Name: 減法混色のゲノム解析による新規シーケンスの発見 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 学ぶ減法混色によるゲノム解析手法で、共精製配列から分離困難な新規シーケンスを発見する方法です。無料ソフトウェアを活用し、細菌ワクチン標的や未知ウイルス同定に応用可能です。

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著者は、さまざまな段階でキンカチョウ ゲノミクス プロジェクト援助のミシェル ビーダーマン、アリッサ ペダーセン、コリン J. サルダーニャを認めます。我々 はまたコンピューティング クラスターのシステム管理と NIH グラント 1K22CA184297 (J.R.B.) に、NIH NS 042767 (C.J.S) のエフゲニー ・ Bisk を認めます。

1 de novo組み立て開始シーケンス。
注: 次世代シーケンス (NGS) データはすべて使用できます、アセンブリは、それらのデータから製造できる限り。オックスフォード ナノポア読み込み fasta ファイルへの組み込みやイルミナ、PacBio が適切な入力データに含まれています。具体性について、このセクションは、イルミナ基づくトランスクリプトーム アセンブリを説明します7; を行ったキンカチョウ研究に固有ただしプロジェクトによって仕様が異なります注意してください。私たちのプロジェクトの例の生データは、MiSeq から派生した、約 1000 万ペアの読み取りは、各サンプルから得られました。
<ol><li>イルミナ アダプターと低品質拠点を削除する Trimmomatic 0.3214を使用します。コマンド ・ ラインを入力します。 java の jar trimmomatic 0.32.jar PE-phred33 forward.fq.gz reverse.fq.gz - baseout quality_and_adaptor_trimmed ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE.fa:2:30:10 リード: 3 トレーリング: 3 SLIDINGWINDOW:4:20 MINLEN:40
</li>
	<li>0.9.6 v. ナシ15を使用して、trimmomatic 出力ペアの読み取り、既定のパラメーターを使用して高品質のマージされた読み取りを作成します。コマンド ・ ラインを入力します。 梨 -f < quality_and_adaptor_trimmed_1P.fastq > r < quality_and_adaptor_trimmed_2P.fastq >
</li>
	<li>エラーを修正するため 1.116対使用爬虫類読み取り生産ナシ。17に記載されている手順のプロトコルに従ってください。</li>
	<li>2.4.0 対トリニティを使用18修正のシーケンスを作成するデフォルトのモードです。ストランド固有のライブラリを使用して、SS_lib_type パラメーター。出力は fasta ファイル (your_assembly.fasta) です。コマンド ・ ラインを入力します。 トリニティ - seqType fq - SS_lib_type FR-max_memory 10 G-Trinity_output - quality_and_adaptor_trimmed_forward_paired_reads.fq を左の出力-quality_and_adaptor_trimmed_reverse_paired_reads.fq-CPU 10 を右 注意: 出力は、Trinity_output、新しいディレクトリに配置されます、名前アセンブリは、必要な場合、Your_assembly.fasta として名前を変更することができます ' Trinity.fasta' になります。詳細については、三位一体のウェブサイトを参照してください: https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Running-Trinity。</li>
</ol>2. 爆発参照シーケンスに対してアセンブリ
メモ: 使用この手順アセンブリまたは長いが読み取りサンガー; のような生イルミナを読み取りそれが構成されている場合、読み取りをクエリにマップするためのステップ 3 以下を参照してください。ブラストのすべての手順は、コマンドは、任意の最近の爆発のバージョンで動作するはずが、バージョン 2.2.29+ で完了しました。
<ol><li>コマンドラインで参照シーケンス (nucleotide_reference.fasta) のブラスト データベースを作る。次のコマンド ・ ラインに入力してください。 makeblastdb - dbtype 難-nucleotide_reference.fasta の-nucleotide_reference.db を
</li>
