Name: うり fioriniae水やクロロホルム ベースのブルーベリーとクランベリーの花エキスの開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: 学ぶColletotrichum fioriniaeの発育モニタリング法。ブルーベリーとクランベリーの花エキスを用いた水やクロロホルムベースの抽出技術で、植物病原菌の動態をリアルタイムに評価する実験手法を解説します。

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サポート、ウィリアム s. ヘインズ、シニア恵まれているクランベリー研究基金とニュージャージー州ブルーベリーとクランベリー研究会に感謝します。またジェニファー Vaiciunas (指導及び花の準備)、クリスティン Constantelos (真菌文化と花の準備)、デヴィッド ・ ジョーンズ (花の準備と抽出)、ラングレー子 (花の準備、撮影/写真撮影)、ジェシーに感謝します。リンチ (花の準備)、ロクサーヌ Tumnalis (一般的なサポート)、および多数の学生/夏インターン。

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著者が明らかに何もありません。

C. fioriniae花エキス (FEs) レスポンスを検出生物検定は腐 pathosystems ブルーベリーとクランベリーの果実のため開発が他の園芸作物に容易に適応することができます。上記の詳細なプロトコルなど、多くの重要なデータ セットを取得するのに貴重なされましたが、これらに限定されない: 多数の病原体、様々 なフェスの存在下での真菌の成長段階に係る時間コース情報の複数の分離に及ぼす FE抽出法の比較、 c. fioriniaeの生長と分化、個々 の花の器官の評価に個々 の化学物質の検査を抽出、 C. fioriniae前で FE、効果に及ぼす温度の影響フェノロジー依存ワックス抽出および花雨水の効果。これらの技術を使用して生成されたデータはまたc. fioriniae生活のより明確に理解の段階、部分的に開花期間が多く果実腐敗の病原体の制御に非常に重要な理由を解明します。
最初に、すべての花が同じ、アクティブに処理された-FE, しかし、抽出プロセスが全体の花を使用してに向かって移動します。花の解剖時間がかかり、結果 FEs の生体活性に非常に小さな効果をあった。ただし、個々 の花器できがされてリリースされたの結果可能性があります評価を使用してこのプロトコルが細心の注意は、これとして (補足ムービー 12.3 の手順で詳細な注意事項)、花の組織を完全に漬け込むに取られなければなりません。菌類-毒性/静的微視的評価をゆがめる可能性のある鉄に化合物。以下のパスなど侵襲的な抽出 FE (補足の映画 2) rw FE、今より有利な買収の容易にするため。さらに、これらの抽出技術は真空ろ過のみ生物活性花化学手掛かりを取得するを必要があります。
すべて抽出利用花通常 0 - 3 冷却していた抽出準備日前。このプロトコルの挑戦は、FE の転換 (抽出物のストレージを使用してフィールド コレクション) の時間管理です。これは、複数のソースおよび日付から多数のサンプルでさらに悪化しました。冷凍花評価されていない任意の実際の範囲に劣化や変色した解凍花が表示されます。ただし、一度凍結を繰り返す水ベース フェスの準備が、融解を示している効果に、生物検定準備 (実行可能な 3 歳 FE) の後は鉄、FE として限り生物活性は凍結迅速に。
クロロホルムを用いた抽出では、病原体応答ガラス coverslips に ch FE 蒸発によって二次元で三次元の花/果実表面ワックスの調査を実行できます。しかし、ch FE から作製したワックスの実際の結晶構造が元が収集された表面に同一であるそうです。真菌の応答特定のワックス構造体内の調査の主な焦点は、する場合、意味、補足的な技術を実装する必要があります。抽出液のクロロホルム ベースでは、水ベースの抽出よりもストレージ メンテナンスを必要があります。暗闇の中で ch FE 抽出物を保つこと、に加えて PTFE ライニング細胞培養チューブ キャップとパラフィルム蒸発漏れを定期的にチェックする必要はラップをシールと必要に応じて交換してください。
花の雨水流出の特性を監視の概念は、サイト固有の病気の監視ツールを進める考えに根ざしています。雨水収集装置は、コレクション デバイス キャプチャ雨水が花から実行した限り、他の多くの植物のアーキテクチャに合わせることができます。この方法では、かどうか花刺激が任意の時点で、フィールドで存在しシーズンを通して監視することができますについて説明します。また、収集装置はどれ花キュー洗浄されている任意の中に濡れイベントを決定する複数のおおい場所に展開できます。将来的に実験、殺菌剤のアプリケーションが開始する必要があり、無事に終了することができますと rw FE が決まります。また、フェノロジー依存ワックス抽出 (プロトコル セクション 9) を監視することによって病原体の生物学を開花期間の重要性がさらに明らかになっています。そのセクションは一時的に分離されているホストの表面ワックスのサイド ・ バイ ・ サイド比較を可能にするメソッドを提供する、これらの生物検定の柔軟性を示すにも含まれていた。花の抽出技術と生物検定を使用して生成されるデータは、病原体の刺激、病原体の生物学、および将来制御戦略のためのターゲットに重要な特定の化学の授業の具体的な指標を表します。

