シンプルかつ強力な可視化と薬理学的ターゲットの評価法として放射線写真法
2019年3月12日
オートラジオグラフィー法は質的または量的薬理学による組織切片にイメージングに関する基礎的バインディングを研究する使用します。
オートラジオグラフィーは、標的に対して特定の放射線リガンドを使用して組織中のタンパク質結合部位の分布を研究するための強力で簡単な技術です。免疫検査に代わるのにも適しています。この技術は、従来のフィルム露出よりも高速なデジタル画像を介して空間分解能を用いてタンパク質発現を可視化する。
また、タンパク質標的の薬理学的分析に使用してもよい。この方法は、ガラスに取り付けられたマウス組織を含むが、他の種に拡張されるか、あるいはカバースリップで増殖した細胞に拡張することができる。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の博士課程の学生、ナネ・グレム=クレイです。
まず、粉末ドライアイスに組織を沈め、凍結します。凍結した組織を、マイナス20度に設定されたクライオスタットに直接移します。凍結スタットで20分マイナス20度に組織を順応させます。
次に、凍結スタットの外側に埋め込み培地で組織ホルダーを覆い、埋め込み培地がまだ液体である間、すぐに凍結した組織標本を所望の方向に置きます。組織ホルダーをクライオスタットに戻し、埋め込み培地をマイナス10°C以下の温度に曝して硬化させます。凍結スタットのミクロトームに組織ホルダーを置きます。
傾斜した切片を避けるために、組織の向きを調整します。所望の厚さのセクションで立体性アトラスの指導で組織を切断し、必要に応じて小さなブラシでセクションを展開します。顕微鏡のスライドにセクションを取り付けます。
次に、目的の技術的な繰り返しのために、関心のある領域からセクションを順次収集します。スライドのセクションを1時間空気乾燥させてから、さらに処理します。認定された放射能研究所では、鉛筆を使用してスライドに実験条件のラベルを付けます。
スライドをプラスチックトレイに水平に配置します。対象に合わせて適切な SA バッファをスライドに取り付けたセクションに慎重に適用します。各セクションが完全にカバーされていることを確認します。
非特異的結合の決定のために、非標識化合物の関連濃度でSAバッファーを補う。その後、蒸発を避けるために蓋でトレイを覆います。20rpmにセットされたプレートシェーカーで30分間、関連温度で予熱する。
次に、各スライドからプレインキュベーション液を注ぎ、スライドをプラスチックトレイに戻します。直ちにSAバッファー内の放射性リガンドの関連濃度でセクションを完全にカバーします。非特異的結合の決定のために、非標識化合物の関連濃度で放射性リガンド溶液を補う。
蓋でトレイを覆い、20 rpmで一定の穏やかな揺れで所望の条件下でインキュベートします。この後、インキュベーション溶液を注ぎ、スライドを顕微鏡スライドラックに移します。すぐにスライドを洗ってください。
GHBプロトコルの場合、氷冷SAバッファーで20秒間洗浄し、スライドラックを氷冷蒸留水で満たされたトレイに浸して2回洗い流します。スライドをラックに垂直に配置し、空気乾燥を少なくとも 1 時間は使用します。次に、パラホルムアルデヒドを含む固定剤にスライドを移し、室温で一晩固定します。
翌日、スライドを室温でシリカゲルを含むデシケータボックスに移します。水分を除去するために、デシケーターボックスにスライドを3時間放置します。まず、切片を、組織を上に向けた放射線遮蔽イメージングプレートカセットに入れる。
放射性リガンと結合の後の定量のためにすべてのカセットに放射性マイクロスケールを含める。使用直前に、トリチウム感受性蛍光体イメージングプレートを蛍光イメージングマシンにロードし、メーカーの指示に従って可視赤外線に露出して消去します。次に、蛍光体イメージングマシンからイメージングプレートを取り出し、すぐにカセット内のセクションに置きます。
カセットが完全に閉じられていることを確認します。光から遮光しながら室温での最適な露光時間のために、このセクションを蛍光イメージングプレートに露出させます。露光後、暗い中でカセットを慎重に開け、すぐに蛍光体の画像装置の暗い箱に画像板を移します。
デジタル画像を得るために可能な限り最高の解像度でプレートをスキャンします。まず、適切な画像解析プログラムを開きます。メニュー項目領域決定を選択して、キャリブレーション規格ごとの相対的な光学密度を決定します。
領域作成用のツールを選択し、それを使用して、放射性マイクロスケールの各ポイントに等しいサイズの領域を選択します。メニュー項目のラベルの下の番号をクリックして、選択した各領域に番号を割り当てます。[ファイルエクスポート]、[2D リージョン レポート]の順にクリックして、キャリブレーション規格の各ポイントの OD 値をエクスポートします。
独自のイメージングソフトウェアでは、領域作成ツールを使用して、すべてのセクションで対象領域を選択し、そのODを測定してオートラジオグラムの定量化を開始します。各セクションで、対象領域のテンプレートを作成してコピーし、各オートラジオグラムの脳の解剖学の小さなバリエーションに合わせて調整することで、同じ領域を選択します。その後、[ファイル エクスポート 2D 領域レポート] をクリックして、選択した領域の ROD 値とサイズをスプレッドシートにエクスポートします。
テキストプロトコルで概説されているように、ラジオリガンドの結合を決定します。本研究では、高親和性GHB結合部位の解剖学的分布を、コロナ、矢状、および水平切片に切断したマウス脳の放射標識GHBアナログ放射性HOCPCAで可視化する。海馬と皮質では高レベルの結合が見られ、線条体では低い結合レベルが見られ、小脳では結合は検出されない。
ここに示すように、解剖学的構造は異なる平面を用いて視覚化され、解剖学的完全性はクレシルバイオレット染色によって支持され得る。ラット、マウスおよびブタの代表的なオートラジオグラムは、哺乳類の脳における高親和性GHB結合部位の進化的保全を示す。放射性HOCPCA結合部位は、それら間の総脳解剖学の比較を可能にする3種すべてで検出される。
高親和性GHB結合部位は、結合部位に対して異なる親和性を示すが、同等の特定の活動を示すGHB放射リガンドで調査される。放射性HOCPCAは高感度で、ノイズ比に優れた信号を与えられる。放射性NCS-382の感度が低いため、同様のレベルの結合を得るためには、より高い放射性リガンド濃度を使用する必要があります。