	<li>ブラスト マッチ、リファレンス ・ データベースにクエリ アセンブリ (手順 1 で生成された)。出力ファイルを取得するを使用 [-BLAST_results.txt を] (Python のスクリプトと後続の処理手順に必要) 表形式の出力を生成する [outfmt - 6] を使用して、。これらのオプションは任意の順序で組み合わせることができます、コマンドがあるので例を完了 [blastn-your_assembly.fasta - db nucleotide_reference.db を照会-BLAST_results.txt outfmt 6 を]。E 値の設定が必要な場合は、たとえば [-「1e-6] と、適切な-「オプションを使用します。しかし、減法サイクル効果的に反転 evalue の議論で説明されているよう設定注意してください。</li>
	<li>増加の逼迫のため翻訳されたヌクレオチド爆発 (tBLASTn)、(ヌクレオチド) データベースの 6 方法の翻訳を実行するとブラスト クエリとしてアセンブリの蛋白質配列を使用します。ほとんど非モデル システムでは、不完全な蛋白質の注釈の問題を回避するにはこのメソッドをお勧めします。<ol>
<li>勉強して正しい遺伝コードが生物として選択されているを確認、- db_gencode オプション。クエリのためのタンパク質を得るためには、組み立てられたクエリ シーケンスから最長オープンリーディング フレームの特定 (3.0.1 v. TransDecoder パッケージ) から TransDecoder.LongOrfs コマンドを実行します。コマンドは [TransDecoder.LongOrfs -t your_assembly.fasta];出力は、ディレクトリ 'transcripts.transdecoder_dir' と呼ばれるに配置されます、your_assembly.fasta 内の各シーケンスから最長予測された蛋白質シーケンスを含む longest_orfs.pep という名前のファイルが含まれます。</li>
		<li>TBLASTn を使用するコマンドを実行 [tblastn-longest_orfs.pep - db nucleotide_reference.db を照会-BLAST_results.txt outfmt 6 を]。高品質の蛋白質の参照が利用可能な場合、タンパク質 BLASTp よりもむしろ tBLASTn とのマッチングを使用します。</li>
		<li>タンパク質参照のブラスト データベースを作る [makeblastdb - dbtype prot-protein_reference.fasta の-protein_reference.db を] し [blastp-longest_orfs.pep - db protein_reference.db を照会-BLAST_results.txt outfmt 6 を]。下流処理用ファイルとして結果を保存することを確認し、Python スクリプトが正しく解析できるように表形式 (outfmt 6) を使用します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. マップをアセンブリに読み取ります
注: 参照データセットを構成するものは、組み立てシーケンスではなく、生のゲノムの読み取りまたはサンガー順序、爆発 (ステップ 2.1) に使用するケースの場合は、このメソッドを使用することができます。
<ol><li>BWA を使用して-0.7.12 v. MEM19または bowtie220、クエリ アセンブリ上にダウンロードした raw 読み取り (raw_reads.fastq) マップします。出力は、.sam 形式になります。コマンドは次のとおりです: 最初アセンブリをインデックス: [bwa インデックス your_assembly.fasta] し、マップの読み取り [bwa mem your_assembly.fasta raw_reads.fastq > mapped.sam]。(注、' >' ここでシンボルが大きい-より; 代わりにそれがファイル mapped.sam に出力を指示します)。</li>
</ol>4 任意一致するシーケンスを削除する Python スクリプトを使用してください。
注: は、Python 2.7 スクリプト作業を提供しました。
<ol><li>次の手順 2、[./Non-matching_sequences.py your_assembly.fasta BLAST_results.txt] コマンドを使用して、減法の Python スクリプトを使用します。スクリプトを実行する前に、ブラスト出力ファイルの形式を確認 6 (表形式)。Fasta 形式で非整合シーケンスとファイルの名前 your_assembly.fasta_non matching_sequences_BLAST_results.txt.fasta とも your_assembly.fasta_matching_sequences_BLAST_ としてレコードのシーケンス一致するスクリプトを出力します。results.txt.fasta 非一致するファイルに、テストのための潜在的な T シーケンスのソースとさらに減法のゲノミクスのサイクルの最も重要ななります。</li>
	<li>次のステップ 3、としてを Python スクリプト removeUnmapped.py を実行ステップ 3.1 から .sam を入力し読み取りを一致することがなくクエリ シーケンスの名前を識別および新しいテキスト ファイルに保存されます。[./RemoveUnmapped.py mapped.sam] コマンドを使用して、出力は mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt になります。(プログラム削除すべてマップされていない読み取りとスリムダウン sam ファイルが生成されます。 このファイルはこのプロトコルのために無視することができますが、その他の解析の役に立つかもしれません)。</li>