うり fioriniaeハイブッシュブルーベリー (スノキ corymbosum l.) の大規模なアメリカのクランベリー (対 macrocarpon ・ エイ トン)1,2果実腐敗が発生します。この病原体は、炭疽病種複雑な3,4,5,6から線引きは最近、ブルーベリー炭疽病の病原とクランベリーの果実腐敗のメンバー多数他の植物病気世界中7を引き起こすだけでなく、複雑です。C. fioriniaeは、果実が成熟9の最終段階になるまでない明らかになって花と症状の開発中に発生する感染症と潜在、hemibiotrophic ライフ スタイル8を持っています。ブルーベリー、クランベリー果実腐敗だけ十分に開花期間中に行われた殺菌剤のアプリケーションで制御されます。病原体は休眠ブルーベリー花芽スケール10 overwinters し、花の中に sporulates。分生胞子は雨のしぶきの分散11,12を介してキャノピー全体で移動され、接種材料の蓄積と開花期間13に強く相関しています。花はシトラス ポスト花果実の成分ドロップ (PFD)14としてイチゴ炭疽病15、どちらの場合も原因の重要なホストの花に炭疽病菌の応答はスノキ属に一意ではありません。感受性に病原体。これらすべてのケースは、 C. fioriniaeと花の中に感染する他の病原体の化学的手掛かり花のダイナミクスを評価する効果的な方法の必要性を強調表示します。ここで説明する方法によって与えられる洞察は、ますます貴重になっています。
このプロトコルは花エキス (FE) 調達の方法の詳細し、ガラス coverslip 生物検定15,16を介してc. fioriniae FE に対する評価をガイドします。花の抽出技術は 2 つの主なタイプに分類されます。水ベースの抽出 (アクティブ-FE、パッシブ(パス -FE)、およびフィールド雨水ベース (rw-FE))、およびクロロホルム ベース (ch-FE)17抽出。水ベースの抽出水動員花化学手掛かりの検査を可能にします。これらの動員手がかり FE は大きく感染16、発生する感染に必要な水分を提供することに加えての速度を増加するので感染裁判所の可能性が高い重要部品であります。さらに、彼らは花の刺激は、ブルーベリーと他作物システム14,16以前観測として濡れイベント中にキャノピー全体洗浄することより自然な条件を表します。クロロホルム ベース花抽出 (ch FE) また提供ホストの表面の病原体応答に関する貴重な情報ワックス17,18, 一度影響を受けやすい上に堆積した分生胞子の初期成長段階を解明ホスト器官 (すなわち花、卵巣、発展途上のフルーツ)。病原体応答ホスト表面ワックスの季節的変化には、このプロトコルを使用しても監視できます。したがって、生物検定はこれらの 2 つの材料間違いを軽減する水ベースの FE またはクロロホルム ベースの FE のいずれかの操作に合わせて調整します。
水ベースの抽出がクロロホルム ベース抽出より二次 3量のハイレベルを刺激する生物検定から生成されるデータが明らかに複数の化合物したがって十三決定的な付着器の応答があった、FE の存在。興味深いことに、時花の表面から洗浄することが複数の刺激物質を示す、ブルーベリーとクランベリーの花から実行していた雨水を使用してこれらの生育反応の両方が観察されました。したがって、花の刺激のための監視の農業システムに病原体の成功確率見識を提供します。
このプロトコルの究極の目標は生成花化学手掛かり、に応えて真菌植物病原菌の生物についてはベースライン方法論としてこの花情報の支援を利用できる開始の方法論を提供するために、します。部位特異的疾患の管理と意思決定のプロセス。

