃度を利用することを可能にする。光活性化性ニコチンの浴用途については、まず100マイクロモル最終濃度への連続再循環に適した記録溶液の体積に凍結乾燥した薬物を十分に溶解する。そして、得られた混合物を灌流系にロードする。次に、光活性化性ニコチン溶液の再循環を1.5〜2ミリメートル/分の速度で開始し、必要な再循環量を最小限に抑えるために、最小の内径と全長のチューブを使用します。再循環中、カルボーゲンで溶液を連続的に泡立て、低照度条件下で32°Cの温度を維持します。入浴の適用はティッシュのPA-Nicの浸透の簡易性および均一性から利益を得る。しかし、それは必ずしも低いマイクロモルPA-Nic濃度を利用し、化合物のより高い総量を消費する。内側ハベンラニューロンのライブ可視化には、透過光または赤外線差動干渉コントラスト光学とビデオカメラを使用して、安定した全細胞パッチクランプ記録を確立します。高抵抗セル接続構成を確立した後、侵入前に、セットアップとソフトウェアをレーザースキャンモードに切り替えます。侵入後、レーザースキャンを使用して、目的のイメージング色素が拡散によってニューロンを受動的に満たしていることを確認します。色素が目的のニューロンおよび細胞内区画を視覚化するために生きスキャン機能を使用する前に、少なくとも20〜30分間細胞コンパートメントを充填することを許可します。必要に応じて、適切な設定を操作して表示ビジュアライゼーション、解像度、信号対雑音比、画像フレーム取得時間に影響を与えたり変更したりできる、ニューロンフィーチャの正確なライブビジュアライゼーションを可能にするイメージング パラメータを選択します。信号のコントラストを高めるには、ルックアップ テーブル ウィンドウを開き、ルックアップ テーブルの床と天井の設定を調整します。組織内の対象領域を特定するには、1X 光学ズームを選択し、パンニングコントロールを使用します。Z シリーズ ツールを使用して、対象のセルを含む開始位置と終了位置を選択します。1マイクロメートルのステップサイズを設定し、最高解像度の画像を生成する画像サイズを選択します。多くの場合、1 行あたり 1,024 x 1,024 ピクセルです。その後、連続して細胞を含むすべてのZプレーン内のニューロンを画像化します。レーザー刺激を較正するには、最小より大きいレーザーのイメージ投射力でシステムスキャンを開始し、薄い赤いマーカーの蛍光層に目的の焦点を微調整する。蛍光フィールド内の破片をクリアし、マーカーで均等にコーティングされた領域を選択し、ツール、キャリブレーション、アライメントメニューを開いて、アンケージガルボキャリブレーション機能を選択します。2番目のガルバノミラーペアの空間キャリブレーションのための燃焼スポットチュートリアルに従い、405ナノメートルレーザー、400のレーザー刺激力、および20ミリ秒の刺激持続時間を選択します。赤いマーカーに直径1~5マイクロメートルの穴を開ける。[更新] を選択すると、センター スポットバーン後に画像が刺激され、リフレッシュされ、赤丸のインジケーターが中心、右中央、および下中央のスポットの実際のスポット位置に移動して、9 つのスポットのグリッドを取得します。キャリブレーションをテストするには、マークポイントウィンドウを開き、サンプルの新しい領域で定義されたスポットの刺激パラメータを手動でアクティブにして、正しい最新のキャリブレーションファイルがマークポイントウィンドウにロードされることを考慮します。次に、テストパルスを適用して正しいキャリブレーションを確認します。対象となる細胞内領域を簡単に画像化して見つけるには、ライブスキャンを選択し、光学ズームを増やして必要に応じて小さな構造を視覚化します。マークポイントを細胞膜のすぐ隣に配置し、光刺激パラメータを1~50ミリ秒の持続時間、1~4ミリワットのレーザーパワー、および少なくとも1回の試行に設定します。次に、マークポイントを選択してマークポイントプロトコルを開始し、エレクトロ生理学データ取得をリアルタイムで観察します。光活性化可能なニコチン2PE蛍光は、実証したように局所アプリケーションピペットからの圧力放出中に容易に検出される。一方、光活性化性ニコチン光反応の主な光化学製品の送達は、同じ濃度と励起力と波長で蛍光シグナルを生成しない。光活性化性ニコチン結果の特異性を示す。実証されたように脳組織に適用される光活性化性ニコチンのイメージングは、局所適用ピペットの100〜200マイクロメートル内の薬物の存在を明らかにする。光活性化可能なニコチンを、局所的なアプリケーションを介して脳組織に効果的に送達できることを確認する。ここでは、神経形態が完全であるように見える高品質の画像、ノイズが最小化され、破片が細胞形態の解釈を妨げない、を示す。ただし、これらの画像は品質が低くなります。信号対バックグラウンド比が低く、破片が多いためです。脳スライス中の内側ハベヌラニューロンの2光子レーザー走査顕微鏡とPA-Nicのレーザーフラッシュ光分解を組み合わせることで、細胞形態との電気生理学的応答の調整が可能になる。10秒間隔で単一スポット光の起用を行うと、ベースライン保持電流に十分な回復時間が可能となる。短い 1 秒間隔は、プロトコルの進行に従って保持電流の漸進的な増加につながります。ニコチンは、短い間隔でシステムから拡散するのに十分な時間を持っていないことを示唆しています。光活性化可能な分子を利用する実験を設計する際には、蛍光指標を選択し、相性の高い励起発光スペクトルを持つ蛍光体を報告することを忘れないでください。PA-Nicは短波長の光の原因で最も一般的な蛍光性と互換性がある。最も適切なPA-Nicアプリケーション技術を選択する際には、目的のニューロンにおけるニコチン受容体の機能的発現、生理活性を慎重に検討することが重要である。この技術の熟練した利用は、ニコチンアプリケーションの微細な時空間制御を可能にし、ニコチン受容体活性化による在来のニコチン受容体関与、細胞内局在化、および神経活動の調節の運動学を研究するためのエキサイティングな新しい可能性を可能にする。