	<li>前の手順の出力は、mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt と呼ばれるテキスト ファイルのシーケンス名のリストは、これらの配列を fasta ファイルを抽出: [./getContig.py your_assembly.fasta mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt]。出力は、mapped.sam_contigs_with_no_reads.txt.fasta と呼ばれるファイルになります。</li>
</ol>5. ままシーケンス用プライマーを設計します。
注: この時点で候補者 T シーケンスを含んでいる fasta ファイルがあります。この節では、qPCR 実験 T や R の未知の地域から来るかどうかをテストするには手順 4 で減算は、すべてのシーケンスを削除されている場合は最初のアセンブリは T が含まれていないまたは、減算は厳しすぎるかもしれない。
<ol><li>Geneious21を使用して、手動で最適なプライマー シーケンスを決定します。<ol>
<li>21-28 bp 前方のプライマーのための候補者のシーケンスを強調表示します。任意の底の 4 以上の実行は避けてください。すべてのヒト、かなり均一に組み合わせて地域をターゲットにしようと。1 つの G または 3' 端に C が有益であるプライマーをアンカーに貢献です。</li>
		<li>候補領域をハイライト表示するシーケンスの推定融解温度 (Tm) であることを表示する画面の右側にある [統計] タブをクリックします。繰り返しや G/C のロングランを避けながらの 55-60 ° C 間の溶融温度を得ることを</li>
		<li>5.1.1 の手順に従います。5.1.2 逆プライマーを選択するおり 150 250 塩基対前方のプライマーの 3'。プライマーの長さは一致する必要はなく、予測の Tm 前方のプライマーの Tm に可能な限り近い必要があります。補完する順序を逆にしてください (場合はシーケンスが強調表示されている Geneious を右クリックしメニュー オプションです)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>[シーケンス] ウィンドウ上部のツールバーにあるプライマー設計関数を使います。<ol>
<li>プライマー デザイン] ボタンをクリックします。[ターゲット地域を増幅する領域を挿入します。</li>
		<li>[特性] タブで、目的のサイズ、融解温度 (Tm) と %gc (5.1.1 の手順を参照してください)。 を挿入します。</li>
		<li>プライマーを生成する[ok]をクリックします。カスタム オリゴ サービスを通じてプライマーを注文します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tm と延長時間を最適化するために (T と R の両方をエンコード) コントロール DNA とプライマーを検証します。通常 Taq とゲル電気泳動を使用して、バンドのサイズが、qPCR 手順 6 内のメソッドを次の最適化を実行することも。<ol>
<li>プライマー 10 μ M の濃度にして前方および逆のプライマーの 10 倍希釈をようにします。</li>
		<li>5 の濃度を持つテンプレートあたり 25 μ L があるように dNTP の 0.5 μ L、前方のプライマーの 0.5 μ L、逆プライマーの 0.5 μ L、Taq のポリメラーゼの 0.1 μ L、テンプレート 2 μ L、マグネシウム 0.75 μ、バッファーの 2.5 μ L、水の 18.15 μ L の PCR ミックスを使用 ng/Μ L。</li>
		<li>PCR プログラムで異なる溶融温度でプライマーをテストします。通常、最適なパフォーマンスは予測 Tm、プライマーが、通常 60 ° C 以上を若干下回る観測湯温です。また、時の間にこのガイドを使用して最適な拡張機能のテスト: 1000 bp あたり 1 分 (したがって、私アンプリコンの長さに応じて通常 10 〜 30 秒)。</li>
		<li>プライマーは、予想されるシーケンスを増幅することを確認するエンドポイント ゲル電気泳動を行います。× 20 分間 200 V で 2% TAE agarose のゲルにグリセロール染料 6 の 5 μ L を混合 qPCR 製品の 25 μ L を実行します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>6 qPCR残りのシーケンスの検証。
メモ: 検証プライマーと PCR 条件ステップ 5 で確立したにこの手順が必要です。
<ol><li>次のミックスと 3 通の各テンプレートを実行します。PowerSYBR グリーン マスター ミックス 12.5 μ、10 μ M、10 μ M、水、10.5 μ、1 μ L (2 ng/μ L の濃度) のテンプレート DNA の濃度の逆プライマーの 0.5 μ L の濃度の前方のプライマーの 0.5 μ L、それぞれよく総量の 25 μ L が含まれるようにします。</li>