<table><tbody><tr><td>0.22 以上m細孔サイズ、アセテート滅菌</td>フィルターVWR101102-280<td></td><td></td><td>ブルーベリー花抽出物(FE)の明確化&nbsp;</td></tr><tr><td>200-1000 &マイクロ;チップ付きlピペット</td> <td>-</td><td></td> <td>機器、範囲内の任意のメーカーは、適切な</td></tr><tr><td>40-200&microになります。チップ付きlピペット</td> <td>-</td><td></td> <td>機器、範囲内の任意のメーカーは、適切な</td></tr><tr><td>5-40&マイクロになります。lチップ付きピペット</td><td>-</td><td></td><td>-機器、範囲内の任意のメーカーは、</td></tr><tr><td>接続アダプター付きエアスプレーガン使い捨てペイントスプレーカップ&nbsp;適切です。</td><td>港湾貨物</td><td>97098</td><td>ブルーベリー雨水 (rw-)FE コレクション</td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td>アムスコ</td><td>3011</td><td>機器、メディア準備</td></tr><tr><td>バーメッシュマット (プラスチックメッシュシート)</td><td>Winco</td><td>BL-240</td><td>パッシブ (パス)-FE コレクション</td></tr><tr><td>ベンチトップタイマー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>06-662-47</td><td>機器、FE準備</td></tr><tr><td>ブラックプレッシャー/バキュームホース</td><td>VWR</td><td>62994-795</td><td>真空フィルター部品</td></tr><tr><td>ブフナー漏斗</td><td>クアー</td>ズ <td>USA 60240</td><td>真空フィルター部品、55 mm 濾紙ディスクを受け入れる</td></tr><tr><td>ブンゼンバーナー&nbsp;&nbsp;</td><td>●</td><td></td><td>設備</td></tr><tr><td>炭酸カルシウム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>C64-500</td><td>培地成分</td></tr><tr><td>遠心分離</td>機<td>用ソーバル&nbsp;</td><td>RC 5B Plus</td><td>機器</td></tr><tr><td>遠心分離管 (15 ml)</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>05-527-90</td><td>機器</td></tr><tr><td>遠心分離管 (50 ml)</td><td>VWR</td><td>10025-694</td><td>機器、rw-FE コレクション</td></tr><tr><td>チーズクロス (グレード 50)</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>AS240</td><td>機器、FE 製剤</td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>VWR</td><td>JT9175-3</td><td>化学、トリクロロメタン:アッセイグレード、&ge;純度99%、分子生物学用、過酸化物フリー</td></tr><tr><td>コーンミール寒天培地(CMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11132</td><td>&nbsp;プレミックスメディア、傾斜した分離保管</td></tr><tr><td>コットンブルーステイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61335</td><td>ラクトフェノールコットンブルーステイン</td></tr><tr><td>Difco 寒天</td><td>VWR</td><td>90004-032</td><td>メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>ドリルプレス</td><td>デルタ</td><td></td><td>機器、rw-FEコレクション</td></tr><tr><td>EASYpure LF 超純水</td><td>バーンステッド</td><td>D738</td><td>機器、脱イオン水源</td></tr><tr><td>エタノール (95%)</td><td>●</td><td></td><td>ケミカル</td></tr><tr><td>フィルターフラスコ(500ml)</td><td>パイレックス</td><td>No.5340</td><td>真空フィルター部品</td></tr><tr><td>ヒュームフード</td><td>ハミルトン</td><td>-</td><td>装置、クロロホルム使用</td></tr><tr><td>漏斗(7×7cm)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>60820-110</td><td>クランベリーRW-FEコレクション、FE調製</td></tr><tr><td>ジェネリックガラススライド&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-038-101</td><td>バイオアッセイコンダクタンス</td></tr><tr><td>汎用プラスチックポンプスプレーボトル</td><td>VWR</td><td>16126-454</td><td>パスFEコレクション、少なくとも250mlの容量</td></tr>ガラス<tr><td>細胞培養チューブ</td><td>-</td><td>-</td><td>ch-FE</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ(22 x 22 mm)</td>の保管フィ<td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>12-542B</td><td>バイオアッセイコンダクタンス</td></tr><tr><td>ガラスVan Tieghem細胞(ハンドカットガラスチューブ)</td><td>-</td><td>-</td><td>クロロホルム(ch)-FEバイオアッセイ、(外径8 mm、内径6 mm)</td></tr><tr><td>ガラスピペット(1-100 &micro;l)</td><td>ハミルトン(株)</td><td>#710</td><td>ch-FE バイオアッセイ</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>ラクトフェノール コットンブルーステイン</td></tr><tr><td>血球計算盤</td><td>Bright-Line</td><td>5971R10</td><td>装置</td></tr><tr><td>乳酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W261106</td><td>ラクトフェノール コットンブルーステイン</td></tr><tr><td>層流フード</td><td>Labconco</td><td>3730400</td><td>機器・無菌 作業環境</td></tr><tr><td>金属プローブ(ジェネリック)&nbsp;</td><td>●</td><td></td><td>装備&nbsp;</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ (2 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td>水処理混合物の保管と調製</td></tr><tr><td>顕微鏡、ライカ DMLB</td><td>ライカ</td><td>020-519.010</td><td>機器</td></tr><tr><td>モルタル (セラミック)</td><td>クアーズ USA</td><td>60313</td><td>真空フィルター部品</td></tr><tr><td>ニトリル手袋&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>19-130-1597D</td><td>フラワーコレクション</td></tr><tr><td>ペーパーディスク(カットペーパータオル)</td><td>オフィスバイオ</td><td>アッセイの湿度制御</td><td>KCC01510</td>基本</tr>パラ<tr><td>フィルム</td><td>ビーミス</td><td>PM-996</td><td>プラスチックパラフィンフィルム&nbsp;</td></tr><tr><td>乳棒(セラミック)</td><td>クアーズUSA</td><td>60314</td><td>真空フィルターコンポーネント</td></tr><tr><td>フェノール結晶フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>A92-100</td><td>ラクトフェノールコットンブルーステイン</td></tr><tr><td>ビニール袋(~100 mm X 152 mm)</td><td>Uline</td><td>S1294</td>機器<td>、花冷蔵</td></tr><tr><td>プラスチック細胞培養皿(直径9 cm)&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB0875712</td><td>(シャーレ)、バイオアッセイコンダクタンス</td></tr><tr><td>ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)ライニングキャップ&nbsp;</td><td>VWR</td><td>60927-228</td><td>ch-FE</td></tr><tr><td>Pyrex ビーカー (100 ml)</td> の保管パイ<td>レックス</td><td>No. 1000</td><td>ch-FE</td></tr><tr><td>パイレックス ブレッドパン</td>の準備<td>-</td><td>-</td><td>パス-FE コレクション</td></tr><tr><td>パイレックス メス シリンダー</td><td>-</td><td>-</td><td>機器、FE 準備</td></tr><tr><td>密閉プラスチック容器 (30 mm X 13 mm X 7 mm)&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>バイオアッセイコンダクタンス</td></tr><tr><td>シャープポイント解剖ハサミ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>8940</td><td>チーズクロスとペーパーディスクをカットするための機器</td></tr><tr><td>ステンレス製メッシュストレーナー</td><td>VWR</td><td>470149-756</td><td>ch-FE</td></tr><tr><td>の準備 ステップドリルビット(ステップビット)</td><td>Dewalt-Equipment</td><td></td><td>, rw-FE collection</td></tr><tr><td>滅菌ループ(コンビループ)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-363-602&nbsp;</td><td>培養の準備</td></tr><tr><td>電話線(内部線)</td><td>-</td><td>-</td><td>ブルーベリーrw-FEコレクション</td></tr><tr><td>試験管バスケット&nbsp;</td><td>VWR</td><td>470137-792</td><td>プラスチックメッシュ[イチゴ]バスケットの代替品&nbsp;</td></tr><tr><td>V8ジュース</td><td>キャンベルのスープ会社</td><td>-</td><td>菌類メディアコンポーネント</td></tr><tr><td>ビンテージプラスチックメッシュ[イチゴ]バスケット寄付</td><td></td><td>パス</td><td>-FEコレクションは、試験管バスケット(470137-792)</td></tr><tr><td>ボルテックスジーニー(ボルテックス)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-812</td>胞<td>子懸濁液調製</td></tr><tr><td>Whatman第1号定性的55ミリメートルサークル</td><td></td>Whatman1001-055 <td></td><td>真空フィルター部品</td></tr><tr><td>ホワイトプラスチックツイストタイ (100 mm)</td><td>Uline</td><td>S-566W</td><td>クランベリー rw-FE コレクション</td></tr></tbody></table>