放射性GHBが同等の結合レベルを達成するには、さらに高い放射性リガンド濃度が必要です。しかし、高い放射性リガンド濃度はまた、結果的に低い信号対雑音比で非特異的結合のレベルを増加させる。放射リガンド濃度、洗浄、暴露時間などのアッセイ条件を最適化して、ノイズ比に対する最良の信号を得ることが重要であり、プレートを以前に消去することも非常に重要です。
この手順は、発見プロジェクトに役立つ可能性のある生きている動物の化合物結合に関するアイデアを得るためにin vivo条件に拡張することができます。放射線活性やパラホルムアルデヒドを扱う際には、認定された完全な放射性物質を持つ実験室で働き、防護服を着用することを忘れないでください。
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概要
この研究は、組織切片における放射性リガンド結合の定量化のための効果的な技術として、オートラジオグラフィーを実証しています。マウス組織を使用することで、高い空間分解能で結合部位を可視化し、従来のイメージング手法よりも迅速な代替手法を提供します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 薬理学
- 神経科学
- イメージング技術
背景
- オートラジオグラフィーは、タンパク質結合部位の分布の検査を可能にします。
- 免疫組織化学の適切な代替手法として機能します。
- この手法は従来の方法よりも高速なデジタル視覚化を提供します。
- この技術は薬理学的分析にも利用できます。
研究の目的
- 組織サンプルにおけるオートラジオグラフィーの手順を説明すること。
- タンパク質発現の可視化における空間分解能を実証すること。
- 様々な脳領域における結合位置の違いを強調すること。
使用した方法
- 急速凍結され、切片化されたマウス組織を使用しました。
- オートラジオグラフィー手法は、組織切片に放射性リガンドをラベル付けし、インキュベーションすることを含みます。
- 重要なステップには、組織の準備、インキュベーション、洗浄、そしてイメージングが含まれます。
- 結合を定量化するために、リン光イメージングプレートを使用してデジタルイメージングを行いました。
主な結果
- 高親和性GHB結合部位の明確な解剖学的分布が観察されました。
- 海馬と皮質で高い結合レベルが確認されました。
- 被殻では低い結合レベルが認められ、小脳では結合は検出されませんでした。
- この研究は、異なる平面にわたる解剖学的構造の主要な視覚化を提供しました。
結論
- この研究は、組織におけるタンパク質結合の可視化のための強力なツールとしてオートラジオグラフィーを強調しています。
- 脳領域全体における結合部位分布の理解を深めます。
- この手法は薬理学的評価と神経学的メカニズムの理解に情報を提供する可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Autoradiography enables precise visualization and quantification of pharmacological target distribution in tissue sections, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The method provides spatially resolved binding data that informs ligand selectivity and affinity measurements, directly impacting lead identification and portfolio triage decisions. Its compatibility with multiple species and tissue types enhances translational continuity from discovery through preclinical assessment.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Visualizes anatomical distribution of high-affinity binding sites to interrogate therapeutic hypotheses and clarify target engagement.
- Operational Value: Enables pharmacological characterization of ligand affinity through Kd, Ki, and Bmax measurements in selected tissues.
- Strategic Value: Supports predictive confidence by quantifying target density and selectivity across brain regions for go/no-go decisions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative autoradiograms with high spatial resolution for reliable compound evaluation in validated biological systems.
- Operational Value: Standardizes binding assay parameters including radioligand concentration, washing, and exposure time to optimize signal-to-noise ratios.
- Strategic Value: Facilitates assay reproducibility and scalability across species (mouse, rat, pig) demonstrating evolutionary conservation of targets.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates evolutionary conservation of high-affinity GHB binding sites across mammalian species, supporting cross-species target validation.