	<li>有効温度とステップ 4 から延長時間 qPCR プログラムを実行します。設計・ 2 段サイクル、10 分初期メルト、95 ° C に対応するすべてのプライマーを検証し、95 のサイクルの 40 ° C の 30 秒と 1 分の 60 ° C。ただし、3 段 (溶融アニール-拡張) プログラムはプライマーのより最適な場合があります、必要に応じて適応する必要があります。最終的な変化曲線が少なくともプライマー、DNA の単一製品の増幅を検証する qPCR で採用されて最初の時間で生成することをお勧めします。</li>
	<li>メジャー qPCR/SYBR グリーン シグナル アクチン (または他の適切な 'R' コントロール) を基準にして Ct. の平均と標準偏差 2 のすべてのケースを計算する-(遺伝子 Ct - β-アクチン Ct)。</li>
	<li>(省略可能)QPCR で正しい製品サイズ検知を確認するエンドポイント ゲル電気泳動を行います。ここでは、× 20 分間 200 V で 2% TAE agarose のゲルにグリセロール染料 6 の 5 μ L を混合 qPCR 製品の 25 μ L を実行します。</li>
</ol>7 します。 データをパレへの新しい参照を繰り返します。
注: ステップ 6 T から識別されたシーケンスの検証された場合、(図 2A) ここでサイクルを終了します。ただし、考慮の様々 な可能性があります、たとえば多くの R シーケンス ファイル内に保持または qPCR による候補 T 系列はどれも検証された場合にステップ 6 サイクルの継続に動機を与えます。
<ol><li>新しい参照を取得します。この手順では、サイクルの新しいイテレーションを有効にし、生ゲノム データ、生の RNA シーケンス データ、または他の組み立てられたデータセットに含めることができます。参照データの貴重な資源にはバイオ テクノロジー情報 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome) を格納する組み立て FTP (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/) を通じてアクセスできるゲノム センターでゲノム データベースが含まれて遺伝子発現オムニバス (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) 生次世代シーケンスを読み込む場所が格納されます。ゲノム プロジェクトは他のプロジェクトに関連付けられた web サイトやデータベースを使用しての塩基配列データにあります。</li>
</ol>

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<li>Coombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Complete+Sitka+Spruce+Chloroplast+Genome+Using+10X+Genomics%27+GemCode+Sequencing+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Complete Sitka Spruce Chloroplast Genome Using 10X Genomics' GemCode Sequencing Data.</a> Plos One. 11 (9), (2016).</li>
<li>Herschleb, J., Ananiev, G., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed-field+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Pulsed-field gel electrophoresis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 677-684 (2007).</li>
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減法ゲノミクスは強力なクッキー カッターのアプローチは、いくつかのキーの手順、および参照シーケンスとテスト サンプルの慎重な選択でカスタマイズすることではありません。クエリ アセンブリは、質の悪いは、フィルター処理の手順は、アセンブリのアイテムを分離する可能性がありますのみ。したがって、特定のプロジェクトを適切な検証プロトコルを使用してde novoアセンブリを徹底的に検証することが重要です。RNA シーケンス ガイドラインは、三位一体のウェブサイト18との DNA、REAPR23を使用できるようなツールを提供しています。もう一つの重要なステップ ブラストを使用する場合は、適切な e 値、リラックス感や厳しい減算されるかどうかを決定するの選択です。ただし、反転は、メソッドで発生します: 参照するより厳しい試合は実際により少なく厳しい減算、非整合シーケンスは引かれない。したがってより厳格な減算の爆発でより大きい (低く) e 値を使用する必要があります。プロトコルの最後の重要なステップは、参照の選択です。最大効率の参照は可能な...