うり fioriniae水やクロロホルム ベースのブルーベリーとクランベリーの花エキスの開発

Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts

開花期間のフェノロジーと病原体の腐敗菌の子実における花の化学的手がかりのダイナミクスを正確に監視、花抽出方法や coverslip 生物検定うり fioriniaeを活用しました。ブルーベリーとクランベリー、開花期間中に感染症の初期の段階での役割の花演劇のため殺菌剤を適用することによって、この病原体を最適制御します。ここで詳細なプロトコル記述方法花抽出物 (FE) 後で対応するガラス coverslip の生物検定で使用水・ クロロホルム ・ フィールド雨水ベースの方法を使用して得られました。情報の異なるセットを提供するために提供しています各 FE: C. fioriniaeの動員の花の化学物質に対する応答キュー (水性)、水の花と果実表面ワックス (クロロホルム ベース)、フィールド ベースの監視の病原体応答生体外で観察を農業の設定に移動、花の雨水を収集しました。FE は広く記述としてどちらか水またはクロロホルム-ベース、これらの 2 つの材料の固有の違いを補うために記載されている適切な生物検定で。花を実行していた雨水は、柔軟性と他の作物のシステムのこのアプローチの適用をほのめかし各作物にユニークなデバイスで収集されました。生物検定は素早く、安価な簡単なさまざまなソースから促進花の化合物の存在に関する時空間およびサイト固有情報を生成する機能を提供しています。この情報最終的により良い通知されます疾患マネジメント戦略、FE は感染症が発生するために必要な時間を短縮、生育期にわたる病原体感染のリスクを変更するのに洞察力を提供します。