probing-nicotinic-acetylcholine-receptor-function-mouse-brain-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

私たちはより良いアプローチノックインおよびスペクトルを用いた受容体の蛍光タンパク質タグを含むアプローチの組み合わせを使用して、ニコチン中毒のメカニズムを理解するCNSニューロンの特定のサブタイプの細胞内領域内のニコチン性アセチルコリン受容体の変化を定量化する新しい技術を開発しました共焦点イメージング。...

慢性ニコチン投与によるマウスノックインで蛍光標識ニコチン性受容体のスペクトル共焦点イメージング

このビデオは、マウス腹側海馬におけるニコチン性アセチルコリン受容体のニコチン媒介活性化が、軸索に沿った持続的なカルシウムシグナル伝達をもたらす方法を示しています。...

シナプス共培養における腹側海馬軸索に沿ったニコチン誘発性カルシウムシグナル伝達のイメージング

本稿では、急性単離した脳スライスのニューロンにおけるリガンド依存性イオンチャネルの機能を研究するための有用な方法を説明します。このメソッドは、標準パッチクランプ法を用いて記録された神経細胞への薬物のローカルアプリケーションのための薬剤を充填したマイクロピペットの使用を含む。...

マウスの脳スライスにおけるニコチン性アセチルコリン受容体機能を研究するための薬物のローカルアプリケーション

私たちは、ニコチン性アセチルコリン受容体(nAChR)を介したシナプス伝達のシナプス前メカニズムを直接ライブイメージングで分析するための、腹側海馬-側坐回路の遺伝子キメラ製剤をin...

ニコチン誘導性カルシウムシグナリングおよび腹側海馬軸索に沿って神経伝達物質放出のライブイメージング

ここでは、生物発光レポーターを使用してアプローチを-imaging小説のCa 2+を提示します。このアプローチは、Ca 2+に結合し、励起光の必要性を排除し、光を発する融合構築物のGFPエクオリンを使用しています。重要なことは、この方法は、長い連続撮影、脳深部構造へのアクセス、高時間分解能を可能にします。...

生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで

我々は、単一のコルチコストリアタールグルタミン酸シナプスにおけるグルタミン酸放出とクリアランスのバランスを、成体マウスからの急性スライスにおける評価するプロトコルを提示する。このプロトコルは、グルタミン酸検出用の蛍光センサ...

正常マウスおよびハンチントンマウスからの急性脳スライスにおけるグルタミン酸放出および取り込みの単一シナプス指標

このプロトコルは、哺乳類のNeuro-2a細胞株を用いたニューロンのニコチン性アセチルコリン受容体サブユニットの発現と定量を記述しています。pH感応蛍光タグと共焦点顕微鏡は、pH中性細胞内区画での受容体局在とpH中性細胞内区画での受容体の位置を正確に評価し、nAChRの輸送および薬理学的調節の研究を促進します。...

哺乳類細胞における細胞膜および細胞内ニコチン性アセチルコリン受容体の局在化

ケージド化合物の光分解は、様々な生理活性化合物の濃度の急激かつローカライズされた増加の生産を可能にする。ここでは、解離マウス嗅神経細胞における嗅覚情報伝達の研究のためのケージドcAMPまたはケージのCaの光分解を組み合わせたパッチクランプ記録を取得する方法を示します。...

嗅神経細胞の繊毛のケージド化合物のフラッシュフォトリシス

このプロトコルでは、カルシウムイメージングの最近の進捗状況を更新...

視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

ここでは、ショウジョウバエのアンテナの全マウント免疫染色のプロセスについて説明し、これにより、嗅覚受容体ニューロン(ORN)の多様化に関与する分子メカニズムをよりよく理解することができます。...

における嗅覚受容ニューロンのホールマウント免疫標識<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;アンテナ

学ぶニコチン性アセチルコリン受容体の機能解析法。マウス脳切片を用いたレーザーフラッシュ・フォトリシスとパッチクランプ記録により、コリン作動性シグナル伝達と神経細胞形態の関連を詳細に解明できます。

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