このメソッドの目的は、新規ターゲット (T) ゲノム配列、DNA または RNA のゲノムのコンテキスト、または参照 (R) (図 1) からを識別するためにです。メソッドは、対象を物理的に分けることができない、またはそれはこれを行うに高価になる場合に最適です。いくつかの有機体だけ完全に終えた減算、ゲノム手法の重要な技術革新は計算の組み合わせと参照が完璧ではない場合、ターゲット シーケンスを隔離して研究者を有効にするサイクルまたは下書きにベンチ メソッド非モデル生物のゲノム。サイクルの終わりに、qPCR テストがより減算が必要かどうかを判断する使用されます。検証候補 T シーケンス qPCR で知られている T 陽性検体で統計的に大きい検出が表示されます。
ホスト同族体1,2,3、4を持っていない新規の細菌の創薬ターゲットの発見と感染したホストから新規ウイルスの同定法の化身が実装されています。5,6。T の識別に加えて、メソッドは r: 我々 は最近キンカチョウ参照ゲノムから 936 行方不明の遺伝子と生殖だけ染色体 (T)7からの新しい遺伝子を識別するメソッドを使用を向上できます。減法混色のゲノムは、T は非常に知られていたシーケンスから発散する可能性が高いとき、または T の id はキンカチョウ生殖制限染色体7のように、広義に特に有用です。
あらかじめ T の肯定的な同定を必要としない、減法のゲノム解析の主な利点は、バイアスです。最近の調査でリードヘッドらはアルツハイマー病と 4 つの脳領域でウイルス量との関係を検討しました。ウイルス同定のリードヘッドらは 515 ウイルス8、彼らの研究を識別することができるウイルス エージェントを厳しく制限のデータベースを作成しました。減法のゲノムが既知の病原に類似性にかかわらず、病と関連付けられる可能な新規ウイルスを分離するために健康とアルツハイマー病のゲノムを比較する使用されている可能性があります。263 の知られている人間を対象としたウイルス、約 167 万の未知ウイルス種存在人間9に感染する可能性を有するそれらの 631,000 827,000 と推定されています。
新規ウイルスの分離が減法エリア ゲノミクスは特に効果的で、いくつかの研究がこのような厳格なメソッドは必要ありません。たとえば、新規ウイルスの識別が抽出し、逆にウイルス シーケンス5の逆のトランスクリプションおよび BLASTx 続いて公平な高スループット シーケンスまたはウイルス核酸の充実を使用している研究を書き写すウイルス シーケンス6. 正しくこれらの研究は、 de novoシーケンスとアセンブリを採用、減算はターゲット シーケンスはブラストを積極的に識別されたので使用されませんでした。場合は、ウイルスが完全に小説と関連していない (または遠縁) 他のウイルスに役に立つテクニックの減法ゲノミクスとされています。減法混色のゲノミクスの利点は、完全に新しいシーケンスを得られることです。生物のゲノムが既知の場合任意のウイルスのシーケンスを残してを減算することができます。たとえば、私たちの出版された調査で7私たちの元の意図ではなかったが減法ゲノミクスによるキンカチョウから新規ウイルス シーケンスを分離しました。
減法混色のゲノムも抗生物質耐性1,2,3,4の劇的な上昇によって動機付けられて、細菌ワクチンのターゲットを識別するために便利な証明しています。自己免疫の反作用の危険性を最小限に抑えるために研究者は人間のホストで同族体を持つ蛋白質を差し引くことによって潜在的なワクチンのターゲットを絞り込みます。コリネバクテリウム類結節症、見て 1 つの特定の研究は可能な薬剤ターゲットが副作用につながるホストの蛋白質に影響を与えないことを確認するいくつかの細菌ゲノムから脊椎動物のホストのゲノムの減算を実行1これらの研究の基本的な仕事の流れは、細菌のプロテオームをダウンロード、の重要な蛋白質を確認、削除冗長なタンパク質、必須タンパク質を分離する BLASTp、BLASTp ホスト プロテオームに対してを使用してホストの同族体のタンパク質を削除。1,2,3,4します。 この場合、減法ゲノミクスは、ワクチン開発はホスト1,2,3,4オフのターゲットの任意の効果を持っていないことを確認します。
生殖制限染色体 (GRC) (この場合は T) の germlines にある最初の蛋白質コーディングの遺伝子を識別するために減法のゲノムを使用しましたが、両方のない体細胞組織男女10。この研究の前に、GRC について知られていたゲノムだけの情報は反復領域11だったDe novoアセンブリは、RNA から大人のキンカチョウと卵巣の組織 (R + T) からシーケンスで実行されました。発行体 (筋肉) ゲノム シーケンス (R1)12を使用してシーケンスの計算除去を行った、その raw (サンガー) 読むデータ (R2)、体 (脳) トランスクリプトーム (R3)13。3 つの参照の連続使用は、追加のフィルター処理が必要なことを示す (図 2A)、各サイクルのステップ 5 でテスト qPCR によって駆動されました。検出された α スナップ遺伝子は、DNA と RNA とクローニングおよびシーケンスから qPCR を通じて確認しました。例では、このメソッドは柔軟性を示す: それが核酸 (DNA 対 RNA) を一致するのに依存しないと参照 (R) を構成するアセンブリまたは raw 読み取りとその減算を実行できます。