ここに示す結果は、この方法論を使用して実行することができます多くの試金のほんの一例です。図 1は水に基づく FE バイオアッセイに図鑑と FE のクロロホルムに基づくバイオアッセイへ図 2によって補われます。図 3は、両方の水・ クロロホルム ・ ベース生物検定 (に比べ SDW コントロール) で 24 h で、 c. fioriniaeの微視的評価に期待される視覚的なガイドを提供します。図 4詳細はクランベリーのさまざまな 'スティーブンス' ch-FE, 存在下でc. fioriniaeと 24 h 時間コース研究と本研究のインポート結果を視覚的に参照を与える: 鉄減少感染構造を形成するために必要な時間SDW と比較。図 5は、coverslip バイオアッセイ クランベリー花雨水 (CB「花」rw-FE) から収集されたデータの例を示します。図 6は、もう一つの重要な結果を表します: 花卵巣 ch FE だったフルーツ ch-鉄のライフ サイクルにおけるブルームの重要性を示すよりもはるかに刺激c. fioriniae.補足写真やムービーは、抽出・可視化、アクティブ・パッシブの抽出 (映画に加えて花雨水コレクション デバイス/展開、花の重要なビジュアルを提供します。水ベースの) プロセス。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig1.jpg"> 図 1: 花を水ベースの概要を抽出 (FE) バイオアッセイ。この試金はブルーベリーとクランベリーの花と花のエキスを水ベースのため利用された:アクティブ -花抽出 (アクティブ-FE)、受動的で花抽出 (渡す-FE) と花の雨水流出の特性 (rw FE)。-鉄の部分は通常実験/変数の因子を構成します。逆に FE の部分は定数に残ることができるし、時間のポイント/時間後接種を評価できます。好みは、200 倍の倍率で 4 のフィールド分析に向けて行われています。略語: 無菌純水、SDW;A. ビューのフィールド面積<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig2.jpg"> 図 2: 花をクロロホルム ベースの概要を抽出 (ch FE) バイオアッセイ。この試金は、ブルーベリーとクランベリー (花、卵巣、フルーツ) の両方に利用されました。水溶液処理混合物の 1 つだけの種類は、この試金、(ch FE 蒸発により一貫性のある胞子濃度を保つため) に 2 つの部分 SDW に 1 部分の胞子懸濁液で使用されました。このアッセイは、複数 ch FE (様々 な植物の表面からワックス)、または単一 ch FE を使用して複数の時間ポイント/時間後接種を比較する使用できます。略語: 無菌純水、SDW;ヴァン ・黒かび病菌 [ガラス] セル、バント。セルです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig3.jpg"> 図 3:うり fioriniae水ベースの FE と ch 鉄存在下での視覚的な比較します。このアッセイ ブルーベリー 'ブルーク ロップ' (アクティブ-FE, 水ベース) (真菌の分離: BB #10) とクランベリー 'スティーブンス' クロロホルム ベース (ch-FE) (真菌の分離: CB PMAP182) 花エキス SDW コントロールと比較しました。SDWアクティブ(コントロール) (A)の存在下で胞子を比較制御するセカンダリ (リング) および付着器形成 (矢印) の劇的な増加が観察された-24 h 後接種で FE (B) 。ただし、セカンダリ 3量明らかにされなかった、ch FE (D); にクロロホルムのバイオアッセイ SDW コントロール(C)を比較するときむしろ、 C. fioriniae成長は付着器形成へシフト。水性抽出の種類ごとに共通の応答が示すように、クロロホルム ベースのホスト/花の種に関係なく記述されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig4.jpg"> 図 4: Ch 鉄存在下でうり fioriniaeと経時的研究 (24 h).このアッセイで、SDW コントロール(A ~ D)とクランベリー 'スティーブンス' ch FE (E ・ F)が 0、6、12、24 h 後接種 (複数の FE を比較する代わりに可変タイム ポイントの例) で視覚的に検査された.付着器形成 (矢印) は ch FE で 6 h から始まり、それ以降の時点で着実に増加します。この結果は、開花期間中に病原体の生物学の重要な要因に見逃されている: 花が感染構造を形成するために必要な時間を短縮します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig5.jpg"> 図 5: 生物検定で rw FE を使って収集したデータのグラフィカル表示します。雨水のクランベリーの花 (CB「花」rw-FE) 逃げると単一のぬれイベントに加えて、標準的なアクティブ、クランベリー水ベース花エキス (CBアクティブからクランベリー植物ティッシュ (「グランド」rw-FE) を触れていなかった処女の雨水-FE) (肯定的な制御) SDW (マイナス コントロール) された coverslip の水性生物検定を受けるし、 c. fioriniae成長のための評価。CB「花」rw FE の方が、標準 CB としてアクティブなセカンダリ制御と付着器形成の同じレベル-コレクション デバイス キャプチャ中にリリースされた花の覚醒剤に効果的であったことを示す、予防接種 24 時間後で鉄、濡れイベントです。合計分生胞子は、新しく形成された二次胞子、分生子 (堆積) プライマリで構成されます。文字を示すフィッシャーの最小有意差によるとp &lt; 0.05 で有意差テスト (LSD);大文字、合計分生子;小文字、付着器。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig6.jpg"> 図 6: 基づくクランベリーのフェノロジー ch FE バイオアッセイ、目視検査します。腐朽菌は多くの場合フルーツの疾患管理にはブルーム時間殺菌剤アプリケーションが含まれます。ここでは、クランベリー ('・ スティーブンス') の複数の成長段階からクランベリー クロロホルム ベース抽出 (ch FE) は、24 h 後接種でc. fioriniaeの表面ワックスの効果を視覚的に行った。卵巣が 6 月(A)、7 月と 8 月に収集された未熟なフルーツの収集(B, C)、 (D)、10 月に収穫した果実を収集し、SDW コントロール(E)は付着器形成 (矢印) の検査されました。卵巣 ch-FE は、この植物のフェノロジー (ブルーム) がC. fioriniae のライフ サイクルはとても重要であることを示す付着器形成の最大の大きさを持っていた。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig1.jpg"> 補足図 1: ブルーベリー花序。ブルーベリーの花は、(表示 'ブルーク ロップ') 満開 (ニュージャージー州、アメリカ合衆国では 4 月-5 月) 中に抽出用に収集されました。補足図 2 (直立したクランベリー) に比べて花序の全体的なアーキテクチャと隣接する花からカローラ/卵巣の重複に注意してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig2.jpg"> 補足図 2: クランベリー直立します。クランベリーの花は、(表示 'スティーブンス') 満開 (ニュージャージー、米国では 6 月-7 月) 中に抽出用に収集されました。(アップライト)、単一のクランベリー花房と、フックに様々 な花の段階、花冠の形を保持する水滴に注意してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig3.jpg"> 補足図 3: ブルーベリー雨水展開 (花).ブルーベリー花雨水回収装置、花房のクラスターの直下に設置を完了しました。デバイスを縦向きに使用される合成樹脂被覆線に注意してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Supplemental Figure 4" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig4.jpg"> 補足図 4: ブルーベリー雨水展開 (幹).完成したブルーベリー花雨水回収装置、花序とブッシュの王冠の間幹下半分の方法を置いた。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Supplemental Figure 5" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig5.jpg"> 補足図 5: ブルーベリー雨水展開 (クラウン).ブルーベリー花雨水回収装置、ブッシュ (クラウン) の基地で配置を完了しました。注プラスチック被覆電線は必要に応じて削除できます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Supplemental Figure 6" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig6.jpg"> 補足図 6: ブルーベリー雨水展開 (地面).処女雨水回収装置、ブルーベリー薮に隣接して配置を完了します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Supplemental Figure 7" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig7.jpg"> 補足図 7: クランベリー雨水展開 (接写).ちゃんと交差したワイヤーつながりの下に隠れて 2 つのアップライトとクランベリーの花雨水収集装置を完成しました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Supplemental Figure 8" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig8.jpg"> 補足図 8: クランベリー雨水展開します。複数は、クランベリーの花雨水デバイス沼地に展開を完了しました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Supplemental Movie 1" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie1.jpg"> 補足映画 1: アクティブ、水ベースの花エキス (アクティブ -FE).手順 2.3 2.5.1 補足ビデオをサポートします。ブルーベリー 'ブルーク ロップ' 花が使用されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/active-FEextraction.mp4" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
<img alt="Supplemental Movie 2" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie2.jpg"> 補足映画 2:パッシブ、水ベースの花エキス (渡す-FE).3.3 3.4、補足のビデオ サポート次を手順します。ブルーベリー 'ブルーク ロップ' 花が使用されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/pass-FEextraction.mp4" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>
<img alt="Supplemental Movie 3" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie3.jpg"> 補足映画 3: クランベリーの花雨水収集装置の展開。6.4 と補足のビデオ サポートの次をステップします。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/rw-FEdeployment.mp4" target="_blank">してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)</a>