- Operational Value: Enables comparison of gross brain anatomy between species using consistent radioligand binding patterns.
- Strategic Value: Informs risk-adjusted advancement decisions by providing binding site distribution data relevant to neurological mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing quantitative binding data that supports mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing target distribution in distinct anatomical structures.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized incubation, washing, and imaging protocols that yield reproducible quantitative outputs.
- Analytics: Enables measurement of relative optical densities and region-of-interest quantification for comparing binding levels across conditions.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity by demonstrating target conservation across species and anatomical planes.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for pharmacological target characterization applicable to diverse discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through target localization and ligand selectivity characterization reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of binding assays across tissue types and species.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk via early target validation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative binding site density and distribution data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in radioligand handling, tissue sectioning, and radioactive material safety protocols.
- Dependent on specialized instrumentation including cryostat, phosphor imaging plates, and image analysis software for quantification.
- Necessitates cross-team standardization of binding assay parameters such as incubation temperature, washing steps, and exposure times.
- Involves adaptation considerations across model systems including tissue mounting, section thickness, and blocking agents for non-specific binding.
- Includes practical limitations such as the need for certified radioactivity laboratories, signal-to-noise optimization, and careful selection of radioligand concentration to minimize non-specific binding.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:46
Tissue Preparation by Cryosectioning
2:13
In vitro Autoradiography
4:44
Exposure to Phosphor Imaging Plates and Scanning
6:04
Densitometric Analysis of Digital Image
7:34
Results: Visualization and Characterization of Pharmacological Targets Using Radiography
9:34
Conclusion
![[11C]SNAP-7941の自動合成とリアルタイム運動評価の技術的側面](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F59557.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A20.746Z&w=384&q=75)