<table><tbody><tr><td>Accustart II Taq DNAポリメラーゼ</td><td>Quanta Bio</td><td>95141</td><td></td></tr><tr><td>Blasicローカルアライメント検索ツール(BLAST)</td><td></td><td></td><td>https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki/Transcriptome-Assembly-Quality-Assessment</td></tr><tr><td>Bowtie 2</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://www.python.org/download/releases/2.7/ BWA-MEM v. 0.7.12</td><td></td><td></td><td>https://github.com/BenLangmead/bowtie2</td></tr><tr><td>Geneious</td><td></td><td></td><td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td></tr><tr><td>PEAR v. 0.9.6</td><td></td><td></td><td>http://www.mybiosoftware.com/reptile-1-1-short-read-error-correction.html</td></tr><tr><td>Personal Computer</td><td>Biomatters</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>http://www.geneious.com/ PowerSYBR qPCR mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Python v. 2.7</td><td></td><td></td><td>https://sco.h-its.org/exelixis/web/software/pear/</td></tr> <tr><td>Reptile v.1.1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>https://alurulab.cc.gatech.edu/reptile Stratagene Mx3005P</td><td>Agilent Technologies</td><td>401456</td><td></td></tr><tr><td>TransDecoder v. 3.0.1</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>https://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/ Trinity v. 2.4.0</td><td></td><td></td><td>https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/wiki</td></tr></tbody></table>

減法混色のゲノム解析による新規シーケンスの発見

Novel Sequence Discovery by Subtractive Genomics

減法混色のゲノムは、遺伝子、蛋白質、またはゲノムの文脈に埋め込まれている一般的な地域のシーケンスを特定すること任意の研究で使用できます。減法ゲノミクスにより包括的な配列と既知の遺伝的要素 (参照、R) を引き算することによって (T) の興味のターゲット シーケンスを分離する研究者です。メソッドは、ミトコンドリア、葉緑体、ウイルスなど新規シーケンスを識別する使用ことができますまたは生殖細胞、染色体の制限し T は r. で始まるされる包括的なゲノムのデータ (R + T) メソッドから簡単に分離することはできません、特に便利参照シーケンス、シーケンスに対して基本的なローカル配置検索ツール (ブラスト) を使用して、ターゲット (T) を残して対応する知られていたシーケンス (R) を削除します。最高の仕事に減算、R は、隆が欠落している比較的完全なドラフトをする必要があります。減算を量的なポリメラーゼの連鎖反応 (qPCR) をテストした後、残りのシーケンスから R を完了メソッドを使用する必要はありません。順番に複数の参照シーケンスを削除して、T の検索を絞り込む、必要に応じて反復することができますサイクルに実験手順の計算手順のリンクここ減法混色のゲノミクスの利点は、物理的な精製が困難、不可能、または高価な場合でも完全に新しいターゲット シーケンスを識別できることです。メソッドの欠点は減算のための適切な参照を見つけると T 陽性を得る負の qPCR のテスト用のサンプルと。キンカチョウの生殖制限染色体から最初の遺伝子の同定における法の実装について述べる.その場合、3 つの参照 (R)、以上 3 つのサイクルを順番に削除が関与して計算フィルタ リング: 不完全なゲノムのアセンブリ、生データをゲノム、トランスクリプトーム データ。

ブラストを実行した後、出力ファイルは、データベースに一致するクエリのシーケンスの一覧が。Python 減算後一致しないシーケンスの数を得、・ qPCR によってテストされます。この結果と次の手順を以下に示します。
負の結果。リファレンス ・ シーケンスに爆発後見ることができる 2 つの可能な否定的な結果があります。爆発の結果、合計シーケンスが参照する任意の類似シーケンスがないことを意味はないかもしれません。これはシーケンス サンプルの右参照シーケンスを選択する際にエラーがあります。別の可能性は (すべては離れて引かれて) 開始のアセンブリには一意のシーケンスがない、従って興味のシーケンスのない遺伝子が見つかった。参照がどこから来たかを確認し、クエリ アセンブリとして同じ組織でないことを確認します。
...