ここでは、真菌病原体、炭疽病菌 fioriniae、ガラス coverslips にブルーベリーやクランベリーの花の抽出物の存在下での開発を監視するために設計された生物検定を説明します。水、クロロホルム、およびフィールド雨水-を用いた技術はこの情報を適用する方法への洞察力だけでなく、詳細な花の抽出。

To accurately monitor the phenology of the bloom period and the temporal dynamics of floral chemical cues on fungal fruit rotting pathogens, floral ...

このプロトコルは、用語ブルームに感染するコレトリクムフィオルニアおよび他の植物病原体のフッ素化学的手掛かりの時間的ダイナミクスを評価するための安価で適応可能なシステムを提供する。新しい床雨水収集装置は、ユーザーが自然な覚醒剤と病原体の発達に影響を与える条件をほぼリアルタイムのサイト固有の方法で監視することを可能にする。テキストプロトコルに記載されているように、自然に感染した宿主からのColletotrichum fiorniaeの培養からこの手順を開始します。コロニーが胞状になり始めると、細胞培養皿を含む別のV 8ジュース寒天にコニディアの筋が高密度の胞子培養を生み出す。7日間の成長の後、標準的な滅菌ループを使用して、ループを軽く円錐質量に軽く触れることによって、高密度培養から少量のコニディアを収集する。これを10ミリリットルの無菌脱イオン水を含む15ミリリットルの遠心分離管にかき混ぜます。このサンプルの渦は10秒間です。標準的なピペットを使用して、さらにサンプルを混合するために何度も上下に突っ込みます。次に、渦液サンプルをヘモサイトメーターに一滴置き、胞体濃度を推定します。5ミリリットルの最終体積で無菌蒸留水のミリリットル当たり0.1百万コニディアに濃度を調整します。これは胞毛懸濁液と呼ばれ、どちらのバイオアッセイでも使用する直前に行われます。クロロホルムベースの花抽出を行うために、95%エタノールですべての成分を2回洗浄してください。その後、各抽出のための汚染を防ぐためにクロロホルムで成分を2回洗浄します。PTFEの並んだキャップはクロロホルムで破損するので清掃しないでください。クリーニング後、コンポーネントを逆さまに乾燥させます。1つの部分加工花をビーカーのクロロホルムの9つの部分に組み合わせて、花を加え、クロロホルムを加えます。30秒間静かに旋回し、ステンレス製のスクリーンを通して2番目のビーカーにひずみます。2番目のビーカーからクロロホルムベースのエキスをガラス培養チューブに注ぎ、PTFEキャップを貼り付けます。キャップをパラフィルムで包み、蒸発を防ぎます。得られたクロロホルムベースの花エキスを暗闇の中に保管し、実験的使用まで摂氏4度で光の劣化を減らします。反復を提供するために、複数のサンプルで抽出を繰り返します。選択した場所ごとに収集装置を作成するには、ドリルプレスに取り付けられたステップビットを使用して、スプレーカップの下部に穴を開けます。その後、穴の上からスプレーカップの口まで直線を切ります。今度はスプレーカップの口にプラスチックコーティングされたワイヤーを通すのに十分な大きさの4つの等遠い穴を開けます。プラスチック製の塗装されたワイヤの一端を取り付け、一端を自由に残します。ペイントスプレーまたはカップアダプタを50ミリリットルの遠心分離キャップ蓋に通すのに十分な大きさの穴を開けます。漏れを防ぐために、アダプタースレッドをパラフィルムで密封します。これを噴霧器カップの遠心キャップとねじ部分の両方に取り付けます。次に、合致した50ミリメートルの遠心管を取り付けます。サンプリング場所ごとに 4 つの収集デバイスを作成します。ステムにフィットするように噴霧器のコップを曲げることによって選択された場所で装置を展開する。他の茎に取り付けられたプラスチック製の被覆線を使用して、スプレーカップのカット側を上向きにします。これは花の上を通過する水が捕獲されることを保障する。クランベリーの花から雨水を集めるために、最初の熱は金属プローブを使用して漏斗の口の周りに8つの等距離の穴を穿刺します。4 つの穴にツイスト タイを挿入します。その穴の反対側の位置にもう一方の端を取り付けて、きちんとした交差パターンを形成します。漏斗をパラフィルムで蒸気で包み、脇に置きます。漏斗の茎をステップビットで50ミリリットルの遠心分離機キャップに挿入するのに十分な大きさの穴をドリルダウンします。準備した漏斗を遠心分離キャップに挿入します。降雨または頭上の灌漑の後、遠心分離管の底管部分を取り外して交換してください。雨水回収管は、細菌や他の真菌などの流出で動員された天然汚染物質による分解を起こしやすいので、湿潤イベントの後にすぐに交換する必要があります。培養皿の中に紙のディスクの2つの層を配置し、滅菌蒸留水の2ミリリットルで浸します。次に、2つのミリリットルマイクロ遠心分離管に無菌蒸留水と水ベースの花エキスの等しい量を混ぜます。次に、準備した2つのミリリットルマイクロ遠心分離管に胞胞体懸濁液の等量を加える。得られた調製物を水性処理混合物と呼ぶ。コントロールのために、花エキス部分を省略し、一貫性のある経度濃度を維持するために滅菌蒸留水に置き換えます。今、細胞培養皿内の浸したペーパータオルの上に事前に洗浄されたガラスのカバーリップを置きます。40マイクロリットルの水性処理混合物をカバースリップの中央に置きます。コントロールを含む所望の治療のためにこれを繰り返します。次に、細胞培養皿を閉じます。すべての治療と複製が分配されたら、すべての複製された細胞培養皿を密閉されたプラスチック容器に入れ、暗闇の中で摂氏25度でインキュベートします。事前に決定された時点で、液滴に固定液の10マイクロリットルを加え、成長を止め、マウントを半保存します。固定剤を加えたら、慎重にカバースリップをガラス顕微鏡スライド上の液滴側に置き、顕微鏡検査を容易にします。すべてのカバーリップがガラス顕微鏡スライド上にある場合は、フローフードで20分間落ち着き、部分的に乾燥させます。一次コニディア、発芽したコニディア、新たに形成された二次コニディア、ならびにアプレッサリアを含むカバースリップに存在するすべてのコニディアを数える。400倍の倍率または200倍の面積3.808平方ミリメートルのいずれかで動作します。層流フードに、2ミリリットルマイクロ遠心チューブに2つの等量の無菌蒸留水と1ボリュームの胞毛懸濁液を加えます。クロロホルムベースの花エキスバイオアッセイのために、この水性処理混合物を脇に置きます。ヒュームフードで、準備されたプラスチック細胞培養皿の中のガラスカバースリップにヴァンTセルを置きます。所望のクロロホルムベースの花エキスの33マイクロリットルを細胞の中央に分配し、乾燥させます。セルの壁に触れないでください。コントロール治療のために、バージンクロロホルムを追加します。クロロホルムベースの花エキスが乾燥したら、調製した水処理混合物の99マイクロリットルを標準ピペットを含む99マイクロリットルをVan T Cellの中央に分配します。その後、すべての細胞培養皿を閉じて、インキュベートします。事前に決定された時点で、Van T Cellに固定剤の15マイクロリットルを加え、適切な真菌染色を確実にするために少なくとも5分間座らせます。その後、慎重にヴァンTセルを取り外します。以前と同様に、カバースリップ反転とデータ取得手順を実行します。接種後24時間でC.fiorniaeを顕微鏡で評価すると、滅菌蒸留水と水系花エキスの存在下でのコニディアの比較は、二次連結およびアププレソリウム形成の劇的な増加を明らかにする。しかし、二次結数は、クロロホルム系抽出物と滅菌蒸留水の制御を比較する際に、それほど明白ではなかった。むしろ、C.フィオルニアの成長はアポペリック形成にシフトした。このアッセイでは、無菌蒸留水のコントロールとクランベリークロロホルムベースの花抽出を、接種後0時間、6時間、12時間、24時間で視覚的に検査した。アプレソリウムの形成は、クロロホルムベースの花エキスで6時間で始まり、その後のタイムポイントを通じて着実に増加した。この結果は、花が感染構造を形成するために必要な時間を短縮するという発見を支持する。果実腐敗菌の疾患管理は、多くの場合、ブルームタイム殺菌剤の適用を伴う。ここで、クランベリーの複数増殖段階からのクランベリークロロホルムベースの抽出物は、接種後24時間でC.fiorniae上の有効表面ワックスについて目視評価した。6月に採取した卵巣、7月に採取した未熟果実、8月には10月に採取した果実を収穫し、無菌蒸留水のコントロールを経て、無菌蒸留水の制御を行い、アペソリン性形成について検査を行った。卵巣クロロホルムベースの抽出物は、C.fiorniaeのライフサイクルにおける花の重要性を示すアポプレッサ形成の最大の大きさを有していた。病原体はこのプロトコルの最も重要な構成要素である。試験間の一貫性を保つために、真菌を日常的に新鮮な培地に移す必要があります。クロロホルムを使用する作業は、安全上の理由からヒュームフードで行う必要があります。これには、材料およびガラス製品の調製、抽出手順、クロロホルムベースのバイオアッセイの伝導が含まれます。ポイント、病原体、花の雨水コレクション、または宿主抽出の組み合わせは、様々な宿主病原体相互作用を評価するために利用することができる。雨水収集装置および関連するバイオアッセイは多数のパスシステムの雨のイベントの間に動員される宿主の覚醒剤と働くことを可能にする。