このプロトコルの目的は、ベンチの研究と計算の組み合わせを使用して、可能性がありますのみ部分的に知られている共同浄化のシーケンスから容易に分離できない新規シーケンスを検索することです。

Subtractive genomics can be used in any research where the goal is to identify the sequence of a gene, protein, or general region that is embedded in a ...

我々のプロトコルは、自己が部分的にしか知られていない可能性がある共精製配列から分離できないゲノム配列を同定するために使用することができるので、重要である。この技術の主な利点は、それは、柔軟性だけでなく、ダウンロードすることができる主にフリーソフトウェアを使用して、安価であるということです。多くの生物学的な質問に適用することができます。潜在的な用途には、細菌ワクチン標的の同定と、既知の微生物と配列が非常に異なるウイルスの同定が含まれる。この方法は、ゲノムターゲットを含まない参照配列が利用可能である限り、未知のシステムを実験的に分離できない任意のシステムに適用することができる。このテクニックは試行錯誤を要するので、忍耐は重要です。プログラムを撮影するのに問題が発生する場合があります。ここで説明するプログラムとは異なるプログラムを使用することができます。可能な限りユーザーマニュアルを使用してください。この方法の視覚的なデモンストレーションは、計算作業はコマンド ライン プログラミングの構造の基本的な理解に依存するため、役立ちます。まず、Trimmomatic 0.32 を使用して、イルミナ アダプタと低品質ベースを取り除く。Pear バージョン 0.9.11 を使用して、デフォルトのパラメータを使用して、トリミング出力ペアの読み込みから高品質のマージ読み込み値を作成します。その後、Reptile バージョン 1.1 を使用して、Pear を介して生成された読み取りを誤って修正します。最後に、トリニティバージョン2.4.0をデフォルトモードで使用して、修正されたシーケンスを組み立てます。ストランド固有のライブラリの場合は、SS_lib_type パラメータを使用します。出力は、TRINITY_OUTPUTと呼ばれる新しいディレクトリに置かれるFASTAファイルです。参照シーケンスの BLAST データベースをnucleotide_referenceします。コマンド ラインで fasta を指定します。BLAST は、参照データベースにアセンブルされたクエリと一致しました。出力ファイルを取得するには、BLAST_resultsを使用します。txt Pythonスクリプトでのサブシーケンス処理ステップに必要な表形式出力を生成するには、outfmt6を使用してストリンジェンシーを増加させるために、ヌクレオチドデータベースの6ウェイ翻訳を行う翻訳ヌクレオチドBLASTを用いたBLASTクエリとしてアセンブリからのタンパク質配列を使用する。クエリのタンパク質配列を取得するには、TransDecoder を実行します。long0rfs コマンドは、組み立てられたクエリ シーケンスから最長のオープン読み取りフレームを識別します。今、tblastnを実行します。必要に応じて、適切なコードオプションを使用して研究されている生物に正しい遺伝コードが選択されていることを確認db_gencode。高品質のタンパク質参照が利用可能な場合は、tblastnではなくブラストと一致するタンパク質タンパク質を使用するタンパク質参照のBLASTデータベースを作成します。結果を下流処理用のファイルとして保存し、表形式の出力を使用して Python スクリプトが正しく解析できるようにします。次に、一致するシーケンスを削除するには、減算 Python スクリプトを使用します。読み取りをアセンブリにマップするには、BWA-MEM バージョン 0.7.12 またはボウタイ 2 を使用して、ダウンロードした生読み取りをクエリ アセンブリにマップします。まず、アセンブリにインデックスを付け、次に読み取りをマップします。出力は SAM 形式になります。Python スクリプトを実行してマップ解除します。入力として SAM ファイルを使用して py.