colletotrichum-fioriniae-development-water-chloroform-based-blueberry

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JoVE Journal

Environment

環境

植物の揮発性物質を収集するためのプッシュプルの方法が記載されている。方法は、草食動物の摂食、外因性のジャスモン酸メチル、及び機械的損傷によって誘導される揮発性成分の比較ができます。この手法はまた、ブルーベリー、植物内の草食動物で痛んだ枝から揮発成分への曝露に無傷の枝の揮発性の応答を調査するために使用されます。...

草食動物によって誘導されたブルーベリー揮発性物質とイントラ植物のシグナリング

方法は、植物抽出物の薄層クロマトグラフ（TLC）分離および抗菌性代謝物を同定するためのコンタクトバイオオートグラフィーのために記載されている。方法は、ウシ第一胃にネイティブ過剰のアンモニア産生菌（HAB）を阻害レッドクローバーフェノール化合物のスクリーニングに適用される。...

薄層クロマトグラフィー（TLC）分離および植物抽出物のバイオアッセイは、抗菌化合物を同定するために

ここでは、近赤外分光法による個々のブルーベリーの総糖分、全有機酸、および総アントシアニン含有量の非破壊予測のためのモデルを構築し検証するためのプロトコルを提示します。...

HPLC測定に基づいて近赤外分光法によるブルーベリーにおける成分含量の非破壊予測のためのモデルの構築

この作品は、凍結乾燥したベリーパウダーからポリフェノールが豊富な抽出物を調製するための段階的な方法を詳述しています。さらに、血管平滑筋細胞（VSMCs）を用いたペプチドホルモンアンギオテンシンII（Ang II）の存在下で、これらのポリフェノールに富む抽出物を細胞培養においてどのように使用するかについての完全な記述を提供する。...

血管平滑筋細胞の処理のための凍結乾燥ベリー粉末からのポリフェノールの抽出および精製<em&gt;インビトロ</em

ヘッドスペース固相マイクロ抽出 - ガスクロマトグラフィープラットフォームは、熟したブラックカラント果実の迅速で信頼性の高い半自動揮発性同定と定量を目的として説明します。この技術は、果実の香りに関する知識を高め、繁殖を目的として強化された風味を有する品種を選択するために使用することができる。...

ヘッドスペース固相微小抽出を用いたブラックカラントフルーツの揮発性化合物のガスクロマトグラフィー-質量分析法のプロファイリング

ここでは、蛍光タンパク質の安定性を維持しつつ植物組織を透明にする方法について説明する。この技術は、物理的な切片化なしに、クリアされた植物組織の深いイメージングを容易にする。...

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本稿では、植物関連内生菌の単離、分離株の長期保存、形態学的特性評価、およびその後の分子同定およびメタゲノム解析のための総DNA抽出のための詳細かつ適切なプロトコルを提供することを目的としています。...

菌従属栄養植物における内生菌を同定するための単離、特性評価、および全DNA抽出

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ポリオールベース技術を用いた化粧品用途向けのフェノール化合物および酸化防止剤のマイクロ波支援抽出

寒天を含むガラス容器で改変された分離葉法を使用してチリアザミウマを大量に飼育するための分離葉バイオアッセイプロトコルが確立され、高い生存率と同期した発生が保証されました。このシステムは、2齢 幼虫に対する昆虫病原性真菌の病原性の効率的なスクリーニングを可能にし、実験室、温室、および野外評価のための信頼性の高いアザミウマの供給を提供します。...

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学ぶColletotrichum fioriniaeの発育モニタリング法。ブルーベリーとクランベリーの花エキスを用いた水やクロロホルムベースの抽出技術で、植物病原菌の動態をリアルタイムに評価する実験手法を解説します。

うり fioriniae水やクロロホルムベースのブルーベリーとクランベリーの花エキスの開発

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