これにより、一致する読み取りなしでクエリ シーケンスの名前が識別され、新しいテキスト ファイルに保存されます。前の手順の出力は、txt ファイル内のシーケンス名のリストです。これらのシーケンスを使用して FASTA ファイルを抽出します。出力は、fasta ファイルになります。Genius を使用して、最適なプライマー シーケンスを手動で決定します。前方プライマーの 21 ~ 28 の基本ペアの候補シーケンスをハイライト表示し、4 つ以上のベースの実行を回避します。すべての基本ペアのかなり均一な組み合わせでリージョンをターゲットにしてみてください。3つのプライムエンドで単一のGまたはCが有益であり、プライマーを固定するのに役立ちます。画面の右側にある[統計]タブをクリックすると、候補領域がハイライト表示されるシーケンスの推定融解温度が表示されます。55〜60°Cの融解温度を目指し、繰り返しを避けながら、G C.のロングランは、前方プライマーの3つのプライムに位置する150〜250塩基対に位置し、同じ方法で逆プライマーを選択します。プライマーの長さが一致する必要はありませんが、予測される融解温度は、フォワードプライマーの温度にできるだけ近いはずです。シーケンスがメニューオプションでハイライトされている間にGeniusを右クリックして、シーケンスを元に戻してください。別の方法として、シーケンスウィンドウの上部のツールバーにある「プライマーデザイン」機能を使用する方法もあります。ターゲット領域の下に増幅する領域を挿入します。[特性]タブで、必要なサイズ、融解温度、パーセントGCを挿入し、[OK]をクリックしてプライマーを生成します。残りのシーケンスの定量PCR検証を実行するには、まず、SYBRグリーンマスターミックス、フォワードプライマーとリバースプライマー、および水を使用して、25マイクロリットルの合計容量に対して、三重化中の各テンプレートの反応混合物を調製します。以前に検証された温度と延長時間によって通知されたqPCRプログラムを実行します。最終変性曲線は、少なくともプライマーが単一のDNA産物の増幅を検証するためにqPCRで初めて使用される場合に生成されるべきである。Ctによるアクチンに対するqPCR SYBRグリーン信号を測定する すべての場合について、アクチンに対するCtに対する2つの平均と標準偏差を計算します。エンドポイントゲル電気泳動を行い、qPCRによる正しい製品サイズ検出を確認する。ここでは、200ボルトで200ボルトの200ボルトのアガロースゲルに6Xグリッタール染料の5マイクロリットルと混合qPCR製品の25マイクロリットルを実行します。qPCR でターゲットシーケンスが特定されていない場合は、オンライン データベースから取得できる新しい参照でサイクル全体を繰り返します。この場合の減算プロジェクトは、男性と女性の成人シマウマフィンチの胚芽が並ぶ組織からRNAをシーケンシングすることから始まった。最終的に、これまで全ゲノムアノテーションに含まれていなかった935個の体細胞遺伝子が同定された。計算フィルタリングの後、定量PCRは、鳥組織間の検出に違いがなかった負の結果をもたらす可能性があります。逆に、ゲノムDNAqPCRが参照に対して、関心のある組織において統計的に大きな検出を示す場合、真の標的配列の同定を表す陽性の結果が確認される。ここで、αスナップ遺伝子は、アクチンと同等のレベルが存在する精巣DNAに対して体細胞組織で枯渇したため、生殖細胞系に制限されていることが検証された。各計算手順で正しい入力を使用することが重要です。ターゲットシーケンスを取得するために、サイクル減算を複数回実行する必要があります。発見された遺伝子に対して、様々な系統学的、構造的、および機能的な分析を行うことができます。これらの追加の方法は、遺伝子の進化的および機能的役割に関する洞察を与える。生殖細胞系に制限されたソングバード染色体の最初の遺伝子を同定し、この驚くべきゲノム要素への関心を広げた。その後の研究は、多くの追加の遺伝子を含む多くのソングバード種で同様の染色体を示した。

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Research

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